全 文 : 文章编号:0427-7104(2011)05-0611-08
收稿日期:2011-05-04
基金项目:上海市科学委员会西部开发资助项目(09495802200)
作者简介:苏 倩(1985—),硕士研究生;穆 青,教授,通讯联系人,E-mail:muqing2200@gmail.com.
不同产区新疆雪莲脂溶性成分的GC-MS分析及
生物活性初探
苏 倩1,张翼轸2,王新宇3,刘 涛1,穆 青1
(1.复旦大学 药学院,上海201203;2.合肥工业大学 生物与食品工程学院,合肥230001;
3.新疆天山莲药业有限公司,乌鲁木齐830000)
摘 要:采用GC-MS技术对4个不同产区新疆雪莲的脂溶性成分进行分析.氯仿超声提取各产区药材,使用
GC-MS分析鉴定出新疆雪莲脂溶性的主要成分,并对不同产区的结果进行比较.共检出56种成分,主要为不饱
和脂肪族类、饱和脂肪族类、倍半萜类、甾体和三萜类化合物.其中相对含量较高的成分为棕榈酸,二十二碳六烯
酸甲酯,巴西菊内酯,亚油酸,α-亚麻酸等;不同产区的脂溶性成分中个别成分的相对含量差别很大.二十二碳六
烯酸甲酯、巴西菊内酯、亚油酸和α-亚麻酸均为首次在该植物脂溶性成分中发现.用雪莲脂溶性成分对耐药金黄
色葡萄球菌进行了抗菌实验,雪莲样品未表现出明显的抗菌效果.在清除自由基实验中,雪莲脂溶性成分表现出
一定的清除DPPH自由基的活性.
关键词:新疆雪莲;GC-MS;脂溶性成分;抗菌;清除自由基
中图分类号:R 284.1 文献标志码:A
新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)又名天山雪莲、雪荷花等,为我国珍稀名贵中药材.《本
草纲目拾遗》中[1]对它的药效描述为:性大热,补阴益阳,治一切寒症.《中国药典》2010年版中说明[2]该药
材具有补肾活血,强筋骨,营养神经等功效,用于治疗风湿性关节炎、关节疼痛等症状.新疆雪莲含有黄酮
类、生物碱、内酯、甾醇、多糖及挥发油等多种成分[3-16],现代临床和药理学研究表明,它在护肤保健、防治
心血管疾病、治疗风湿病、延缓衰老、抗癌等方面发挥重要作用[17].在新疆地区分布广泛[18],不同产区雪
莲药材的化学成分存在一定差异,其中对不同产区脂溶性成分的研究还未见报道.本实验采用GC-MS技
术对新疆伊犁、伊吾、和静、后峡4个产区的新疆雪莲脂溶性成分进行分析,并测试了脂溶性成分的抗菌和
抗氧化作用,为新疆雪莲的开发利用提供科学参考.
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器与分析条件
仪器:超声发生器SY2200-T(上海声源超声波仪器设备有限公司),恒温培养箱(上海精宏实验设备
有限公司),手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂),HITACHI U-2900紫外分光光度计,
Thermo Focus DSQ仪器.
GC-MS分析条件:HP-5ms柱(30m×0.25mm×0.25μm),最初温度60℃,平衡2min,以20℃/min
的速度升至300℃,平衡15min.载气为99.999%高纯氮,分流比为15∶1,进样量为1μL,扫描范围为41~
450amu,EI源,离子源温度为250℃,气化室温度为250℃,连接口温度为250℃.
1.1.2 材料与试剂
氯仿、二甲基亚砜(DMSO)、无水乙醇均为国产分析纯.1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH;Sigma公司),
维生素C(国药集团化学试剂有限公司),维生素E(Sigma公司).
第50卷 第5期
2011年10月
复 旦 学 报 (自然科学版)
Journal of Fudan University(Natural Science)
Vol.50No.5
Oct.2011
DOI:10.15943/j.cnki.fdxb-jns.2011.05.008
实验菌株ATCC 25923为普通金黄色葡萄球菌[19],SA1199B为过度表达NorA多药耐药外泵蛋白
的金黄色葡萄球菌,所述NorA蛋白为金黄色葡萄球菌的主要外泵蛋白[20].菌株XU212为含有TetK四
环素外泵蛋白的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌.菌株RN4220为具有 MsrA大环内酯类外泵蛋白的金黄色
葡萄球菌[21].菌株 EMRSA-15和 EMRSA-16为具有 mecA 基因蛋白的常见耐甲氧西林金黄色葡萄
球菌[22-23].
