全 文 ：中 ER水平的效果不是很理想 , 而给予小剂量甾体类雌激素后
刺激 ER相应增加 , 更好地维持 ER水平 , 使植物类雌激素更好
发挥作用。实验结果显示成骨细胞 BMP-2蛋白的表达及增殖
能力增加呈雌激素剂量依赖性 , 可能由于成骨细胞内 ER的维
持需要一定水平的甾体类雌激素。
　　综上所述 , 更年甘露饮加 1 /8最佳量雌激素即可明显提高
成骨细胞增殖及 BMP-2蛋白表达 ,较中药制剂更年甘露饮效果
好 , 与最佳量雌激素作用相近 , 此种方法可能作为一种治疗女
性 PMOP的新方法 , 但此类研究尚处于一个探索研究阶段 , 还
需要进一步用现代药理药化或临床实验更深层次地探明其作
用机制及药物量效关系等问题以指导临床。
4　参考文献
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〔2006-12-15收稿　 2007-01-20修回〕
(编辑　张　慧)
旋覆花素抑制内皮剥脱诱导血管炎症反应的研究
孙启玉　孟　芳　韩　梅　温进坤　
(河北医科大学基础医学研究所 河北省医学生物技术重点实验室 ,河北　石家庄　050017)
　　〔摘　要〕　目的　探讨旋覆花素抑制血管内膜增生的药理学机制。方法　 SD大鼠灌胃服用旋覆花素溶液 , 3 d后行球囊内皮剥脱术 ,术后继续
给药 ,于不同时间处死大鼠后检测各指标变化。结果　和对照组相比 , 旋覆花素能显著抑制内皮剥脱术后血管新生内膜的增生 ,降低内皮剥脱术引
起的血清 C-反应蛋白(CRP)、前列腺素 E2(PGE2)、丙二醛(MDA)水平的升高(P <0. 05),同时增加总抗氧化能力(TAOC)(P <0.05)。结论　旋覆
花素通过发挥抗氧化与抗炎作用 ,减缓了内皮剥脱后血管新生内膜的增厚。
〔关键词〕　旋覆花素;血管炎症;抗氧化
〔中图分类号〕　R543. 3　　〔文献标识码〕　A　　〔文章编号〕　1005-9202(2007)08-0710-04
Inu licin inh ib its vascu lar in flamma tion induced by de-endothelium
SUN Q i-Yu,MENG Fang, HANM ei, e t a l.
H ebe iK ey Laboratory ofM ed ical B iotechnology, In stitu te ofBasicM ed icine, Hebe iM ed ical Un iversity,
Sh ij iazhuang 050017, Hebe i, China
【Abstract】　Objective　To explore pharm acologica l mechanism o f inhibiting intima l hyperp lasia by inulicin.Methods　SD ra ts re-
ce ived arte ria l de-endo thelia lization p rocedure 3 days a fte r trea ted w ith inu licin. Inu licin w as g iven each day until the rats w ere k illed to test
the bio log ical substances in the blood samp le s.R esu lts　Com pared w ith contro l g roup, inulicin could significantly decrea se intim al hyperp la-
sia and leve ls o f C-reac tive p ro te in, prostag landin E2 and m a londia ldehyde induced by de-endothe lia liza tion(P <0. 05). In addition, inu licin
could increase tota l an tioxidant capac ity of m ode l g roup significantly (P <0.05).Conc lu sions　 Inu licin can inhib it intima l hyperp lasia in-
duced by de-endo thelium th rough the m echanism o f anti-inflamm ation and anti-oxida tion.
