全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2009, 21:99-103
文章编号:1001-6880(2009)01-0099-05
　
　
　收稿日期:2007-07-24　　　接受日期:2008-01-08
　基金项目:国家 “ 985”工程———中央民族大学 “ 985”工程重点科研
项目(cun985-3-3)
＊通讯作者 86-10-68156198;E-mail:liuchunlan888@yahoo.com.cn
新疆雪莲水溶性多糖的分离纯化及组成分析
刘春兰 1＊ ,邓义红 1 ,杜　宁 1 ,徐桂云 2
1中央民族大学生命与环境科学学院 , 北京 100081;2中国科学院化学研究所 ,北京 100080
摘　要:为合理利用雪莲提供一定依据 ,对新疆天然雪莲进行多糖提取分离纯化。新疆天然雪莲经热水浸提,乙醇沉
淀得粗多糖。粗多糖经 Sevage法和酶法联合脱蛋白, 酸性乙醇分级, 得初步纯化的多糖 XL1 , XL2 , XL3。其中 XL3经
DEAE-SephdexA25分离纯化得纯化多糖 XL31。 XL31经检测为纯多糖。气相色谱分析表明新疆天然雪莲多糖 XL1 ,
XL2 , XL3和 XL31均为 Ara、Rha、Xyl、Gal、Glc、GalA六种单糖组成的酸性杂多糖 ,但单糖的摩尔比不同。
关键词:雪莲;多糖;分离纯化;组成
中图分类号:Q539;R284.2 文献标识码:A
Isolation, PurificationandCompositionAnalysisofWater-soluble
PolysaccharidefromXinjiangSausureainvolucrate
LIUChun-lan1＊ , DENGYi-hong1 , DUNing1 , XUGui-yun2
1CollegeofLifeandEnvironmentalScience, CentralUniversityForNationalities, Beijing100081 ,
China;2InstituteofChemistryChineseAcademyofSciences, Beijing100080 , China
Abstract:ToprovidescientificcuefortheuseofSausureainvolucrate, thecrudepolysaccharidewasextractedfromSau-
sureainvolucratewithhotwater, andprecipitatedbyethanol.Thecrudepolysaccharidehasbeeneliminatedproteinand
fractionatedbyacidicethanol.ThreefractionsXL1 , XL2 , andXL3 weregottenrespectively.ByusingDEAE-SephadexA-
25 gelfiltration, XL31 wasgoten.GCanalysisindicatedthatXL1 , XL2 , XL3 andXL31 werecomposedofAra, Rha, Xy,
Gal, GlcandGalA.Buttheirmolarratiosarediferent.
Keywords:Sausureainvolucrate;polysaccharide;isolationpurification;composition
　　雪莲(SausureainvolucrateKar.etKir.)系菊科凤
毛菊属的高山草本植物 ,是我国民族药中有代表性的
珍稀名贵药材。雪莲生长在海拔 4800 ～ 5800 m的高
山流石坡以及雪线附近的碎石间 ,难以采集 ,系国家
3级濒危物种。雪莲的化学成分主要有:黄酮类化合
物 ,糖类 ,萜类及其衍生物 ,甾体成分 ,木脂素 [ 1] 。目
前对野生和离体培养雪莲中主要活性物质黄酮类化
合物的检测研究较多 ,对其他药效上有独特作用的活
性成分如多糖等研究较少 ,仅有少量报道[ 2-5] 。本文
对产于新疆和静县的新疆雪莲进行水溶性多糖提取 ,
纯化 ,并进行多糖的组成分析。为进一步探讨雪莲多
糖的药理活性 ,进一步完善雪莲多糖的质量评价体系
和合理利用新疆雪莲提供依据。
1　材料与方法
1.1　仪器与材料
新疆天然雪莲 (SausureainvolucrataKar.et
