全 文 ：新疆雪莲芽分化过程中抗氧化酶体系活性的变化
徐春明1 ,赵 兵2 　(1.北京工商大学化学与环境工程学院 ,北京市植物资源研究开发重点实验室 ,北京 100048;2.中国科学院过程工程研究
所 ,生化工程国家重点实验室 ,北京 100080)
摘要　[目的]为新疆雪莲的高频再生提供理论指导。[方法]以雪莲胚性愈伤组织为材料 ,在 pH值为 5.85～ 5.90的MS+2.0 mg/L NAA
+0.5mg/L 6-BA+0.5%琼脂培养基中进行继代培养 ,研究了培养过程中超氧化物酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性
的变化。[结果]新疆雪莲芽分化过程中胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织的 SOD活性逐渐增加 ,在培养 24 h时达到最大。胚性愈伤组织
的 POD活性都大于非胚性愈伤组织;非胚性愈伤组织 POD活性在培养过程中呈缓慢上升的趋势 ,而胚性愈伤组织 POD活性呈双峰曲线
变化。CAT在胚性愈伤组织培养前期活性较低。进入芽分化过程后 ,其活性逐渐升高。[结论]新疆雪莲芽分化过程中 , SOD与CAT活
性变化趋势基本一致 ,与 POD的活性变化不同。
关键词　新疆雪莲;芽分化;抗氧化酶体系
中图分类号　S 567.23+9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)09-03903-02
Activity Change of Antioxidase System in Bud Differentiation Process of Saussurea involucrata
XU Chun-ming et al　(Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development , College of Chemical and Environmental Engineering , Bei-
jing Technology and Business University , Beijing 100037)
Abstract 　[Objective] The study was to provide the theoretical guidance for the regeneration of Saussurea involucrate with high frequency.[ Method]
With the embryogenic callus of S.involucrata as the material , they were subculture in medium of MS+2.0mg/ LNAA+0.5 mg/L 6-BA+0.5% agar
with pH value of 5.85-5.90.In culture process , the changes of activity of SOD , POD and CAT were studied.[ Result] In bud differentiation process of
S.involucrata , the SOD activities of non embryogenic callus and embryogenic callus were increased slowly , and reached the highest at 24h after culture.
The POD activity of embryogenic callus was higher than that of non embryogenic callus.In culture process , the POD activity of non embryogenic callus
showed a slowly increasing trend , but the change of POD activity of embryogenic callus showed a double-peak curve.TheCAT activity of embryogenic cal-
