全 文 ：2006年 9月
September 2006
色 谱
Chinese Journa l of Chrom atography
Vo.l 24 No. 5
508 ～ 512
收稿日期:2006-04-11
第一作者:赵京山 ,男 ,讲师 , E-m a il:zjs10@ sina. com.
通讯联系人:温进坤 ,男 ,教授 ,博士生导师 , T e l:(0311)86265563, E-m ail:w jk@hebmu. edu. cn.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No. 30270499)和河北省自然科学基金资助项目(No. 303454).
在线推扫富集-胶束电动毛细管色谱检测旋覆花素中
和大鼠血浆中的旋覆花内酯
赵京山 , 　温进坤 , 　韩　梅
(河北医科大学基础医学研究所 河北省医学生物技术重点实验室 , 河北 石家庄 050017)
摘要:采用熔融石英毛细管 ,以含有 50mmol /L十二烷基硫酸钠的 50 mmol /L硼酸盐缓冲液为电极缓冲液 , 以 10
mmol /L硼酸盐缓冲液为上样缓冲液 , 经过对分离条件的优化 , 成功地建立了胶束电动毛细管色谱结合在线
sweep ing(推扫)富集技术检测中性脂溶性物质 旋覆花内酯(acetylbritann ilactone, ABL)的实验方法。所建方
法的批内 、批间测定值的相对标准偏差均小于 5%, 灵敏度为 0. 005 g /L,回收率大于 92%;被检测样品的含量与峰面
积呈良好的线性关系 , 相关系数为 0. 997 5。用所建立的方法检测了旋覆花素中 ABL的含量及其在体内的动态变
化 , 结果表明胶束电动毛细管色谱结合在线 sweep ing样品富集技术可显著提高检测的灵敏度。该方法具有操作
简单 、进样量小(nL级)、检测速度快等特点 , 弥补了毛细管电泳在测定痕量组分方面的不足。
关键词:胶束电动毛细管色谱;sweep ing在线富集技术;旋覆花内酯;旋覆花素;大鼠血浆
中图分类号:O658　　文献标识码:A　　文章编号:1000-8713(2006)05-0508-05　　栏目类别:研究论文
Determ ination of Acetylbritann ilactone in Inulicin and
Rat P lasma byM icellar E lectrokinetic Capillary
Chromatography w ith On-L ine Sweeping
Concentration Techn ique
ZHAO Jingshan, WEN Jinkun, HAN Mei
(Key Laboratory forM edica l Biotechnology ofH ebei Province, Institute of BasicM edicine Science,
HebeiM edical University , Shijiazhuang 050017 , China)
Abstract:A method was established for the determ ination of acetylbritannilactone (ABL) in
inulicins and rat plasma bym icellar electrokinetic capillary chrom atography (MECC), in which
on-line sw eeping techniquewas applied to elevate the sensitivity of the detection. The column
used was an uncoated fused silica capillaryw ith a s ize of57 cm (effective length of50 cm)×75
μm .i d. E lectrode buffer w as a 50 mmol /L borate buffer contain ing 50 mmol /L sodium lauryl
su lfate (SDS) (pH 9.5). Sample buffer w as a 10 mmol /L borate buffer (pH 9.5). O ther con-
ditions were as fo llow s:separation voltage, 23 kV;detection w avelength, 195 nm;sample in-
jection, 3.45 kPa (0.5 psi)×5 s;column temperature, 25℃. T he on-line sweeping-MECC had
excellent linearity w ith correlation coefficient of 0.997 5, and reproducib ility w ith the relative
standard dev iation of ABL m igration time less than 5%. The recovery was more than 92%, and
the sens itivity w as 0.005 g /L. ABL in inulicin and their dynam ic change in vivo w ere deter-
m ined by sweeping-MECC. The results indicate that on-line sw eeping-MECC is a s imple and
rapid method for the determ ination of trace bio log ical sample. The m ethod needs only m icro-
amount of samples, and is characterized by higher degree of automation and sens itivity.