Kir.)地上部分 ,由中央民族大学生命与环境科学学
院杨林老师鉴定 ,购自新疆和静县 。
标准单糖样品:葡萄糖、鼠李糖 、阿拉伯糖 、木糖 、
半乳糖 、半乳糖醛酸(生化试剂 ,西格玛化学公司)。
GC-2010型毛细管气相色谱仪(日本岛津);722
型光栅分光光度计 (上海分析仪器总厂);UV-Jas-
co53型紫外分光光度计(日本岛津);FC-95A馏分
自助收集器(上海青浦沪西仪器厂)。
1.2　方法
1.2.1　雪莲粗多糖的提取
准确称取干燥的雪莲 ,加入 95%的乙醇回流脱
脂后 , 85 ℃水浴加热水提乙醇沉淀 , 95%乙醇 、无水
乙醇洗沉淀去除单糖 ,离心 ,真空干燥后得去除单糖
的新疆天然雪莲多糖粗品(XJXL)。
1.2.2　雪莲粗多糖的确认及性质
硫酸-咔唑反应 [ 6] :糖醛酸与咔唑反应 ,生成紫
红色化合物 。
费林试剂反应[ 7] :还原糖中的还原性醛基可以
将费林试剂中的 Cu2 +还原成 Cu+ ,从而生成红色的
沉淀。
取粗多糖水溶液 10 mL,加入过量的斐林试剂
煮沸 2 min,将产生的红色沉淀趁热除去 ,滤液加入
硫酸酸化 ,加热煮沸 10 min后用 10%氢氧化钠中
和 ,再加入一定量斐林试剂 ,加热煮沸 ,观察是否有
砖红色沉淀 。
碘 -碘化钾反应:取粗多糖水溶液 10 mL,加入
碘化钾 -碘试剂 。
苯酚-硫酸反应 [ 8] :五碳糖类以及它们的双糖类
均能被硫酸分解成糠醛 ,六碳糖类以及它们的双糖
类同样地被分解成羟甲基糠醛 。这些糠醛类化合物
与苯酚作用产生橘红色缩合产物。
1.2.3　雪莲粗多糖的分离纯化
1.2.3.1　脱蛋白 [ 9] (酶法和 Sevage法联合脱蛋白)
称取一定量的粗多糖 , 溶解于蒸馏水中配成
2%溶液 ,加入链酶蛋白酶(日本进口生化试剂;蛋
白∶酶 =50∶1),在溶液的上层加几滴甲苯(防腐),
37 ℃保温 3 h。加入 1 /3体积氯仿与正丁醇混合液
(氯仿∶正丁醇 =4∶1),摇晃振荡 20 min, 3500r/min
离心分离 10 min,取水相 ,重复上述步骤几次 ,直到
无游离蛋白 ,常规干燥 ,得多糖 ,由紫外光谱法鉴定
结合蛋白的有无 。
1.2.3.2　酸性乙醇分级 [ 10]
将新疆天然雪莲脱蛋白后的多糖配成 2%溶
液 , pH=2.5的酸性乙醇分级 ,具体步骤如下:
2%新疆天然雪莲脱蛋白后多糖的水溶液中加入
pH=2.5的 95%乙醇至醇浓度达 30%,离心沉淀常规
干燥 ,得多糖 XL1。上清液中继续加入如上乙醇至醇浓
度达 50%,离心沉淀常规干燥 ,得多糖 XL2。上清液中
继续加入如上乙醇至醇浓度达 75%,离心沉淀常规干
燥 ,得多糖 XL3。上清液用 2mol/L的 NaOH调节至
pH=6 ～ 7,离心 ,无沉淀生成。
1.2.3.3　纯化多糖制备
加乙醇至醇浓度 70%以上所得干燥后沉淀采
用 DEAE-SephadexA-25分离纯化 ,用 0.5 mol/L的
NaCl溶液洗脱 ,流速 0.75 mL/min,分部收集 。
1.2.4　纯化多糖的纯度鉴定
1.2.4.1　纸层析[ 11]
滤纸:新华 1号中速滤纸(15cm×40cm),展开
剂:正丁醇∶浓氨水∶水 =60∶40∶5(v∶v∶v),展开时
间:7h,染色剂:0.5%甲苯胺蓝乙醇溶液 、95%乙醇
漂洗脱色 。
1.2.4.2　醋酸纤维薄膜电泳 [ 8]
试剂:0.025 mol/L硼酸盐缓冲液 , pH=12.5,
染色剂:0.5%甲苯胺蓝乙醇溶液 ,电压 250 V,电泳
时间 30min。
1.2.4.3　SephroseCL-4B(1.5 cm×90 cm)柱层
析[ 8]
取 5 mg多糖配成 10 mg/mL0.5 mL上样 , 0.1
mol/LNaCl溶液洗脱 ,流速 0.45mL/min,每管 2mL
收集 ,苯酚 -硫酸法检测 。
1.2.5　雪莲水溶性多糖 XL31的分子量测定 [ 12]
用 0.5 mL水溶解 5 mg标准葡聚糖上样 , 以
SepharoseCL-4B(90 cm×1.5 cm)层析 , 0.1 mol/L
NaCl洗脱 ,流速为 0.22 mL/min,分部收集 ,苯酚-硫
酸法测多糖分布 ,用已知相对分子质量的标准葡聚
糖(M2000, 1000, 500, 70, 40 kD)以洗脱体积为横
坐标 ,相对分子质量对数值为纵坐标 ,绘制 lgM-Ve
标准曲线 。
同样条件下测定 XL31的洗脱体积 ,与标准曲线
对照 ,求出相对分子质量 。