lus at early stage of culture was low.After bud differentiation process beginning, theCAT activity increased gradually.[ Conclusion] In bud differentiation
process of S.involucrata , the changing trend of activity of SODwas similarly with that of CAT , but was different with that of POD.
Key words　 Saussurea involucrata;Bud differentiation;Antioxidase system
作者简介　徐春明(1978-),男 ,山东临清人 ,博士 ,讲师 ,从事生物化
工方面的研究。
收稿日期　2008-12-22
　　新疆雪莲又称天山雪莲 、雪莲花 ,为菊科凤毛菊属多年
生草本植物 。该植物含有黄酮 、生物碱 、内酯 、多糖等药用成
分 ,具有抗风湿 、镇痛 、强心 、抗癌 、降压 、平喘 、促进平滑肌收
缩 、清除活性氧等功效[ 1-2] 。近年来 ,随着雪莲产品开发利
用热潮的兴起 ,新疆雪莲遭到过度采挖 ,目前该植物已被列
入国家三级保护植物名录。雪莲种子发芽率低 、生长缓慢 ,
人工种植困难[ 3] ,利用植物组织培养技术对新疆雪莲进行快
速繁殖是一种行之有效的繁殖方法 ,而新疆雪莲的分化过程
是决定其快繁能否成功的关键。所有需氧生物都必须依赖
氧才能获得能量和维持生命 ,然而活性氧对所有生物又都有
毒害作用。已有研究表明 ,活性氧在生理代谢过程中起着重
要的调控作用。研究发现 ,活性氧与细胞分化有关 ,因此在
植物体细胞胚发生过程中必然存在活性氧的影响[ 4] 。了解
分化过程中抗氧化酶体系活性的变化 ,揭示活性氧在新疆雪
莲分化过程中的调控作用 ,对于新疆雪莲的高频再生具有重
要的指导意义。
1　材料与方法
1.1　材料　雪莲胚性愈伤组织。用新疆维吾尔自治区巴里
坤县雪莲种子培育无菌苗 ,以其叶片为外植体诱导出胚性愈
伤组织。
1.2　方法
1.2.1　培养方法。培养基为MS+2.0mg/L NAA+0.5 mg/L
6-BA+0.5%琼脂 ,pH值为 5.85 ～ 5.90 。将培养基分装到 100
ml三角瓶中 ,每瓶 30ml ,在 1.06 kg/cm2压力下灭菌 20 min。
灭菌后在超净工作台上接种雪莲细胞。培养温度为(25±1)
℃,光照 16h/d ,光照强度 10μmol/(m2·s),继代时间30d 。从
第 0天开始 ,每 4 d取样 1次 ,每次取样设 3个重复 ,对雪莲
细胞中的抗氧化酶活性物质进行分析测定。
1.2.2　抗氧化酶活性测定。取样品放于预冷的研钵中 ,加
入 10ml预冷的提取液 ,提取液中含 0.1 mol/L的磷酸缓冲
液 , 0.5 mmol/L EDTA ,pH值调至 7.5 ,用来提取 SOD和 CAT ;
或用含 0.1mol/L的磷酸缓冲液 , 0.5 mmol/L EDTA ,1 mmol/L
抗坏血酸 , pH值调至 7.5的提取液提取 POD。研磨后的提取
液在 15 000 g下冷冻离心 20 min 。上清液用来测定酶活性 。
所有的操作均在 4 ℃条件下进行。
SOD活性的测定按照Beauchamp等的方法[ 5] ,通过测定
其在 470 nm处的吸光度来确定;POD活性按照 Nakano等的
方法测定[ 6] ,通过测定其在 470 nm 处的吸光度变化来确定;
CAT活性按照Aebi的方法测定[ 7] ,通过测定 240 nm 处过氧
化氢吸光度来确定。
2　结果与分析
2.1　新疆雪莲芽分化过程中 SOD活性的变化　由图 1可
知 ,新疆雪莲芽分化过程中胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织
的 SOD活性变化趋势相似 ,在整个培养过程中 SOD活性逐
渐增加 ,在培养24 d时达最大值 ,此时正处于芽分化期 , 24 d
以后 SOD活性有所下降 。邢更生等对枸杞体细胞胚发生过
程的研究表明 , SOD 、POD和 CAT 的活性在体细胞发育过程
中出现不同的变化[ 4] 。当愈伤组织转入分化培养基后 ,随着
胚性细胞的诱导 ,SOD活性呈上升趋势;多细胞原胚期 ,SOD
活性达到高峰 ,表明 SOD活性升高对胚性细胞的分化和发育
有促进作用。同时也表明 ,只有 SOD活性升高 ,细胞分化才