对照抗菌药物诺氟沙星(Norfloxacin),青霉素(Penicilin),四环素(Tetracycline)购买于Sigma公司.
营养肉汤(上海疾控华康科技开发公司),琼脂粉(国药集团化学试剂有限公司).二甲基噻唑二苯基四
唑溴蓝(MTT;Sigma公司).
药材于2010年4月分别采集自新疆自治区伊犁、伊吾、和静以及后峡4个地区,经新疆中药民族药物
研究所李晓瑾研究员鉴定为新疆雪莲.凭证标本保存于复旦大学药学院天然药物化学实验室.
1.2 方法
1.2.1 样品的制备
新疆雪莲每个产区的干燥后全草(地上部分)粉碎后各取5g,加入200mL氯仿浸泡过夜,超声萃取
40min,减压浓缩,所得浸膏均为深绿色具有特殊香味的油状物质.每个产区样品平行制备3份,计算平均
得率.从4个产区的浸膏中取适量进行GC-MS分析.
1.2.2 抗菌活性实验
将6种供试菌株接种于营养肉汤琼脂培养基中,37℃下培养24h,将培养后的6种细菌分别加入液
体培养基中,通过显微计数配制成浓度为5×105 cfu/mL的菌悬液.
向96孔板每孔中依次加入营养肉汤培养基.
对照药品诺氟沙星、青霉素和四环素以及4个产区的新疆雪莲脂溶性成分样品用DMSO溶解后加入
96孔板内,第1到第10孔配制成浓度梯度为128,64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25μg/mL.第11孔为阳性
对照,第12孔为阴性对照.
加入菌悬液,放入恒温培养箱中37℃下培养18h.
18h后,每孔逐一加入浓度为5mg/mL的 MTT溶液(PBS缓冲液溶解),20min后观察结果,无蓝色
沉淀的最小浓度即为该样品对于供试细菌的最小抑菌浓度(MIC).
1.2.3 1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)清除实验
采用比色法考察4个产区的新疆雪莲脂溶性成分对 DPPH的清除率来探讨脂溶性成分的抗氧
化活性.DPPH(1,1-二苯基苦基苯肼)是一种稳定的自由基,其无水乙醇溶液(显深紫色)在517nm
处有最大吸收峰,当DPPH溶液中加入自由基清除剂时,与其单电子配对从而使其吸收逐渐消失,
其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系,因而可以用比色法进行定量分析来评价样品的抗氧化
能力.
取20mg DPPH用无水乙醇定容至250mL配成2.0×10-4 mol/L的DPPH溶液,避光保存.
将4个产区脂溶性成分样品和维生素E对照品用无水乙醇配制成7个浓度的样品,分别取2mL加入到
2mL DPPH乙醇溶液和2mL无水乙醇中测定吸光度值Aλ1和Aλ2,摇匀.此外,将1份2mL DPPH乙醇溶液
加入2mL无水乙醇,摇匀,作为空白对照测定Aλ0.以上样品在室温,避光放置30min后,在517nm处测定吸光
度,平行操作3次,计算清除率(η清除为DPPH清除率,%).
η清除 (= 1-Aλ1-Aλ2Aλ )0 ×100%.
2 结果与讨论
2.1 结果
2.1.1 挥发油成分分析
4个产区脂溶性成分的平均得率分别为3.29%,4.03%,4.02%,4.24%.对4个产区的新疆雪莲脂
溶性成分进行GC-MS分析,各产区样品的总离子流图谱见图1(见第614页).经过质谱计算机数据检索
216 复 旦 学 报(自然科学版) 第50卷
系统对各色谱峰加以确认,采用峰面积归一化法对各色谱峰进行百分含量的测定.共鉴定出56种成分,结
果见表1.从表1可以看出,棕榈酸(n-hexadecanoic acid),(3,5,6,7,8,8a-六氢-4,8a-二甲基-1-6-(1-甲基
乙烯基)-2(1H)萘酮),亚油酸,α-亚麻酸,二十九烷,三十一烷,谷甾醇和α-香树精的含量在4个产区样品
中的含量均较高,但各个成分的相对含量存在差别.