1.2.6　雪莲多糖的组成分析 ———GC方法
甲醇解及硅烷化处理 [ 13] :彻底干燥的糖样 10
mg,加入 1 mol/L盐酸 -无水甲醇 2 mL,充 N2封管 ,
80 ℃甲醇解 20 h,冷至室温后 ,用 KOH-甲醇中和至
pH=6,然后 40 ℃减压旋转蒸干 ,真空干燥过夜。
向彻底干燥的甲醇解产物中加入 0.2 mL无水吡啶
(内含饱和甘露醇做内标), 75 ℃溶解 30 min,然后
加入 0.3mL硅烷化试剂(六甲基二硅胺烷:三甲基
氯硅烷 =2∶1)摇匀 ,静止几分钟 ,即可取上清进行
分析 。与标准糖对照定性 ,归一化法定量[ 8] 。
GC条件[ 14] :OV-210毛细管柱 (30 m×0.32
mm×0.25 μm);柱温 100 ℃※250 ℃,程序升温 5
℃/min;载气:氢气;流速:1.5 mL/s;检测器:FID。
2　结果与分析
2.1　雪莲粗多糖的提取及理化性质
在提取条件下 ,新疆天然雪莲粗多糖(XJXL)的
提取为 15.9%。
100 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.20
XJXL是一种灰褐色粉末状固体 ,无味 ,溶于水 ,不
溶于乙醇 ,乙醚 ,丙酮 ,氯仿等有机溶剂。碘-碘化钾实
验无蓝色现象 ,说明 XJXL不含有淀粉。苯酚-硫酸反
应产生橘红色缩合产物 ,费林试剂反应说明 XJXL含有
还原糖。硫酸-咔唑反应生成紫红色化合物 ,可以鉴别
XJXL含有糖醛酸 ,说明 XJXL为酸性多糖。
2.2　新疆天然雪莲粗多糖的纯化
2.2.1　脱蛋白
按酶法和 Sevage法对新疆天然雪莲水溶性粗多
糖联合脱蛋白 ,得脱蛋白后多糖 ,其回收率为 63.44%。
脱蛋白前后 XJXL经紫外可见分光光度计扫
描 ,结果见图 1, 2。 XJXL脱蛋白后在 280 nm处无
特征吸收峰 ,说明此多糖是不含蛋白的多糖。
2.2.2　酸性乙醇分级
多糖 XJXL脱蛋白后经酸性乙醇分级得到三个
级分 ,在 pH=3 ～ 4的 30%乙醇浓度下沉淀得多糖
XL1。在 pH=4 ～ 6的 50%乙醇浓度下沉淀得多糖
XL2 ,在 pH=6 ～ 7沉淀得多糖 XL3。分别占粗多糖
的 80.73%, 2.74%, 16.52%。
2.2.3　DEAE-SephdexA25纯化
将三个级分经 SephroseCL-4B柱层析 ,苯酚 -硫
酸法检测多糖分布 ,结果表明多糖 XL1 , XL2分子量
分布范围较宽 ,多糖 XL3分子量分布范围较窄 ,在
粗多糖中所占比例相对较大 ,所以本实验选择多糖
XL3作为进一步纯化的对象 。
多糖 XL3经 DEAE-SephdexA-25柱层析纯化 ,
0.5 mol/LNaCl洗脱峰形相对较窄 , 且糖含量高。
故实验采用 0.5 mol/LNaCl为洗脱液 。
在 0.5 mol/LNaCl为洗脱液的条件下 ,根据硫
酸-苯酚法检测的结果合并相同峰位的组分 ,减压浓
缩至适当体积 ,常规干燥制备得多糖 XL31。
2.3　雪莲水溶性多糖 XL31的纯度鉴定及分子量确
定
XL31经 SephroseCL-4B(1.5 cm×90 cm)柱层
析 ,苯酚-硫酸法检测得一单一对称峰 ,醋酸纤维薄
膜电泳呈单一谱带 ,纸层析呈单一斑点 。说明它是
均一的纯多糖 。用凝胶洗脱法与标准葡聚糖对照测
XL31的分子量约为 170万。
2.4　雪莲多糖的组成分析
雪莲多糖 XL1 , XL2 , XL3和 XL31甲醇解及硅烷
化处理 ,经 GC分析 ,与标准单糖谱图(图 3 ～ 5和表
1 ～ 3)比较 ,结果见图 6 ～ 9和表 4 ～ 7。
表 1　标准单糖 Ara、Xyl、Gal、Glc对应的峰高位置
Table1　MonosaccharidesofsugarstandersofAra, Xyl, Galand
Glc
单糖 Sugar 峰位 PeaksNo.
Ara 1, 2, 3, 4
Xyl 5, 6, 7, 8
Gal 9, 10, 11
Glc 12, 13, 14, 15
图 3　单糖 Ara、Xyl、Gal、Glc标样的 GC谱图
Fig.3　 Gasofchromatogramofsugarstandersof
Ara, Xyl, GalandGlc
表 2　标准单糖 Rha和 Man对应的峰高位置
Table2　MonosaccharidesofsugarstandersofRhaandMan
单糖 Sugar 峰位 PeaksNo.