会发生 ,且 SOD 、O2-与H2O2 的相互关系决定着细胞的分化 。
相反 ,POD和CAT 的活性随胚性细胞的分化和发育而降低 ,
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2009 , 37(9):3903-3904 ,3917　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　常俊香　责任校对　况玲玲
而在继代愈伤组织中POD与 CAT 活性相对较高。SOD抑制
剂二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDC)不仅可抑制 SOD的活性 ,
同时也降低了体细胞胚的发生频率 。这进一步证明 , SOD与
胚性细胞的分化和早期发育密切相关 。胚性细胞的各类细
胞器代谢活跃 ,且细胞数目增加 ,多糖积累 ,胚性细胞膜上
ATP酶活性增强 ,内源ABA含量提高 ,核酸和蛋白质合成量
增加及基因差别表达等都可能与胚性细胞的抗氧化能力
有关。
图 1　新疆雪莲芽分化过程中 SOD活性的变化
Fig.1　Changes of SOD activity in Saussurea involucrata during the
bud differentiation period
2.2　新疆雪莲芽分化过程中 POD活性的变化　由图 2可
知 ,在细胞培养过程中 ,胚性愈伤组织的 POD活性均大于非
胚性愈伤组织 。非胚性愈伤组织的 POD活性在整个培养过
程中呈缓慢上升趋势 ,而胚性愈伤组织的POD活性呈双峰曲
线变化 ,这可能因为在培养初期细胞对培养基有一个适应过
程 ,此期间POD活性升高以清除细胞内部产生的活性氧。而
在胚性愈伤组织分化期 ,由于细胞呼吸和代谢作用旺盛 ,细
胞分化时木质素的合成造成POD活性升高。过POD可以调
节细胞中H2O2 的含量 ,而H2O2 是目前研究较深入的氧化胁
迫刺激因子。因为其活动性小 ,在细胞内存活时间长 ,可以
扩散到细胞中的各个部位 ,被认为是活性氧的信使 。H2O2 大
量积累对细胞产生毒害作用。但细胞内低浓度的 H2O2 是必
需的 ,它可抑制外源病菌的发育或参与木质素的合成 ,有利
于植物细胞壁木质化和结构蛋白质多聚化 ,从而阻止病原体
侵染细胞。另有试验结果表明 ,H2O2 在转录水平上对细胞氧
化应激基因的表达起调控作用 ,且H2O2 可能是一种细胞信
号传递物质 ,通过信号传递系统调节相关基因表达 ,从而促
进细胞分化。适当浓度的 H2O2 促进胚性细胞分化的作用
有:①H2O2 参与木质素合成 ,使细胞壁加厚 ,而细胞壁加厚是
细胞分化和发育的重要环节;②H2O2可能作为一种细胞信号
物质 ,通过细胞信号系统调节与胚胎发生相关基因的表达 ,
从而促进胚性细胞分化;③已有试验证明Ca2+是细胞分化的
诱导物质 ,而H2O2 可能是通过提高细胞质内 Ca2+的浓度或
改变细胞内 Ca2+的分布促进胚性细胞分化的[ 4] 。
2.3　新疆雪莲芽分化过程中 CAT活性的变化　由图 3可
知 ,在胚性愈伤组织培养前期CAT 活性较低 ,随着胚性愈伤
组织逐渐进入芽分化过程其活性逐渐升高 ,在芽形成期达到
最高。说明 CAT 活性的升高对芽的形成和发育具有促进作
用。在胚性愈伤组织培养早期 CAT 活性较低 ,而POD活性
相对较高 ,这可能是因为不同时期H2O2 由不同的酶来清除 ,
从而使芽分化过程中氧化系统维持在一个适宜的水平 ,以消
除逆境对芽分化的影响。
图2　新疆雪莲芽分化过程中 POD活性的变化
Fig.2　Changes of POD activity in S.involucrata during the bud
differentiation period
图3　新疆雪莲芽分化过程中 CAT 活性的变化
Fig.3　Changes of CAT activity in S.involucrata during the bud
differentiation period
在新疆雪莲芽分化过程中 , 3种抗氧化酶活性均有明显
变化。SOD和 CAT 活性变化趋势基本一致 ,而与 POD的活
性变化不同。POD对胚性愈伤组织芽分化的诱导起主导作
用 ,而 SOD和 CAT 对芽的发育和成熟起关键作用。由此认
为 , SOD 、POD和 CAT 3种酶与胚性愈伤组织的分化及芽的发
育有密切关系 ,它们相互配合调节胚性细胞的分化与发育 。
崔凯荣等认为 ,在胚性愈伤组织转入分化培养基后 ,SOD活