316 第5期 苏 倩等:不同产区新疆雪莲脂溶性成分的GC-MS分析及生物活性初探
图1 4个产区新疆雪莲脂溶性成分的总离子流图谱
Fig.1 The total ion chromatogram of hydrophobic constituents of S.involucratafrom 4habitats
对表1中的化学成分分析总结,雪莲脂溶性成分主要为倍半萜类、不饱和脂肪族类、饱和脂肪族类、甾体类
和三萜类化合物.它们在4个产区中的含量差别见表2所示,伊犁产区与其他产区相比脂肪族类化合物相
对含量较高(66.35%),倍半萜类相对含量较少(9.35%).此外,伊吾与和静产区中的不饱和脂肪族相对含
量大于饱和脂肪族类,伊犁和后峡产区结果相反.
表1 4个产区新疆雪莲脂溶性成分对比
Tab.1 Comparation of hydrophobic constituents of S.involucratafrom 4habitats
序号 tR/min 化合物名称
化合物
类别1)
w/%
伊犁 伊吾 和静 后峡
1 5.01 2-Heptenal,(Z)-(2-庚烯醛) 1 0.30 0.19 — —
2 6.31 2-Nonenal,(E)-(2-壬烯醛) 1 0.03 — — 0.04
3 6.96 Octanoic acid(辛酸) 2 0.15 0.05 — —
4 7.68 2-Decenal,(E)-(2-癸烯醛) 1 0.23 0.16 0.10 0.15
5 7.9
7-Methylene-9-oxabicyclo[6.1.0]non-2-ene(7-亚甲基-9-双环氧
辛烷[6.1.0]-2-烯)
5 0.06 0.02 — 0.03
6 7.93 2,4-Decadienal,(E,E)-((E,E)-2,4-癸二烯醛) 1 0.32 0.22 0.16 0.23
7 8.11 2,4-Decadienal,(E,E)-((E,E)-2,4-癸二烯醛) 1 0.27 0.13 — 0.13
8 8.41 2-Undecenal(十一碳烯醛) 1 0.09 0.09 0.04 —
9 9 Pentadecane,2,6,10,14-tetramethyl-(降植烷) 2 0.15 0.06 0.08 0.08
10 9.22 1-Pentadecene(1-十五碳烯) 1 0.82 0.66 0.78 0.34
11 9.4 Eudesma-4(14),11-diene(4(14),11-桉叶二烯) 3 — — 0.36 1.79
12 9.67 Dodecanoic acid(月桂酸) 2 0.20 0.45 0.16 1.24
13 10.08
1H-Cycloprop[e]-4-ol,decahydro-1,1,4,7-tetramethyl-,[1ar-
(1aα,4β,4aβ,7α,7aβ,7bα)]-(蓝桉醇)
3 0.19 — 0.03 —
14 10.31 9,17-Octadecadienal,(Z)-((Z)-9,17-十八碳二烯醛) 1 1.81 0.91 0.93 0.35
15 10.59 5,8,11-Heptadecatrien-1-ol 1 0.31 0.06 — 0.12
16 10.83 Tetradecanoic acid(肉豆蔻酸) 2 0.19 0.16 0.12 0.20
17 10.87 (1,5,5,8-Tetramethyl-bicyclo[4.2.1]non-9-yl)-acetic acid 1 0.44 0.08 — 0.12
18 11.22
3,7,11,15-Tetramethyl-2-hexadecen-1-ol(3,7,11,15-四甲基-2-
十六碳烯-1-醇)
1 4.23 1.16 0.70 0.70
19 11.26
2-Pentadecanone,6,10,14-trimethyl-(6,10,14-三甲基-十五烷-
2-酮植酮)
2 0.53 0.27 0.26 0.29
416 复 旦 学 报(自然科学版) 第50卷
(续表)
序号 tR/min 化合物名称
化合物
类别1)
w/%
伊犁 伊吾 和静 后峡
20 11.35
3,7,11,15-Tetramethyl-2-hexadecen-1-ol(3,7,11,15-四甲基-2-
十六碳烯-1-醇)
1 0.72 0.17 — 0.15
21 11.45
3,7,11,15-Tetramethyl-2-hexadecen-1-ol(3,7,11,15-四甲基-2-
十六碳烯-1-醇)
1 1.20 0.31 0.18 0.24
22 11.63
6-(1-Hydroxymethylvinyl)-4,8a-dimethyl-3,5,6,7,8,8a-
hexahydro-1H-naphthalen-2-one(3,5,6,7,8,8a-六氢-4,8a-二甲
基-1-6-(1-甲基乙烯基)-2(1H)萘酮)
3 8.69 1.66 1.90 3.99
23 11.68 8-Hexadecenal,14-methyl-,(Z)-(14-甲基-8-十六碳烯醛) 1 1.38 0.40 0.48 0.56
24 11.93 n-Hexadecanoic acid(棕榈酸) 2 12.04 10.44 8.03 12.29
