全 文 ：西北大学学报( 自然科学版)
2012 年 2 月，第 42 卷第 1 期，Feb．，2012，Vol． 42，No． 1
Journal of Northwest University ( Natural Science Edition)
收稿日期: 2011-03-11
基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30970308) ;国家大学生创新实验基金资助项目( 101069710)
作者简介:王英娟，女，陕西西安人，西北大学副教授，博士，从事生物技术及细胞工程研究。
·生命科学与医药学·
光密度法测定蛋白核小球藻生物量
王英娟，贺 敬，李 壮，罗海羽
( 西北大学 生命科学学院，陕西 西安 710069)
摘要:目的 修正传统光密度测定微藻生物量的方法。方法 通过扫描并比较蛋白核小球藻藻液
和总色素提取物在 200 ～ 800nm范围内的吸光值，确定最佳波长以修正传统光密度法测定波长，绘
制标准曲线来间接测定蛋白核小球藻的生物量。比较修正前后光密度法测定蛋白核小球藻生物量
的精确性。结果 517nm下对应的吸光值与蛋白核小球藻的生物量有显著的线性关系。采用修正
后光密度法测定干重量具有良好的线性关系: Y = 0. 257 8X － 0. 005 1 ( R2 = 0. 995 6) ，相比传统光
密度法具有更好的相关性;采用修正后光密度法测定细胞密度具有良好的线性关系: D = 2 320. 4X
+0. 030 6( R2 = 0. 999 3) ，相比传统光密度法具有更好的相关性;修正后光密度法与干重法实时测
定的蛋白核小球藻生物量结果基本一致，而传统光密度法与干重法具有一定的偏差。结论 采用
517nm修正传统光密度法测定波长，有效消除了色素干扰带来的误差，可以作为蛋白核小球藻生物
量测定的特征波长。
关 键 词:光密度法;蛋白核小球藻;色素干扰
中图分类号: Q949 文献标识码: A 文章编号: 1000-274Ⅹ( 2012) 01-0060-04
Determination of Chlorella pyrenoidosa biomass
using optical density method
WANG Ying-juan，HE Jing，LI Zhuang，LUO Hai-yu
( College of Life Science，Northwest University，Xian 710069，China)
Abstract: Aim To rectify the traditional method of determining Chlorella pyrenoidosa biomass through optical
density．Methods The absorbance of the Chlorella pyrenoidosa was scanned and compared and the total pigment
from 200nm to 800nm as well，the properly specific wavelength identified and the standard curves generated to de-
termine the biomass of Chlorella pyrenoidosa，the accuracy of methods for determining Chlorella pyrenoidosa biomass
through optical density is compared between the retified and the traditional． Results It has been found that the ab-
sorbance under 517nm correlated closely with the biomass of Chlorella pyrenoidosa． Measuring the dry weight
through rectified optical density method reached significant linear relationship: Y = 0. 257 8X － 0. 005 1 ( R2 =
0. 995 6) ，far more better than the traditional; measuring the cell density through rectified optical density method
reached significant linear relationship: D = 2 320. 4X + 0. 030 6( R2 = 0. 999 3) ，far more better than the tradition-
al; the result of real-time determination for Chlorella pyrenoidosa biomass was basically in accordance between the