【Keyw ords】　 Inulic in;Vascu la r inflamm a tion;Anti-ox idation
基金项目:国家自然科学基金 (30472167), 河北省自然科学基金
(2005000722)
通讯作者:韩　梅(1961-),女 ,教授 , 博士生导师 ,主要从事心血管分子
生物学研究。
作者简介:孙启玉(1981-),女 ,硕士,主要从事心血管分子生物学研究。
　　旋覆花为菊科旋覆花属植物 ,是具有降气 、消痰 、止呕和抗
炎功效的常用中药。 我们在对旋覆花药效物质基础进行研究
过程中 , 从其氯仿抽提物中分离得到其有效部位旋覆花素 , 其
中的有效成分是旋覆花内酯 (ABL)及其双乙酰化同系物。以
往用体外培养的单核 /巨噬细胞研究其作用机制时发现 , ABL
能通过抑制 NF-κB与 DNA顺式元件的结合 , 降低环氧化酶-2
(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶( iNOS)基因表达活性及前列
腺素 E2(PGE2)和 NO合成 〔1〕。 ABL还能降低脂多糖诱导血管
内皮细胞促炎因子 COX-2和细胞间黏附分子-1( ICAM-1)的表
达 , 发挥抗炎作用 〔2〕。炎症反应在血管损伤早期新生内膜增生
和血管重塑中起关键作用 ,本实验通过观察旋覆花素对内皮剥
710 中国老年学杂志 2007年 4月第 27卷
脱后再狭窄模型大鼠炎症因子 C-反应蛋白 (CRP)、 PGE2及丙
二醛(MDA)、总抗氧化能力 (TAOC)的影响 , 进一步了解旋覆
花素抑制血管内膜增生的药理学机制。
1　材料与方法
1. 1　实验动物　清洁级雄性 SD大鼠 , 3月龄 , 280 ～ 320 g, 由
河北省实验动物中心提供。
1. 2　试剂与方法　旋覆花素由我校药学院提取鉴定:其乳液
ABL的含量为 2.67 m g /m l;CRP试剂盒(上海太阳生物技术有
限公司);PGE2试剂盒(RnDSystem 公司 );MDA和 TAOC试剂
盒(南京建成生物工程研究所)。 CRP、PGE2、MDA和 TAOC的
测定按试剂盒说明书进行操作。
1. 3　动物模型的复制和分组　将 SD大鼠随机分为 3组:正常
组(3只),手术对照组(15只)和手术给药组 (15只)。 其中手
术对照组和手术给药组大鼠再随机分为 5组(1、3、7、14和 21 d
组各 3只)。手术对照及手术给药组动物行主动脉内皮剥脱
术 〔3〕。手术给药组在术前 3 d及术后按 26 mg kg - 1 d -1灌
胃服用旋覆花素溶液;手术对照组服用同等容积的溶剂。两组
大鼠分别于术后 1、3、7、14、21 d时从股动脉放血处死。
1. 4　标本处理　收集血液标本 , 离心分离血清;取内皮剥脱段
主动脉血管 1 cm左右 , 置冷生理盐水中洗净残留血液。标本
均放入 10%福尔马林 /PBS中固定至少 24 h, 乙醇梯度脱水 ,低
温石蜡垂直定向包埋 , 5μm厚度切片 ,常规 HE染色 ,并于光镜
下观察。对血管组织切片进行图像学分析 , 计算内膜 /中膜厚
度之比( I M/ )。
1. 5　统计学处理　数据用 x±s表示 ,组间比较采用 t检验。
2　结　果
2. 1　血管组织形态学变化　内皮剥脱术后 1 d, 手术对照组及
手术给药组血管内膜完全消失 ,中膜暴露在表面。术后 3 d,手
术对照组血管内表面可见有增生的血管平滑肌细胞(VSM C)出
现。术后 7 d, 手术给药组血管内膜也出现轻度增生。术后
14 d,手术对照组血管内膜增厚明显大于手术给药组。 术后
21 d,血管新生内膜的增生更加显著 , 手术对照组的内膜厚度
已超过其中膜厚度 , 并且明显大于手术给药组(图 1)。
图 1　各组大鼠主动脉光镜观察(HE, ×40)
2. 2　各组大鼠血管 I M/ 比值　手术对照组与手术给药组大鼠
血管 I M/ 比值均较正常对照组 (0.03±0.01)明显增加 (P <
0. 01),手术给药组的 I M/ 比值明显小于手术对照组 ,在术后 7、
14、21 d时具有显著性差异(P <0. 01, P <0. 05)(表 1)。
表 1　大鼠主动脉 I M/ 比值(n=3, x ±s)
组别 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d
