全 文 ：重庆彭水野生美味牛肝菌菌丝分离与鉴定 *
王正春 1，2， 蒋海艳 1， 杨笑笑 2， 李月文 1， 李继晖 3， 郑凌凌 3
（1.重庆市林业科学研究院， 重庆 400036； 2.西南大学资源环境学院， 重庆 400715；
3.彭水自治县林业科技推广站， 四川 彭水 409600）
摘要： 通过 2种不同的培养基对彭水 2种野生牛肝菌子实体进行分离、培养，同时，进行液体培养，培养的菌丝经过
ITS鉴定，放入-80℃超低温冰箱中保藏。结果表明，2种牛肝菌菌丝均从组织块表面边缘生长，菌丝洁白、小，不向周
围培养基生长，老化速度较快，老化过程中菌丝减少，最后变为固体状物，并且分泌褐色水珠；液体培养菌丝体生长
缓慢，培养时间较长，菌丝球小、少；菌丝球经过鉴定后，确定 2种牛肝菌均为美味牛肝菌。
关键词： 重庆；彭水；美味牛肝菌；分离培养；液体培养；ITS鉴定；保藏
中图分类号： S646.9 文献标识码： A 文章编号： 1003-8310 （2012） 01-0046-03
Hyphe Separation and Identification of Wild Boletus edulis in Chongqing Pengshui
WANG Zheng-chun1,2, JIANG Hai-yan1, YANG Xiao-xiao2, LI Yue-wen1, LI Ji-hui3, ZHENG Ling-ling3
(1.Forestry Research Institute of Chongqing, Chongqin 400036; 2.Southwest University, Chongqin 400715;
3.Pengshui Autonomous County Forestry Science and Technology Promotion Station, Pengshui Sichuan 409600)
Abstract: Through two different culture medium, two wild Boletus edulis were seperated and cultured, and training hy-
phae were identificated by ITS, which were stord in the refrigerator of -80℃ . The results showed that the two Boletus
edulis hyphe liver tissue were growth from mass surface edge, and the hyphe were white and small. The hyphe didn’t
grow around the culture medium, and aging faster. The mycelia by liquid culture grew slowly, and the ball was small.
Hyphae ball by determining were Boletus edulis.
Key words: Chongqing; Pengshui; Boletus edulis; Separation training; Liquid culture; ITS identification; Preservation
牛肝菌属是担子菌亚门 （Basidiomycotina）、 层菌纲
（Hymenomycete）、 伞菌目 （Agaricales）、 牛肝菌科 （Bole-
taceae） 的一类珍稀大型菌根食用真菌。 重庆生长的牛肝
菌以彭水 “大脚菌” 即美味牛肝菌最有名气， 味道鲜美，
营养丰富， 具有高经济价值。 市场上消费的美味牛肝菌主
要是野生， 目前尚未见人工栽培的报道。 近年来， 由于人
们过度采集及不合理采集， 野生资源正逐年减少， 为使这
一宝贵资源得到可持续利用， 对其采取保护措施和人工驯
化繁育势在必行。