性逐渐升高 ,当胚性细胞进一步分化成芽时 , SOD活性达到
高峰 ,表明 SOD活性升高对胚性细胞的分化及胚胎发育具有
促进作用[ 8] ,这与该试验结果相似 。此外 ,Oberley也认为 ,具
分生组织的茎尖和根尖的 SOD活性较高 ,也只有 SOD活性
升高 ,分化才会发生。在大蒜体胚发生过程中 ,外植体脱分
化时 , SOD和CAT 的活性较低 ,而POD活性相对较高 ,表明
大蒜外植体由于受到切割等伤害形成的氧化胁迫 ,主要由
POD来清除其体内的活性氧 ,使H2O2 维持较低的浓度来保
证细胞的再分裂[ 9] 。随着胚性细胞的形成 ,SOD和CAT 的活
性逐渐上升。随着 SOD活性的上升 , POD和CAT 活性升高 ,
可防止H2O2 的浓度过高对胚性细胞的形成和体胚发育的抑
制作用。崔凯荣等[ 10] 对枸杞体胚发生的研究认为 ,一定浓
度的H2O2对枸杞胚性细胞的形成和体细胞胚的发育有促进
作用;而过高的H2O2 则有抑制作用。但是在枸杞体胚发生
过程中 , SOD 活性的变化趋势正好与 POD 和 CAT 活性
的变化趋势相反;而在大蒜体细胞胚发生过程中 ,POD活性
(下转第 3917页)
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可溶性糖积累量也明显低于柠条锦鸡儿 ,可能是由于这些物
质的积累量足以维持细胞的膨压 ,或者还有其他渗透调节物
质发挥作用 。
丙二醛是膜脂过氧化的终产物 ,其积累是活性氧毒害作
用的表现 ,其含量常作为判断膜脂过氧化程度的重要指标。
而生物膜的稳定性与植物抗旱性相关 ,细胞膜系统的损伤是
植物受到水分胁迫的重要表现。在环境胁迫下丙二醛大量
积累[ 20] ,而抗旱性强的物种丙二醛积累量少。3种锦鸡儿在
土壤持续干旱下不断积累丙二醛 ,但其积累模式不同 。柠条
锦鸡儿丙二醛的变化趋势与旱生植物红砂对水分胁迫的响
应一致[ 17] ,其变化曲线呈M型 ,表现出较强的膜稳定性和极
强的抗过氧化胁迫能力 。白皮锦鸡儿的丙二醛持续积累 ,但
积累量较少 ,且干旱处理末期略有下降 ,也表现出极强的抗
过氧化胁迫能力。刺叶锦鸡儿的丙二醛含量在处理前期大
幅下降 ,其他时期含量一直较高 ,说明该植物对干旱胁迫的
调节能力有限 ,这可能是刺叶锦鸡儿叶片最早干枯的原因。
叶绿素作为光合色素的重要色素分子 ,参与光合作用中
光能的吸收 、传递与转换 ,在光合作用中占有重要地位。许
多研究表明 ,干旱胁迫导致叶绿素含量减少 ,其原因与叶绿
素的合成受阻及活性氧的损失有关[ 21] 。抗性强的作物叶绿
素含量减少的幅度较小 ,这已在小麦[ 22] 、草莓[ 23] 等作物中被
证实。土壤持续干旱处理期间 3种锦鸡儿的叶绿素均有少
量减少 ,表明 3种锦鸡儿均具有较强的抗旱性。恢复浇水后
3种锦鸡儿的叶绿素含量均有所增加 ,但仍低于原来的水平 ,
表明干旱胁迫对 3种植物的叶绿体结构造成了一定的损伤 ,
且这种损伤在浇水后不会马上得到恢复。
刺叶锦鸡儿和白皮锦鸡儿与柠条锦鸡儿都具有较强的
渗透调节能力和抗过氧化胁迫能力 ,对土壤持续干旱造成的
干旱胁迫具有较强的适应性 ,但刺叶锦鸡儿的抗旱性稍差。
若要全面了解其抗旱机理 ,还需开展其对干旱胁迫的光合特
性和过氧化防御体系等方面的研究 ,以便为新疆荒山绿化工
作提供参考 。
参考文献
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(上接第 3904页)
的变化趋势与 SOD和 CAT活性的变化趋势相反[ 10] 。这与
该研究结果中 3种酶的活性均有不同程度的升高的结论有
所不同 。这可能是不同作物芽分化发生过程中抗氧化系统
的协调方式不同所致。
3　结论与讨论
(1)新疆雪莲芽分化过程中胚性愈伤组织和非胚性愈
伤组织的 SOD活性逐渐增加 ,在培养 24 d时达到最大值 ,
此时雪莲正处于芽分化期 , 24 d以后 SOD活性有所下降。
(2)在整个细胞培养过程中 ,胚性愈伤组织的 POD活性
均大于非胚性愈伤组织 。非胚性愈伤组织POD活性在整个
培养过程中呈缓慢上升趋势 ,而胚性愈伤组织的 POD活性
变化呈双峰曲线。
(3)在胚性愈伤组织培养前期 CAT活性较低 ,随着胚性
愈伤组织逐渐进入芽分化过程其活性逐渐升高 ,在芽形成
期达到最高 。
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