手术对照组 0 0.05±0.011) 0. 12±0.031) 0.68±0.101) 1.38±0.281)
手术给药组 0 0 0.07±0.021)2) 0. 48±0.061)3) 0.79±0.131)2)
　 1)与正常对照组比较 , 2)与手术对照组比较:P <0. 01;3)与手术对照
组比较:P <0. 05
2. 3　血清 CRP含量的变化　手术对照组与手术给药组血清
CRP含量均呈先上升后下降趋势。术后 1 d CRP含量与正常对
照组〔(4. 56±0.46)μg /m l〕相比明显上升 (P <0.01), 3 d达最
高峰(P <0.01),而后逐渐下降 ,在术后 21 d时仍高于正常水
平(P <0.05)。但是手术给药组血清 CRP含量上升幅度明显
小于手术对照组 ,特别是在术后 3、7和 21 d时 ,血清 CRP水平
明显低于手术对照组(P <0.05)(表 2)。
2.4　血清 PGE2含量的变化　术后 1 d, 手术对照组与手术给
药组血清中 PGE
2
含量与正常对照组〔(46. 07±3.42)pg /m l〕相
比均明显上升 (P <0. 01), 3 d达到最高峰(P <0. 01), 而后下
降 ,在术后 7、14和 21 d时仍高于正常水平(P <0. 01)。两组间
相比 ,手术给药组 PGE2含量在 3、7和 21 d时明显小于手术对
照组(P <0.05)(表 2)。
711 孙启玉等　旋覆花素抑制内皮剥脱诱导血管炎症反应的研究　第 8期
2. 5　血清 MDA水平的变化　手术对照组血清 MDA含量呈先
上升后下降趋势 , 在术后 3 d时与正常对照组 〔(6.97±0.96)
nm o l /m l〕比较上升达到最高(P <0. 01),而后随着术后时间的
延长有所下降 , 但仍高于正常水平(P <0. 01, P <0.05)。手术
给药组血清 MDA含量上升幅度明显小于手术对照组 , 在术后
14和 21 d时具有显著意义(P <0. 05)(表 3)。
2.6　血清中 TAOC水平的变化　手术对照组血清中 TAOC水
平与 MDA水平呈相反趋势 , 呈先下降后上升趋势。与正常对
照组〔(9. 32±0.95)U /m l〕比较 , 术后 3 d时下降到最低(P <
0.01),而后逐渐恢复。手术给药组血清中 TAOC水平在术后
21 d时基本恢复至正常水平 ,与对照组比较具有显著意义(P <
0.05)(表 3)。
表 2　血清 CRP和 PGE2含量变化(n=3, x ±s)
组别 CRP(μg /m l)
1 d　　　　3 d　　　　　7 d　　　　　14 d　　 　　21 d
PGE
2
(pg /m l)
1 d　　　　3 d　 　　　　7 d　　 　　　14 d　　　　21 d
对照组 8.10±0. 241) 9.07±0.331) 8.23±0.211) 7.57±0.401) 7.31±0. 451) 71.46±2.251) 83.95±4.111) 79.58±1. 281) 74.32±5.441) 76.77±1.531)
给药组 7.20±0. 171) 7.87±0. 171)3) 6.97±0.192)3) 7.23±0.121) 6.50±0.242)3) 70.72±2.031) 76.87±1.551)3)71.21±2.481)3)70.66±3.241)69.17±0.411)3)
　与正常对照组比较:1)P <0. 01, 2)P <0. 05;与手术对照组比较:3)P <0.05,下表同
表 3　血清 MDA和 TAOC含量变化(n=3, x±s)
组别 MDA(nmo l /m l)
1 d　　　　3 d　　　　　7 d　　　　　14 d　　 　　21 d TAOC(U /m l)1 d　　　　3 d　 　　　　7 d　　 　　　14 d　　　　21 d
对照组 8.81±1. 18 13.66±1.231) 12.53±2.111) 11.91±1. 491) 9.61±1. 312) 7.52±1.47 6.12±0.861) 7.01±1.942) 7.32±1. 022) 7.42±0.722)
给药组 8.68±2. 11 10.06±0.991)3) 9.62±1.182) 7.91±1.913) 7.01±0. 963) 8.12±1.53 7.02±1.012) 7.23±1.23 8.36±0. 60 9.19±0.843)
3　讨　论