25 12.01
4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid,methyl ester,(al-Z)-
(二十二碳六烯酸甲酯) 1
— 8.65 14.86 6.38
26 12.29
Azuleno[4,5-b]furan-2(3H)-one,3a,4,6a,7,8,9,9a,9b-
octahydro-6-methyl-3,9-bis(methylene)-,[3aS-(3aα,6aα,9aα,
9bβ)]-(巴西菊内酯)
3 — 20.94 18.93 6.38
27 12.38 Heptadecanoic acid(十七酸) 2 0.34 0.19 — 0.20
28 12.53
Azuleno[4,5-b]furan-2,9-dione,9a-[(acetyloxy)methyl]
decahydro-6-methyl-3 methylene-,[3aS-(3aα,6β,6aα,9aβ,
9bα)]-(巴西菊内酯)
3 0.52 0.52 0.48 0.76
29 12.57 2-Acetoxy-1,1,10-trimethyl-6,9-epidioxydecalin 3 0.37 0.12 0.11 0.34
30 12.65 Phytol(植醇) 1 0.69 0.43 0.63 0.44
31 12.77 9,12-Octadecadienoic acid(Z,Z)-(亚油酸) 1 7.20 6.21 5.42 8.10
32 12.8 9,12,15-Octadecadienoic acid(Z,Z,Z)-(α-亚麻酸) 1 5.37 4.34 2.10 2.68
33 12.87 Octadecanoic acid(硬脂酸) 2 1.06 1.25 — 2.55
34 13.07
3H-Naphtho[2,3-b]furan-2-one,4-hydroxy-4a,5-dimethyl-3-
methylene-3a,4,4a,5,6,7,9,9a-octahtdro-
3 — 4.37 2.81 3.43
35 13.25
Bicyclo[4.4.0]dec-5-ene,1,5-dimethyl-3-hydroxy-8-(1-
methylene-2-hydromethyl-1)-
3 — 2.49 2.08 —
36 13.42 Tricosane(二十三烷) 2 0.53 1.04 — 1.85
37 13.6 Patchouli alcohol(广藿香醇) 3 0.47 0.11 — —
38 13.73 Eicosanoic acid(花生酸) 2 0.18 0.21 0.33 —
39 14.25 Pentacosane(二十五烷) 2 0.50 0.55 0.51 0.94
40 14.31 1-Eicosanol(二十烷醇) 2 0.59 0.31 0.48 0.36
41 15.16 Heptacosane(二十七烷) 2 3.05 1.81 1.56 2.99
42 15.25 1-Heneicosyl formate 2 0.42 0.46 — 0.22
43 15.69 Octacosane(二十八烷) 2 0.33 0.21 0.25 0.38
44 16.32 Nonacosane(二十九烷) 2 6.50 2.98 2.41 4.01
45 16.44 1-Tetracosanol(二十四烷) 2 2.22 0.98 0.90 0.82
46 17.03 Triacontane(三十烷) 2 0.44 0.42 0.31 0.50
47 17.91 Hentriacontane(三十一烷) 2 5.14 2.02 2.69 2.96
48 18.19 7-Dehydrodiosgenin 4 2.15 0.96 0.95 1.46
49 18.75 22-Tricosenoic acid(二十二碳烯酸) 1 3.96 3.44 4.85 5.29
50 21.22 β-Sitosterol(谷甾醇) 4 9.55 3.09 5.32 7.72
51 22.25
4,4,6a,6b,8a,11,11,14b-Octamethyl-1,4,4a,5,6,6a,7,8,8a,
9,10,11,12,12a,14,14a,14b-octadecahydro-2H-picen-3-one
4 1.36 0.83 2.36 1.55
52 22.64 Stigmasta-3,5-dien-7-one(豆甾-3,5二烯-7-酮) 4 0.72 0.29 — 0.65
53 22.9 α-Amyrin(α-香树精) 4 4.70 4.42 4.52 6.03
54 23.32 Stigmast-4-en-3-one(豆甾-4-烯-3-酮) 4 1.44 1.28 2.56 2.00
55 24.24 12-Oleanen-3-yl acetate,(3α) - 4 0.71 2.02 2.23 2.75
56 24.71 Phytol(植醇) 1 3.11 2.42 2.43 2.42
1) 1.不饱和脂肪族类;2.饱和脂肪族类;3.倍半萜类;4.甾体及三萜类;5.其他类.