K ey words:m icellar electrokinetic capillary chrom atography (MECC);on-line sw eeping tech-
nique;acetylbritannilactone;inulicin;rat p lasma
　　中药旋覆花为菊科旋覆花属植物 ,具有降气 、止
吐 、消痰 、活血化瘀作用 [ 1] ,是中医常用药物之一 。
现代药理学研究表明 ,旋覆花含有镇痛 、消炎的活性
成分。在既往研究中 ,经过对旋覆花石油醚 、正丁
　第 5期 赵京山 ,等:在线推扫富集-胶束电动毛细管色谱检测旋覆花素中和大鼠血浆中的旋覆花内酯
醇 、氯仿等有机溶剂抽提物进行药效学筛选 ,发现其
氯仿抽提物 [ 2]含有抗炎镇痛的有效成分 ,并将其命
名为旋覆花素 ( inulicin)。经闪式柱色谱对旋覆花
素进行多次再分离 [ 2] ,得到一种单体有效成分
旋覆花内酯 (acetylbritannilactone, ABL)。 ABL的
发现为旋覆花的品质鉴定和旋覆花素的质量控制提
供了评价标准。 ABL含量的测定可采用反相高效
液相色谱 (RP-HPLC)方法 , 但该方法灵敏度较
低 [ 3] 。本实验采用胶束电动毛细管色谱 (MECC)
结合在线 sweeping(推扫)富集技术 [ 4 - 8] ,以十二烷
基硫酸钠(SDS)为胶束相 ,检测旋覆花素中的 ABL
含量及其在体内的动态变化 ,以探讨 MECC法结合
在线 sweeping富集技术在生物样品分析和药代动
力学研究方面的应用 。
1　实验部分
1. 1　仪器和试剂
　　P /ACETM MDQ毛细管电泳仪 、光电二极管阵
列 (PDA)检测器及 MDQ 数据分析系统 (美国
BECKMAN公司 );0.2 μm 微孔滤膜 (上海兴亚净
化器材厂)。硼酸 、硼砂 、盐酸 、NaOH等试剂为国产
分析纯;甲醇为色谱纯;SDS为 Sigm a公司产品;旋
覆花素 、旋覆花内酯由河北医科大学药学院分离纯
化 ,采用红外光谱 、核磁共振法对其进行表征 ,并由
该院新药开发研究室对其进行鉴定。
1. 2　MECC条件
　　熔融石英毛细管总长度 57 cm ,有效长度 50
cm ,内径 75 μm(河北锐沣色谱器件公司 );电极缓
冲液为 50 mmol/L硼酸盐缓冲液 ( pH 9.5,含 50
mmol /L SDS);上样缓冲液为 10mmol /L硼酸盐缓
冲液(pH 9.5);检测波长 195 nm;分离电压 23 kV;
正极进样 3.45 kPa×5 s;检测温度 25 ℃。第一次
运行压力为 0.13 MPa(20 psi), 再依次用 0.1
mol /L HC l冲洗 5m in,三次蒸馏水冲洗 2 m in, 0.1
mol /L NaOH冲洗 5 m in,三次蒸馏水冲洗 2 m in,
电极缓冲液冲洗 5 m in,最后用电极缓冲液平衡 10
m in。在每两次运行之间将毛细管用 0.1 mol /L
NaOH及电极缓冲液各冲洗 2 m in[ 9] 。
1. 3　检测波长及峰纯度分析
　　采用 PDA检测器进行三维全波长扫描 ,确定电
泳检测的理想波长。对理想电泳图谱中的 ABL峰
采用波谱分析的方法来确定其是否为单一成分峰。
1. 4　给药及样品预处理
　　SD(Sprague-Daw ley)大鼠 6只 ,分为空白对照
组和给药组 ,每组 3只 。给药组每天灌胃给予 3mL
旋覆花素 , 连续给药 5 d后 ,自内眦静脉取血 300
μL,以 3 000 r /m in的速率离心 10 m in,分离血浆。
以乙腈为蛋白质沉淀剂沉淀血浆中的蛋白质 。取
100 μL上清液加入等体积的乙腈 ,用涡旋振荡器振
荡 30 s,混匀 ,以 10 000 r /m in的速率离心 10 m in,
取上清液置于 -20 ℃冰箱内保存备用 。