　　经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)已广泛用于治疗冠状动
脉粥样硬化性心脏病 ,但 PTCA后发生的再狭窄严重影响了手
术的中远期疗效。已有研究证明 ,氧化应激所致炎性反应参与
了再狭窄的形成 〔4〕。过氧化氢 、超氧阴离子等活性氧能加重血
管损伤 , 促进 VSMC的增殖 〔5〕和凋亡 〔6〕;此外 , 还可激活 NF-κB
而促进炎性介质的产生与释放 , 加重血管炎症 〔7〕。 同时 , 炎性
介质还可以促进血管壁细胞产生大量反应性氧代谢产物
(ROS)。给予外源性的抗氧化剂 〔8〕或在血管损伤局部导入抗
氧化酶基因 〔9〕可减轻血管病变。
　　CRP是一种敏感的炎症反应标志物 ,在血管损伤早期即可
从血清中检测到高水平的 CRP。 CRP可促进内皮细胞分泌白
介素-8、单核细胞趋化蛋白-1、内皮素等 , 发挥促炎作用 〔10〕。
PGE2亦是一种重要的炎性介质。本实验中发现 , 血管内皮剥
脱术后 , 血清中两种炎性介质的水平显著增高 , 在术后 3 d达到
高峰 , 而后略有下降但仍维持在较高水平。同时伴有体内
TAOC的显著下降 ,与之相应的脂质过氧化产物 MDA的含量显
著上升。结果表明 , 血管内皮剥脱可激活体内的氧化应激系
统 , 这可能是导致血管炎症的原因之一。 TAOC反映了机体对
ROS的清除能力 ,该防御体系有酶促与非酶促两个体系。酶促
系统包括 SOD、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、过氧化氢酶
(CAT)等。非酶促系统主要由维生素 、氨基酸和金属蛋白质组
成 , 包括维生素 C、维生素 E、半胱氨酸 、转铁蛋白等。它们之间
协同作用清除体内 ROS。影响 TAOC的因素很多 , 例如:饥饿 、
创伤 、微量元素和维生素的吸收等。MDA是活性氧攻击多不饱
和脂肪酸的最终产物之一 ,其水平变化可反映体内清除氧自由
基的能力。给予旋覆花素治疗后与手术对照组相比 , 血清 CRP
与 PGE2的水平显著下降 ,内皮剥脱诱导的 TAOC降低被扭转 ,
MDA的水平也有明显的降低。表明旋覆花素具有提高机体清
除 ROS、减轻炎症反应 、抑制炎性介质产生的药理作用。该药
物可降低内皮剥脱大鼠体内的炎症反应与氧化损伤。主动脉
形态学观察显示旋覆花素显著抑制了术后血管新生内膜的增
厚 ,而新生内膜的形成和炎症反应与氧化应激是密切相关的。
　　总之 ,旋覆花素能够升高内皮剥脱大鼠体内降低的 TAOC,
减轻过氧化产物对血管的损伤作用 , 通过发挥抗氧化与抗炎作
用 ,减缓内皮剥脱后血管新生内膜的增厚。 因此 , 该药物具有
良好的临床应用前景。
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〔2006-07-13收稿　 2006-11-21修回〕
(编辑　曹梦园 /张　慧)
人胚肺间充质干细胞体外培养及生物学特性的实验研究
彭丽萍　于振香　吕晓红　姚　成 1　(吉林大学第一医院呼吸科 ,吉林　长春　130021)
　　〔摘　要〕　目的　建立体外培养人胚肺间充质干细胞(MSC s)的培养体系并探讨其部分生物学特性。 方法　取 3 ～ 5个月的流产胎儿 ,按照人
骨髓 M SC s的体外培养方法 ,获得贴壁的人胚肺细胞 ,研究其形态 、细胞周期和体外诱导分化潜能。结果　人胚肺 M SC s可在体外扩增培养 ,可传至
17代以上 ,其形态及生长特点不发生明显改变 ,处于 G0 /G1 期的细胞多 ,具有典型的干细胞增殖特点。其免疫表型与骨髓来源的 MSC s相似。结论
　从人胚肺中可分离培养出 MSC s,可以在体外扩增 ,并可诱导向成骨 、软骨和脂肪细胞分化。
〔关键词〕　人胚胎肺;间充质干细胞;生物学特性
〔中图分类号〕　R563;R446. 6　　〔文献标识码〕　A　　〔文章编号〕　1005-9202(2007)08-0713-03
基金项目:吉林省科技厅资助课题(200505184)
1　吉林大学第一医院血液科
通讯作者:姚　成(1956-),男 ,教授 , 硕士生导师 ,主要从事血液系统疾
病研究。
作者简介:彭丽萍(1964-),女 ,副教授 , 医学博士 ,主要从事呼吸内科疾
病研究。
　　间充质干细胞 (m esenchym al stem ce lls, MSC s)是来源于中
胚层的一类多能干细胞 , 具有分化为成骨细胞 、脂肪细胞 、软骨