rectified optical density method and the dry weight method，while different between the traditional optical density
method and the dry weight method． Conclusion The method of optical density is handy and rapid for the determi-
nation of the biomass of Chlorella pyrenoidosa and eliminates the interference using the wave length of 517nm．
Key words: optical density; Chlorella pyrenoidosa; pigment interference
蛋白核小球藻 ( Chlorella pyrenoidosa ) 为绿藻
门、绿藻纲、绿球藻目、卵孢藻科、小球藻属的单细胞
藻类。作为一种含油量高的微藻，它在生产生物柴
油方面具有重要的价值［1 － 2］，而实时掌握小球藻的
DOI:10.16152/j.cnki.xdxbzr.2012.01.038
生物量的变化对于提高微藻产油率具有重要意义。
光密度法是测定细菌或其他单细胞微生物的生
物量的常用方法，它采用测定细胞悬液的吸光值来
间接测定生物量，具有快速、简便的特点，但细胞的
形态、组分及光学性质的变化可能会导致误差的产
生［5］。由于微藻细胞内的色素含量较高，且随培养
条件和培养时间的改变而变化，将光密度法用于微
藻生物量的测定存在很大误差。此外，不同的细菌
在进行生物量的测定时，都采取色素最大吸收峰处
波长如 OD680进行测定
［6］，由于微藻细胞中的色素
对微藻的波谱影响较大［7］，不同微藻细胞色素含量
的差异导致不同微藻具有不同的波谱，因此，不能采
用相同的测定波长。
本文同时扫描蛋白核小球藻藻液和总色素在
200 ～ 800nm范围内的吸收光谱，发现蛋白核小球藻
藻液在 459nm，517nm，693nm 处存在最大吸收峰，
而总色素在 449nm，481nm，632nm，671nm 处存在最
大吸收峰。为了消除色素含量变化带来的误差，选
定 517nm作为测定波长。绘制标准曲线后，发现即
使色素的含量变化，干重与 OD517存在良好的线性关
系，说明用 OD517间接测定蛋白核小球藻生物量，可
以得到较为可靠的测定结果。
1 材料与方法
1. 1 材 料
蛋白核小球藻( Chlorella pyrenoidosa，购于中国
科学院武汉水生生物研究所) 、SE 培养基 ( 所用试
剂均购自北京鼎国试剂公司 ) 、LB 培养基 ( 购自
Merck公司) 、721 型分光光度计 ( 购自上海和勤分
析仪器有限公司) 、光学显微镜( 购自上海精密仪器
仪表有限公司 ) 、高速离心机 ( 购自 Eppendorf 公
司) 、电热恒温干燥箱( DHG － 9247A，购自上海精宏
实验设备有限公司) 。
1. 2 蛋白核小球藻的培养
取接种量为 10%的蛋白核小球藻藻液接种于
SE培养基中，在 2 500lx 光照，16h /8h 的光 /暗室温
培养，每天 150r /min，30min，摇瓶 2 ～ 3 次。根据其
生长曲线，无菌批量培养 7 天备用。于测定前摇床
150r /min，30min，检查藻细胞是否沉降或凝集成团。
1. 3 干重量测定
将小球藻藻液加入离心管中，4 000r /min 离心
10 min，弃上清液，之后用蒸馏水洗涤，再离心，重复
以上步骤两次，然后于充满氮气的 80℃烘箱中烘至
恒重后称取干重量。3 次测量取平均值，并以获得
的干重量表征生物量［8］。
1. 4 细胞密度测定
采用血球计数板计数法［9］。
1. 5 光密度法测定生物量
将小球藻干藻粉分别称取 0. 3，0. 5，0. 7，0. 9，
1. 1，1. 3 g，溶解并定容到 2 mL，以干重量和细胞密
度表征生物量，然后在最佳吸收峰下测定不同浓度
小球藻的吸收值，绘制生物量与吸光值的标准曲线。
以 SE 培养基作为空白对照，并确定藻液吸光值的
检测限和线性范围，检测限为扣除空白对照后吸光
度值为 0. 01 时对应的样品吸光值。
1. 6 蛋白核小球藻藻液光谱扫描
选取培养早期的同一批的不同浓度的藻液
( 0. 15，0. 25，0. 35，0. 45，0. 55，0. 65 g /mL ) ，以 SE
培养基作为空白对照，扫描其在 200 ～ 800 nm 间的
吸光值。
1. 7 蛋白核小球藻总色素提取及光谱扫描
取 2 mL藻液 10 000 r /min离心 3 min，弃上清;
加入 2 mL DMSO涡旋混匀，60℃水浴 10 min; 10 000
r /min离心 3 min，上清中即为总色素［10］。以 SE 培
养基作为空白对照，扫描其在 200 ～ 800 nm 间的吸
光值。
1. 8 蛋白核小球藻生物量的实时测定
跟踪一个周期的生长培养，以干重量表征生物
量，选取某一波长作为测定蛋白核小球藻生物量的
特定波长，并在此基础上进行蛋白核小球藻生物量
的实时测定。对比干重法和细胞计数法实时测定蛋
白核小球藻生物量结果，以验证该波长能否作为蛋