通过对重庆武陵山区彭水野生美味牛肝菌菌丝的分离培
养， 为美味牛肝菌的菌根菌合成和人工驯化作好基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 分离材料
白牛肝菌， 菌盖淡褐色， 菌褶白色， 菌柄粗壮， 淡黄
色； 黄牛肝菌， 菌盖为黄褐色， 菌柄为烤面包的皮壳色。
2 种子实体， 于 2011 年 6 月 18 日采摘于重庆武陵山彭水
朗溪乡青冈纯林内， 海拔为 700 m 左右。 2 种牛肝菌的子
* 项目来源： 重庆市科技攻关项目 “彭水县野生牛肝菌人工驯化关键技术研究” （CSTC， 2010AC1111）； “武陵山区食用菌良种高效栽培试验
示范” （CSTC， 2010AB1047）； 重庆市林科院科技计划项目 “万州区老林村林下食用菌栽培示范”、 “重庆桉树、 竹林林下种植模
式技术研究”。
作者简介： 王正春 （1981-）， 男， 硕士研究生， 林业工程师， 主要从事生物技术和林下经济等方面研究。
收稿日期： 2011-11-29
中国食用菌 2012， 31 （1）： 46~48
EDIBLE FUNGI OF CHINA
CN53－1054 ／ Q ISSN 1003－8310
王正春等： 重庆彭水野生美味牛肝菌菌丝分离与鉴定
实体情况见图 1。
1.1.2 培养基
固体培养基： ①葡萄糖 20 g、 酵母粉 7.0 g、 黄豆粉
3.0 g、 KH2PO4 1.0 g、 MgSO4·H2O 0.5 g、 MgSO4·7H2O 0.5
g、 琼脂 20.0 g， 水 1 000 mL [1]； ②马铃薯 200 g、 葡萄糖
20 g、 KH2PO4 3 g、 MgSO4·7H2O 1.5 g、 琼脂 20 g、 VB1 10
mg， 水 1 000 mL。
液体培养基： ③葡萄糖 20 g、 麦芽糖 5 g、 KH2PO4 1
g、 MgSO4·7H2O 0.5 g、 VB1 1 mL， 水 1 000 mL， pH 6.0；
④葡萄糖 20 g、 酵母浸出膏 7.0 g、 MgSO4·7H2O 1.0 g、
KH2PO4 2.0 g、 VB1 0.01 mg， 水 1 000 mL， pH 5.2~5.8 [2]。
1.2 方法
1.2.1 菌丝分离、 培养
采摘的子实体放入干净、 透气的盒子， 立即带回实验
室进行处理。 选取新鲜幼嫩、 无病虫害的完整子实体， 采
用组织分离法， 无菌操作， 及时进行分离。 子实体表面用
75%酒精进行消毒， 然后切取菌柄与菌盖交界处 [3]大小为
(0.2×0.2) cm～ (0.4×0.4) cm 的组织块接入培养基中， 分别
做好标记， 并注明日期， 放入恒温恒湿培养箱中进行培
养。 尽可能将组织块接入较多的斜面培养基。 培养条件为
25℃， 相对湿度 70%， 无光照。 4 d～5 d 后检查培养基斜
面是否有污染， 有污染者及早剔除。
菌丝生长旺盛时， 挑取少许菌丝转接到新的培养基
中， 标注后， 放入恒温恒湿培养箱中进行培养。 整个转接
过程在无菌的环境下进行， 每隔 2 d 检查， 剔除污染严重
的培养基。
1.2.2 液体培养
液体培养基配制好后， 进行分装。 100 mL 三角瓶装
液量为 40 mL， 高压灭菌 121.1℃、 30 min， 冷却后保存于
冰箱备用。 挑取少许健壮的菌丝接入液体培养基中， 注明
菌种名称、 编号、 日期。 在 27℃条件下静置 24 h 后， 放
入恒温震荡箱中进行培养， 培养条件为 27℃、 转速为 160
r·min-1。
1.2.3 菌丝鉴定
菌丝经过液体培养后。 将三角瓶中的液体及菌丝过
滤， 进行 ITS 鉴定 [4]，具体方法跟 “武陵山区羊肚菌菌丝鉴
定及分析” 中羊肚菌菌丝鉴定相同。 以 ITS1 和 ITS4 为引
物进行 PCR 扩增得到的 rDNA-ITS 区段经过测序后， 登陆
www.ncbi.nlm.nih.gov 进行 BLAST 比对。
1.2.4 菌种保藏