516 第5期 苏 倩等:不同产区新疆雪莲脂溶性成分的GC-MS分析及生物活性初探
表2 4个产区新疆雪莲脂溶性成分类别比较
Tab.2 Comparation of category on hydrophobic constituents of S.involucratafrom 4habitats
产区
w/%
不饱和脂肪族类 饱和脂肪族类 倍半萜类 甾体和三萜类 其他类
伊犁 31.79 34.56 9.35 20.63 0.06
伊吾 29.60 23.86 30.21 12.89 0.02
和静 33.03 17.78 26.7 17.94 —
后峡 28.44 31.88 16.69 22.16 0.03
2.1.2 抗菌活性
4个产区的新疆雪莲脂溶性成分的抗菌实验结果见表3,4个产区样品对RN4220有较弱的抑制效果
(MIC均为128μg/mL),对其他5种供试菌没有明显的抑制效果.
表3 新疆雪莲脂溶性成分抑制耐药金黄色葡萄球菌活性测试结果
Tab.3 The antibacterial activity results against drug resistant staphylocococus areaus by
hydrophobic constituents of S.involucratain Xinjiang μg/mL
样品 SA1199B1) Xu212 1) ATCC25943 1) RN4220 1) EMRSA15 1) EMRSA16 1)
诺氟沙星 16 64 2 2~4 >128 4~8
青霉素 64 >128 1~2 16~32 >128 128
四环素 0.25 >128 2~4 128 128 128
1 2) >128 >128 >128 128 >128 >128
2 2) >128 >128 >128 128 >128 >128
3 2) >128 >128 >128 128 >128 >128
4 2) >128 >128 >128 128 >128 >128
1)菌株;2)1~4分别代表伊犁、伊吾、和静、后峡产区的新疆雪莲脂溶性成分样品.
图2 新疆雪莲脂溶性成分和维生素E、维生素C在相同浓度下
清除DPPH的能力图
Fig.2 The ability to erase DPPH of hydrophobic constituents
of S.involucrata,vitamin E and vitamin C at the same
concentrations
2.1.3 DPPH清除能力
结果见图2,4个产区的脂溶性成分对
DPPH的清除能力略有差别,与相同浓度下的
维生素E和维生素C相比,不具有显著的清
除DPPH的能力,但其清除能力随着样品浓
度的增加而增加.质量浓度为2mg/mL的样
品,对DPPH的清除率已达到25%~45%.