白核小球藻生物量测定的特征波长。
2 结果与讨论
2. 1 蛋白核小球藻细胞的观察结果
图 1 为蛋白小球藻在油镜下的照片。培养 7 天
后，蛋白核小球藻在油镜下呈现深绿色，直径约为 2
～ 4 μm，以单细胞形式存在，且藻细胞在摇床 150 r /
min，30 min时无聚集成团的现象。
2. 2 修正传统光密度法测定波长
2. 2. 1 藻液光谱扫描结果 如图 2 所示，选取培养
早期的同一批的不同浓度( 0. 15，0. 25，0. 35，0. 45，
0. 55，0. 65 g /mL) 的藻液，以 SE 培养基作为空白对
照，扫描其在 200 ～ 800nm 间的吸光值。发现所测
的不同浓度的蛋白核小球藻藻液均在 459，517，693
nm处存在最大吸收峰。
2. 2． 2 总色素光谱扫描结果 扫描总色素在 200
—16—第 1 期 王英娟等:光密度法测定蛋白核小球藻生物量
～800 nm范围内的吸光值，发现总色素在 449，481，
632，671 nm处存在最大吸收峰( 图 3) 。
图 3 蛋白核小球藻总色素光谱扫描图
Fig． 3 The light spectra of the total pigments of Chlo-
rella pyrenoidosa
2. 2. 3 确定光密度法最佳测定波长 将蛋白核小
球藻总色素最大吸收峰波长 449，481，632，671 nm
与藻液的最大吸收峰波长 459，517，693 nm 比较后
发现，如果选择 459 nm或 693 nm作为最佳波长，则
会受到色素在 449 nm 和 671 nm 附近吸光值的干
扰。因此，517 nm作为测定波长可能会具有更小的
误差。
2. 3 比较修正前后光密度法
2. 3. 1 光密度法测定干重量 如表 1 所示，绘制吸
光值与干重量的标准曲线并比较 3 个最大吸收峰波
长下 OD值与干重的标准曲线方程及相关系数后发
现 517 nm处吸光值与干重具有良好的线性关系: Y
= 0. 257 8X － 0. 005 1( R2 = 0. 995 6) 。并且，藻液吸
光值的线性范围在 0. 05 ～ 0. 54 之间，相比色素最大
吸收峰处波长 459 nm 和 693 nm 具有更好的相关
性。这说明以色素最大吸收峰对应波长范围内波长
测定干重量会因色素含量变化易随培养条件和培养
时间变动产生误差，而选用 517 nm作为测定蛋白核
小球藻干重量的最佳波长可以消除微藻细胞色素含
量的变化导致的误差。
表 1 不同的最大吸收峰波长下 OD 值与干重的线
性关系比较
Tab． 1 Comparison among the correlation of the
wavelength of absorption peak with the
dry weight
最大吸收
峰波长
OD vs 干重标
准曲线方程
相关性
1
2
3
459
517
693
Y = 0. 162 5X + 0. 019 1
Y = 0. 257 8X － 0. 005 1
Y = 0. 120 0X + 0. 006 4
R2 = 0. 978 1
R2 = 0. 995 6
R2 = 0. 947 2
2. 3. 2 光密度法测定细胞密度 如表 2 所示，绘制
吸光值与细胞密度的标准曲线并比较 3 个最大吸收
峰波长下 OD 值与细胞密度的标准曲线方程及相关
系数后发现 517 nm处吸光值与细胞密度具有良好的
线性关系: D = 2 320. 4X + 0. 030 6( R2 = 0. 999 3) ，且
藻液吸光值的线性范围在 0. 05 ～0. 50 之间，相比 459
nm和 693 nm具有更好的相关性。这说明以色素最
大吸收峰对应波长范围内波长测定细胞密度会因色
素含量变化易随培养条件和培养时间变动产生误差，
而选用 517 nm作为测定蛋白核小球藻细胞密度的最
佳波长可以消除微藻细胞色素含量的变化导致的误
差。
2. 4 蛋白核小球藻生长过程中生物量的实时测定
由 2. 3 节可知，517 nm作为蛋白核小球藻的测
定波长具有较小的误差。如图 3 所示，跟踪一个周
期的生长培养，在进行蛋白核小球藻的生物量实时
测定中，选择 517 nm作为测定波长的修正光密度法
与干重法测定的结果基本一致，而传统光密度法选
择色素最大吸收峰对应波长范围内的波长( 459 nm
和 693 nm) 作为测定波长，与干重法具有一定的偏
—26— 西北大学学报( 自然科学版) 第 42 卷
差，验证了 517 nm作为测定蛋白核小球藻生物量特
征波长的可行性。由此说明，选用 517 nm作为测定
蛋白核小球藻生物量的最佳波长可以消除微藻细胞
色素含量的变化导致的误差。
表 2 不同的最大吸收峰波长下 OD 值与细胞密度
的线性关系比较
Tab． 2 Comparison among the correlation of the
wavelength of absorption peak with the
cell density
最大吸收
峰波长
细胞密度 － OD
标准曲线方程
相关性
1
2
3
459
517
693
D = 2 268. 7X － 1. 363 4
D = 2 320. 4X + 0. 030 6