Rha 1, 2, 3, 4, 5
Man 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12
101Vol.21 刘春兰等:新疆雪莲水溶性多糖的分离纯化及组成分析
图 4　单糖 Rha、Man标样的 GC谱图
Fig.4　Gasofchromatogramofsugarstandersof
RhaandMan
表 3　单糖 Rha和 Man组成对应的峰高位
Table3　MonosaccharidesofsugarstandersofRhaandMan
单糖 Sugar 峰位 PeaksNo.
Gal-A 1, 2, 3, 4, 5, 6
图 5　单糖 Gal-A标样的 GC谱图
Fig.5　GasofchromatogramofsugarstandersofGal-A
表 4　XL
1
中各单糖组成对应的峰高位置
Table4　MonosaccharidesofXL1
单糖 Sugar 峰位 PeaksNo.
Ara 1, 2, 5, 7
Rha 3, 4, 6, 10
Xyl 8, 9
Gal 13, 14
Glc 17, 18, 20
Gal-A 11, 12, 15, 19, 21
图 6　 XL1的气相谱图
Fig.6　GCofchromatogramofXL
1
表 5　XL2中各单糖组成对应的峰高位置
Table5　MonosaccharidesofXL2
单糖 Sugar 峰位 PeaksNo.
Ara 1, 2, 5, 7
Rha 3, 4, 610
Xyl 8, 9
Gal 13, 14
Glc 17, 18, 20
Gal-A 11, 12, 15, 16, 19, 21
图 7　XL2的气相谱图
Fig.7　GCofchromatogramofXL2
表 6　XL3中各单糖组成对应的峰高位置
Table6　MonosaccharidesofXL
3
单糖 Sugar 峰位 PeaksNo.
Ara 1, 2, 5, 7
Rha 3, 4, 6, 10
Xyl 8, 9
Gal 13, 14, 19
Glc 17, 18, 21
Gal-A 11, 12, 15, 16, 20, 22
图 8　XL
3
的气相谱图
Fig.8　GCofchromatogramofXL3
表 7　XL
31
中各单糖组成对应的峰高位置
Table7　MonosaccharidesofXL31
单糖 Sugar 峰位 PeaksNo.
Ara 1, 2, 5, 7
Rha 3, 4, 6
Xyl 8, 9
Gal 12, 14, 15, 16, 17, 22, 23
Glc 11, 20, 21, 25, 26
Gal-A 10, 13, 18, 19, 24,
102 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.20
图 9　多糖 XL31的 GC谱图
Fig.9　GasofchromatogramofXL31
　　XL1 , XL2 , XL3三个级分单糖组成相同 ,均由半
乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、鼠李
糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)六种单糖残基
组成的酸性杂多糖 。但各单糖摩尔比不同 ,半乳糖
醛酸(GalA)占的比例最大 ,其次是阿拉伯糖(Ara)。
结果见表 8。
表 8　多糖 XL1 , XL2和 XL3的单糖组成摩尔比
Table8　Monosaccharidesandproportionofsinglesugarfrom
XL1 , XL2 andXL3
多糖种类
Type
Xyl
(mol)
Ara
(mol)
Rha
(mol)
Gal
(mol)
Glc
(mol)
GalA
(mol)
XL1 1.0 6.6 2.4 1.8 2.4 61.4
XL2 1.0 10.0 4.5 4.5 4.0 65.0
XL3 1.0 8.4 2.3 4.7 1.7 29.8
　　多糖 XL31经甲醇解硅烷化处理后进行 GC和酸水
解 PC分析。结果表明 ,多糖 XL31单糖组成为 Xyl、Ara、
Rha、Gal、Glc、GalA,摩尔比为 1∶11∶4∶18∶3∶9。XL31是
由六种单糖残基组成的酸性杂多糖 ,半乳糖(Gal)占的
比例最大 ,其次是阿拉伯糖(Ara)。
3　结论
　　本实验通过对新疆天然雪莲经热水浸提 ,乙醇
沉淀得粗多糖。粗多糖经 Sevage法和酶法联合脱
蛋白 ,得到的多糖进行酸性乙醇分级 ,得多糖的三个
级分 XL1 , XL2 , XL3。其中 XL3经 DEAE-SephdexA25
进一步纯化得纯化多糖 XL31。气相色谱分析表明
天然雪莲多糖 XL1 , XL2 , XL3和 XL31均为 Ara、Rha、
Xyl、Gal、Glc、GalA六种单糖残基组成的酸性杂多
糖 ,但单糖的摩尔比不同。
新疆天然雪莲多糖 XL31为首次从新疆天然雪
莲中分离得到的均一多糖 ,为结构的测定和生物活
性的研究提供了依据 。
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