1. 5　MECC方法的评价
1. 5. 1　重复性试验
　　取同一样品分为 15份 ,每 5份为一批 ,置于
-20 ℃冰箱中保存 。每隔 3 d测定一批 ,每批重复
测定 3次 ,每份重复测定 2次 ,测出 ABL的迁移时
间 ,并计算其平均值及批内 、批间差异。
1. 5. 2　线性关系和灵敏度试验
　　取 1.5 g /L ABL溶液 ,经倍比稀释得到不同浓
度的溶液 ,再依次经 sweeping-MECC法检测 ,按信
噪比为 3计所建方法的最低检测限 ,并确定峰面积
和 ABL浓度之间的线性关系。
1. 5. 3　回收率试验
　　用对照组大鼠血浆配制质量浓度为 0.15 g /L
ABL的血浆样品溶液共 6份 ,每份 20 μL ,每 3份为
一组 。两组中分别加入 5 g /L的 ABL标准溶液 1
μL和 3 μL,按 “1. 4”节所述进行样品预处理 。取上
清液经 sweeping-MECC法检测 ,计算回收率。
1. 6　统计方法
　　利用 P /ACETM MDQ 毛细管电泳仪自带的
MDQ分析软件分析电泳图谱;其他数据采用 SPSS
10.0统计软件进行分析 。
2　结果与讨论
2. 1　MECC分离及 sweeping在线富集
　　毛细管电泳虽然有多种分离模式 ,但能将中性
物质和带电物质同时分离的方式只有 MECC模式。
MECC模式的原理为在电极缓冲液中加入表面活
性剂 SDS、胆酸钠等 ,当电极缓冲液中的表面活性剂
浓度超过临界胶束浓度时便在电极缓冲液中形成胶
束(假固定相),中性物质在水相和胶束相之间按分
配系数的不同进行分配;不同的带电物质因其所带
的电荷种类和数量不同在电场力的作用下得到分
离 ,从而完成中性物质和带电物质的分离。旋覆花
素中既有带电物质又有中性物质 ,而其中的有效成
分 ABL是一个中性的脂溶性物质 , 因此可选用
MECC模式进行检测。但 MECC也像其他毛细管
电泳方法一样 ,受紫外检测器 、检测光程和进样量的
限制 ,检测灵敏度不是很高 ,使得该技术在检测痕量
物质时受到一定的限制 [ 4 - 5] ,因而目前采用 MECC
法直接检测血浆中药物成分的报道较少 。为了提高
MECC法的检测灵敏度 ,以便将其直接用于生物样
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色 谱 第 24卷
品和药代动力学的研究 ,本研究尝试将 MECC模式
和 sw eeping在线样品富集技术联合用于血浆中微
量 ABL的检测 。
　　在线推扫样品富集技术是一种可用于 MECC
模式下毛细管中的样品富集方式。这种方式最初由
Gilges等建立并报道 [ 10] ,此后又有一些学者对此进
行了理论研究[ 11 - 14] ,但将该技术用于实际样品检测
的报道较少 。用 sweeping富集样品时 ,样品带一般
不含胶束 ,而含有表面活性剂的电极缓冲液作为背
景胶束相 ,在其穿过样品带时 ,由于样品与胶束的相
互作用 ,样品会随着胶束一起移动 ,使样品带得到压
缩从而实现富集 。不使用 sweeping富集技术时 ,未
能检出给药组动物血浆中的 ABL峰 , 而样品经
sw eeping富集后可以检出 ABL的色谱峰 。这些结
果表明 ,MECC结合 sw eeping在线样品富集技术 ,
可有效地提高检测的灵敏度。
图 2　ABL标准品的 MECC图谱
F ig. 2　MECC of a ABL standard
a. capillary electropherogram of the ABL standard under optional conditions;b. three-d imensional chrom atogram of theABL stand-
a rd;c. UV spectrum of the peak at 13. 36 m in.