D = 2 289. 0X － 3. 220 9
R2 = 0. 998 1
R2 = 0. 999 3
R2 = 0. 998 5
图 4 不同培养时间下光密度法和干重法的相关性
Fig． 4 The correlation between the optical density method
and dry weight method at different time
3 结 论
采用光密度法进行微藻生物量的测定具有快
速、简便的特点，但由于微藻胞内色素的影响，使得
测定产生了误差，如何减小误差对于提高这一方法
的实用性具有重要的意义。实验者多采用 400 ～
460 nm和 650 ～ 680 nm 之间的波长来绘制标准曲
线［11 － 12］，但是由于恰好在叶绿素的最大吸收峰
( 440 nm 和 660 nm 左右) 波长的附近，容易产生误
差。而且，由于色素的吸光值远大于其他细胞组分，
微藻的扫描光谱的最大吸收峰大都停在色素最大吸
收峰的附近，致使实验者在选取最佳波长时通常会
选择这些最大吸收峰对应的波长作为最佳波长。这
虽然满足了朗伯比尔定律的要求，但却忽视了色素
含量变化会随着培养条件和培养时间而变动，从而
导致了测量中的较大误差。
本文在选取最佳波长时，将总色素的几个最大吸
收峰和藻液的最大吸收峰比较，选取远离最大吸收峰
的波长作为最佳波长，在满足朗伯比尔定律要求的同
时也最大程度地减小了色素含量变化带来的误差。
通过比较，发现修正后的光密度法测定蛋白核小球藻
的生物量时，其藻液吸光值在 0. 05 ～ 0. 5 之间即使色
素的含量变化，干重、细胞密度均仍与 OD517存在良好
的线性关系，说明修正后的光密度法间接测定蛋白核
小球藻生物量，可以得到可靠的测定结果。OD517间
接测定蛋白核小球藻生物量可以实时掌握蛋白核小
球藻的生物量的变化、对于微藻的产油率监控具有重
要意义。更重要的是，通过扫描并比较微藻藻液和总
色素提取物在 200 ～800nm范围内的吸光值确定光密
度法最佳波长的方法，为光密度法测定微藻生物量、
消除色素干扰带来的误差提供了普遍方法。
参考文献:
［1］ PULZ O，GROSS W． Valuable products from biotechnolo-
gy of microalgae［J］． Appl Microbiol Biotechnol，2004，
65: 635-648．
［2］ POSTEN C，SCHAUB G． Microalgae and terrestrial bio-
mass a source for fuels-A process view［J］． Journal of Bi-
otechnology，2009，142( 1) : 64-69．
［3］ 董正臻，董振芳，丁德文．快速测定藻类生物量的方法
探讨［J］．海洋科学，2004，28( 11) : 1-5．
［4］ 王雪青，苗惠，翟燕．微藻细胞破碎方法的研究［J］．天
津科技大学学报，2007，22( 1) : 21-25．
［5］ CLESCERI L S，GREENBERG A E，EATON A D． Stand-
ard Methods for the Examination of Water and Wastewater．
20th ed［M］． American Public Health Association，Washing-
ton DC，1998．
［6］ SHULER M L，KARGI F． Bioprocess Engineering: Basic
Concepts． 2nd ed［M］． Pearson Education，Singapore，2005．
［7］ MELINDA J，GARCIN C，ROBERT P． Interference by
pigment in the estimation of microalgal biomass concentra-
tion by optical density［J］． Journal of Microbiological
Methods，2011，85: 119-123．
［8］ 韩雅珊．食品化学实验指导［M］．北京: 北京农业大学
出版社，1992: 4．
［9］ 周群英，高延耀． 环境工程微生物学［M］． 北京: 高等
教育出版社，2000: 292-293．
［10］ WELLBURN A R． The spectral determination of chloro-
phylls a and b，as well as total carotenoids，using various
solvents with spectrophotometers of different resolution
［J］． Plant Physiol，1994，144: 307-313．
［11］黄美玲，何庆，黄建荣，等． 小球藻生物量的快速测定
技术研究［J］．河北渔业，2010，196( 4) : 1-4．
［12］沈萍萍，王朝晖，齐雨藻．光密度法测定微藻生物量［J］．
暨南大学学报:自然科学版，2001，22( 3) : 115-119．
( 编 辑 陈镱文)
—36—第 1 期 王英娟等:光密度法测定蛋白核小球藻生物量