细胞 、肌肉细胞 、神经细胞 、上皮细胞等多项潜能 〔1〕。 MSC s能
在体外分离 、培养和扩增 ,且免疫原性低。目前已在人骨髓 、肝
脏 、脾脏 、肌肉 、脑 、皮肤 、脂肪等组织中证明有 MSC s存在 〔2～ 5〕 ,
但对人胚肺的 MSC s的生物学性状尚少有报道。本研究旨在为
今后进一步开展肺成体干细胞研究提供实验基础。
1　材料与方法
1. 1　材料　选取 15例水囊引产胎儿 , 胎龄 3 ～ 5个月。
1. 2　MSC s的分离和培养 取胎儿肺脏 ,用 D-H ank′s液反复冲
洗 , 剪成碎块 ,用 0. 2%Ⅱ型胶原酶 (Sigm a)消化 , 37℃、30 m in,
过 100目钢网 ,制成单细胞悬液 , 细胞密度为 2×106 /m l, 用含
DMEM /F12,MCDB-201, 2%FCS(G ibco BRL公司 )培养液 , 置
37℃, 5%CO2培养箱培养 , 3 d后换液 , 弃去非贴壁的细胞 , 以
后每 3 d半量换液。当细胞达 80% ～ 90%融合时 , 0. 25%胰酶
(S igm a)常规消化传代。
1. 3　细胞形态学观察　取 1 ～ 7代 MSC s, 置于有小玻片的
3. 5 cm直径平皿中 , 37℃, 饱和湿度 , 5%CO
2
培养 12 d后取出 ,
空气风干 , 瑞士染色 ,油镜下观察细胞形态。
1. 4　细胞周期的测定　M SC s细胞周期分析的主要试剂:RNA
酶 I(TaKaRa), 碘化丙啶 (P I, Sigm a)。将胎儿肺 MSC s消化 ,
70%冷乙醇 4℃固定 30 m in, PBS液洗涤细胞 2遍 , 5 μg /m l P I
染色(室温 , 5 m in), 用流式细胞仪(FACSV an tage型)检测 , M od
F IT软件分析结果。
1. 5　体外诱导分化的检测　当细胞达 80%融合时 , 以 5 ×
103 /cm2接种于 25 cm2培养瓶和 6 cm 直径的培养皿 , 成骨分
化体系 10- 7 mo l /L地塞米松 、 10 mmo l /L β-磷酸甘油 、 0.05
mm o l /L维生素 C和 10%FCS的 IMDM;脂肪分化体系含 10- 6
m ol /L 地 塞 米 松 、 0.5 mmo l /L 3-isobu ty l-1-m ethy lxan thine
( IBMX)、0. 1 mmo l /L维生素 C和 10%FCS的 IMDM;成软骨分
化体系 DMEM-HG、MCDB、 2% FCS、地塞米松 10- 7mo l /L、 TGF
10 ng /m l。在第 3、5、7、9和 11天分别检测钙化小结 、脂肪滴 、
碱性磷酸酶染色 、苏丹黑染色 、骨钙蛋白及脂蛋白脂酶等基因
的表达 , 从而鉴定 M SCs向成骨和成脂肪细胞分化潜能。阿尔
新蓝染色法检测蛋白多糖 ,免疫组化法检测 Ⅱ型胶原 , RT-PCR
法检测Ⅱ型胶原基因表达等 , 从而鉴定人胚肺 MSC s向成软骨
细胞分化潜能。
2　结　果
2. 1　人胚肺 M SCs的一般生物学特性 单个核细胞培养 48 ～
72 h后 ,在镜下可见散在的贴壁细胞 , 呈典型纺锤样成纤维细
胞状 , 7 ～ 10 d形成放射状克隆 , 挑出 20个克隆分别培养 , 约
1 w形成致密的贴壁细胞层 , 细胞形态均一 , 生长速度快 , 易被
胰酶消化 , 可传至 17代以上 , 其形态及生长特点不发生明显改
变。以下描述中将此类细胞称为人胚肺贴壁细胞 ( feta l
lung-de rived adhe rent ce ll, FLAC)(图 1)。
2. 2　细胞周期测定　用流式细胞仪测定第 11、 15代 MSC s的
DNA含量 , 可见处于 G0 /G1 期的细胞多, 分别为 95. 34%、
95.68%, S期少 , 分别为 4. 13%、 3. 58%。 提示体外培养的人
M SCs具有典型的干细胞增殖特点 , 即只有少数细胞处于活跃的
增殖期。
2. 3　MSC s多系诱导分化的鉴定　FLAC在成脂肪诱导体系中
培养 3 d,细胞由成纤维细胞样逐渐收缩变短 , 成为立方形或多
角形。连续培养 7 d, 镜下可见细胞内有微小脂滴出现 , 随着时
间的延长 , 脂滴逐渐增大融合。培养 2 w时 , 可见融合成团的
713 彭丽萍等　人胚肺间充质干细胞体外培养及生物学特性的实验研究　第 8期