菌丝体经过鉴定， 确认为美味牛肝菌后， 进行低温冷
冻保藏。 具体方法： 信封高温灭菌、 滤纸进行高温灭菌待
用， 取培养的菌丝体， 过滤， 将滤纸放入信封中， 注明菌
种名称、 日期、 编号等， 放入-80℃超低温冰箱中进行保
藏。
2 结果与分析
2.1 菌丝生长情况
在分离培养基上， 菌丝从组织块边缘萌发长出， 生长
较好， 但不向周围的培养基中蔓延， 老化的程度较快， 老
化过程中菌丝减少， 最后变为固体块状物， 并且分泌褐色
水珠。 菌丝生长情况见表 1， 菌丝图片见图 2。
由图 2 可知， 白牛肝菌和黄牛肝菌在 2 种培养基上菌
图 1 2 种牛肝菌的子实体情况
白色牛肝菌 黄色牛肝菌
表 1 2 种牛肝菌菌丝在不同培养基中生长情况
5d 7d 9d 12d 14d
组织块变为灰白 组织块边缘长出白色菌丝 菌丝生长良好
菌丝生长良好， 但不
向培养基扩散
菌丝生长良好
组织块上边缘长出白
色菌丝
菌丝短、 小
菌丝生长良好， 但不向培养
基扩散， 难以挑取菌丝
开始老化， 菌丝减少 固体状物， 分泌褐色水珠
组织块边缘长出少许
白色菌丝
菌丝生长良好 菌丝短、 小， 生长缓慢 菌丝生长较好
菌丝短、 粗壮， 但不向培养
基蔓延
组织块周围的培养基
变成茶褐色
长出少许白色菌丝 菌丝生长良好 菌丝不向培养基蔓延
组织块老化， 呈固体状， 菌
丝减少， 分泌褐色水珠
培养基
①
②
①
②
品种
白牛肝菌
黄牛肝菌
丝的萌发速度和生长情况差别不是很大， 菌丝也生长较
好， 但菌丝在培养基②上生长比培养基①的老化速度要
快， 因此， 培养基①可以作为 2 种牛肝菌分离的培养基。
菌丝从组织块上长出后生长较好， 菌丝不向组织块周围的
培养基中生长， 难以挑取菌丝， 因此， 培养基①并非牛肝
菌分离的最佳培养基。
2.2 液体培养
菌丝在液体培养基中生长缓慢， 40 d 后进行观察。 菌
黄牛肝菌菌丝白牛肝菌菌丝
图 2 2 种牛肝菌菌丝情况
第 31 卷 第 1 期 47
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菇类能防病治病
丝在培养基③、 培养基④培养基摇瓶中污染的几率较大。
培养基③摇瓶内长出菌丝体， 小而少。 培养基④摇瓶中接
种的菌丝几乎不生长。
2.3 菌丝鉴定
以 ITS1 和 ITS4 为引物， 2 种牛肝菌菌丝进行 PCR 扩
增所得 rDNA-ITS 区段大小均约为 700 bp, BLAST 比对结
果可知， 2 种牛肝菌的 rDNA-ITS 序列 （图 3） 与 Boletus
edulis 具有 100%的相似性， 从而确定 2 种牛肝菌与 Bole-
tus edulis 是同一个种， 具体分类地位如下： 真菌界 （My-
cota）、 担子菌亚门 （Basidiomycotina）、 层菌纲 （Hymeno-
mycetes）、 伞菌目 （Agaricales）、 牛肝菌科 （Boletaceae）、
牛肝菌属 （Boletus） 、 美味牛肝菌 （Boletus edulis Bull.:
Fr）。
3 讨论
菌丝分离成功较少， 原因可能是牛肝菌菌丝从组织块
边缘萌发长出， 与组织块有密切关系， 菌丝不易挑取， 挑
取成功的菌丝接入新的培养基中难以生长。 这与王海坤、
李涛等 [5]报道的一致。 因此， 美味牛肝菌的分离、 培养所
需要的营养因子和培养条件有待继续研究。
组织分离法难以分离得到纯的牛肝菌菌丝， 可以采用
其他分离方法进行菌丝的分离， 如孢子分离法。
菌种在-80℃超低温冰箱中保存的时间比较长， 保存
后菌种的复壮及复壮后菌丝的生长情况需进一步进行研
究。
菌种培养好之后， 将继续进行菌根合成试验的研究。
[参考文献]
[1] 邓百万， 陈文强. 美味牛肝菌母种培养基的筛选[J]. 福建农林大学
学报： 自然科学版， 2004， 33 (3)： 396-399.
[2] 陈文强， 邓百万. 美味牛肝菌深层发酵的研究[J]. 四川大学学报：
自然科学版， 2005， 42 (2)： 368-372.