2.2 讨论
伊犁样品中未检出在其他产区样品中
的多不饱和化合物二十二碳六烯酸甲酯和
倍半萜巴西菊内酯.伊吾与和静产区中的巴
西菊内酯相对含量(>18%)高于后峡产区
近3倍.其中,二十二碳六烯酸,又名DHA,
是大脑营养必不可少的高度不饱和脂肪酸,
有研究表明其在预防心血管疾病,延缓脑的
衰老,抑制肿瘤生长,抗炎,抑制过敏反应等
方面有重要作用[24];巴西菊内酯能够通过
抗氧化机制显著降低组织损伤[25],还具有
降血糖和降血脂的活性,可以用来治疗糖尿病[26].同时,4个产区样品中都含有较高的α-亚麻酸,一种被
认为具有预防心血管病,降血脂,抑制癌症发生和转移,抗炎、抑制衰老,增强智力等作用的化合物[27].而
616 复 旦 学 报(自然科学版) 第50卷
且,4个产区样品中亚油酸与α-亚麻酸的相对含量比例均小于4∶1,符合国内外的营养学规定,不会导致
人体脂类代谢不平衡.
以往对新疆雪莲的药理活性研究大多关注黄酮和总生物碱的抗炎镇痛、强心等作用和雪莲多糖的抗
氧化、抗疲劳活性[3,17,28],对于其脂溶性成分的活性研究未见报道,从以上结果可以看出,新疆雪莲脂溶性
成分对于防治心血管疾病等方面可能具有一定作用.
二十二碳六烯酸甲酯、巴西菊内酯、亚油酸和α-亚麻酸均为首次在该植物脂溶性成分中发现.
抑菌活性试验所选菌株均为耐药金黄色黄葡萄球菌(Staphylococus aureus).SA1199B是对氟喹诺
酮具有耐药性的金黄色葡萄球菌,诺氟沙星对其的最小抑制浓度为16μg/mL;Xu212菌株对四环素和甲
氧西林具有耐药性;ATCC25923为普通的金黄色葡萄球菌菌株;RN4220菌株对大环内酯类抗生素药物
具有耐药性.EMRSA-15和EMRSA-16是具有mecA基因蛋白的流行耐甲氧西林耐药菌株.新疆雪莲脂
溶性成分基本没有抗菌作用.
DPPH自由基能引起皮肤衰老,甚至能引起机体组织损伤.新疆雪莲脂溶性成分具有一定的清除
DPPH自由基的活性,可能与其含有的不饱和脂肪酸、醇及酮类物质有关.
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Analysis of Hydrophobic Constituents in Saussurea
involucratafrom Various Habitats by GC-MS and
Their Biological Activity Research
SU Qian1,ZHANG Yi-zhen2,WANG Xin-yu3,LIU Tao1,MU Qing1
(1.School of Pharmacy,Fudan University,Shanghai 201203,China;2.School of Biology and
Food engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230001,China;
3.Xinjiang Tianshanlian Pharmacutical LTD,Urumqi 830000,China)
Abstract:To analyze the chemical components of hydrophobic constituents of Saussurea involucrata from various
habitats by GC-MS.The hydrophobic constituents were extracted with chloroform by ultrasonic treatment and the
relative content of chemical components was identified by GC-MS method.56components were identified among
hydrophobic constituents from four different habitats and mainly be classified to unsaturated aliphatics,saturated
aliphatics,sesquiterpenoids,steroids and triterpenoids,consisting of the most abundant constituents n-Hexa-
decanoic acid,4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid,methylester,(al-Z)-,azuleno[4,5-b]furan-2,9-dione,9a-
[(acetyloxy)methyl]decahydro-6-methyl-3methylene-,[3aS-(3aα,6β,6aα,9aβ,9bα)]-,9,12-octadecadienoic acid
(Z,Z)-,9,12,15-octadecadienoic acid(Z,Z,Z)-,et al;Some individual components vary significantly among
hydrophobic constituents from different habitats.4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid,methylester,(al-Z)-,
azuleno[4,5-b]furan-2,9-dione,9a-[(acetyloxy)methyl]decahydro-6-methyl-3 methylene-,[3aS-(3aα,6β,6aα,
9aβ,9bα)]-,9,12-octa decadienoic acid(Z,Z)-,9,12,15-octadecadienoic acid(Z,Z,Z)-were first discovered in
hydrophobic constituents of S.involucrata.The antibacterial activity of hydrophobic constituents from 4habitats
was tested on the anti-MDR bacteria and the result showed no significant activity,but it showed some activity in
free radical scavenging experiment on DPPH.
Keywords:Saussurea involucrata;GC-MS;hydrophobic constituents;antibacterial;free radical scavenger
816 复 旦 学 报(自然科学版) 第50卷