[3] 刘琼波， 苏开美， 白永顺， 等. 美味牛肝菌的菌种分离培养试验
初探[J]. 食用菌， 2007 (4)： 25-26.
[4] 陈剑山， 郑服丛. ITS 序列分析在真菌分类鉴定中的应用 [J]. 安徽
农业科学， 2007， 35 (13)： 3785-3786， 3792.
[5] 王海坤， 李涛， 赵丹丹， 等. 两株滇产广义美味牛肝菌的分离培
养及其分子鉴定[J]. 云南植物研究， 2007， 29 (5)： 559-562.
图 3 2 种牛肝菌质粒转换后凝胶电泳成像
今天要推荐的养生品是菇类。 菇类是一种高蛋白、 低脂肪的高级营养食品， 也是一种具有奇妙药效的食品， 在美国
被称为 “上帝食品”， 在日本被誉为 “植物性食品的顶峰”， 我国则把菇类称为 “山珍”。 科学家发现， 菇类的提取液含
有一种双核酸， 能刺激人体产生更多的干扰素， 而干扰素能消灭人体内的病毒。 因此， 多吃菇类对预防感冒等疾病有一
定作用， 同时也有防癌抗癌的功效。 所以有关专家认为， 从营养和保健的观点来看， 菇类确是当今人类重要的健康食
品。
1 蘑菇
在众多的菇类食品中， 蘑菇是人们颇为喜食的一种佳品。 蘑菇的营养价值超过大部分蔬菜和水果， 与肉类很接近。
许多科研报告认为， 蘑菇可以代替肉， 因为蘑菇含蛋白质高， 干蘑菇的蛋白质含量约为 35％~40％。 而且蛋白质中的氨
基酸成分同肉、 奶、 蛋的蛋白质成分十分相似。 蘑菇的蛋白质中有 20 多种可保证人体正常生长发育所必需的氨基酸。
此外， 蘑菇还是多种维生素的良好来源。 蘑菇中含有较为丰富的 B 族维生索及维生素 C、 维生素 K、 维生素 E 等，
还含有多种微量元素。 其中， 磷的含量与色相等， 铁的含量也极高。 100 g 蘑菇所含的微量元素， 可以满足人体 24 h 所
需。 蘑菇还能防病治病， 蘑菇所含的 B 族维生素可预防皮炎和肠炎的发生， 蘑菇中所合的叶酸可免患贫血。 此外， 科学
家已从蘑菇中分离出了一种可用于预防和治疗肿瘤的物质。 蘑菇中的碳水化合物含量很少， 最适合糖尿病患者和胆固醇
偏高者食用。
2 香菇
香菇味道鲜美， 香气沁人， 营养丰富， 素有 “植物皇后” 的美誉。 分析表明， 每 100 g 香菇中， 含蛋白质 21 g， 同
鸡肉相差无儿， 含碳水化合物 29 g、 钙 35 mg、 磷 2 mg、 铁 7.3 mg， 钙、 磷、 铁的含量比鸡肉高 2 倍~5 倍。 香菇中所含
的维生素 C、 维生素 B1、 维生素 B2之多， 就连一向以维生素多而著称的番茄、 胡萝卜、 马铃薯等也不得不甘拜下风。 香
菇还含有 18 种氨基酸， 人体必需的 8 种氨基酸中， 香菇占 7 种， 而且易被人体吸收。
香菇不仅是味道鲜美的佳肴， 而且还具有相当高的医疗价值。 由于香菇含有丰富的食物纤维， 常食能降低血液中的
胆固醇， 防止动脉硬化， 对防治脑溢血、 心脏病、 肥胖症都有效。 美国科学家还发现， 香菇中含有一种 “β-葡萄糖苦
酶”， 这种物质有明显的抗癌作用。 能增强机体免疫功能， 抑制癌细胞的生长及转移， 对防治食道癌、 胃癌、 子宫颈癌、
贺门疡、 大肠癌等有一定的疗效。 无怪乎人们给香菇冠以 “癌的克星”、 “治癌的核武器”、 “健康食品” 等称号。
中国食用菌商务网 2011.12.12
中国食用菌 EDIBLE FUNGI OF CHINA Vol． 31 No．148