　　Conditions:uncoated fused sil ica capillary (57 cm ×75μm .i d. );voltage, 23 kV;pressure of injection, 3. 45 kP a(0. 5 psi)×5 s;
running buffer, 50mmo l/L bora te buffer(pH 9. 5) conta ining 50mmol /L SDS;sample buffer, 10mmol /L borate buffer(pH 9.5);de-
tection waveleng th, 195 nm;colum n tem perature, 25℃.
2. 2　Sweeping-MECC条件的优化
　　实验比较了磷酸盐 、Tris-乙酸 、T ris-硼酸 、T ris-
磷酸和硼酸盐等缓冲体系 ,结果发现 ,相同离子强度
的缓冲液中硼酸盐缓冲液的分离度最好 ,因此本实
验选用硼酸盐缓冲体系作为电极缓冲液 ,并进一步
考察了电极缓冲液的离子强度和上样缓冲液对样品
富集以及分离度的影响。实验发现 ,硼酸盐缓冲液
浓度为 20 ～ 100 mmol/L时 ,随着缓冲液离子强度
的增大 ,分离度增加 ,但对样品富集影响不大 。 50
mmol /L硼酸盐缓冲液能使样品达到基线分离 。实
验中还考察了以 50 mmol /L pH 9.5硼酸盐为电极
缓冲溶液时 ,不同浓度 (0, 20, 40, 60, 80 mmol /L)的
SDS对富集效果的影响。实验结果表明 , SDS浓度
小于 20 mmol/L时不能检出 ABL峰 ,在 20 ～ 80
mmol /L范围内 , SDS的浓度与样品的富集程度正
相关 。表面活性剂浓度越高 ,形成的胶团数量越多 ,
对样品的富集效果越好 。但随着 SDS浓度的增加 ,
电流也随之增大 ,使焦耳热增加 ,造成基线不稳。故
本实验选用含 50 mmol/L SDS的 50 mmol/L硼酸
盐缓冲液为电极缓冲液 ,以不含 SDS的低浓度 (10
mmol /L)硼酸盐缓冲液为上样缓冲液进行在线
sweeping富集 ,使检测灵敏度显著提高 ,富集倍数
达 125倍(见图 1)。
图 1　Sweeping样品富集技术对 ABL检测灵敏度的影响
Fig. 1　E ffect of on-line sweep ing techn ique on
the detection sensitivity ofABL
a. sweeping techn ique applied;b. w ithout sw eeping tech-
nique.
　　设定分离电压 23 kV、压力进样 3.45 kPa×5 s
和样品浓度 0.015 g /L,考察电极缓冲液的 pH值对
样品富集效果的影响。结果表明 ,样品峰高随着缓
冲溶液 pH值的升高而增加;当缓冲液的 pH为 9.5
时 ,样品峰高达到最大值 ,即富集效果最好。因此选
择 pH 9.5作为电极缓冲液的最佳 pH值 。
　　运行电压对样品富集效果的影响不大。随着电
压升高 、电流增大 ,样品迁移时间逐渐变短。综合样
品迁移时间和电流的影响 ,运行电压选为 23 kV。
　　通过对实验条件逐一优化 ,得到 “ 1.2”节所述
电泳条件 。优化条件下的图谱见图 2。
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　第 5期 赵京山 ,等:在线推扫富集-胶束电动毛细管色谱检测旋覆花素中和大鼠血浆中的旋覆花内酯
2. 3　方法学评价
　　重复性试验结果 (见表 1)显示 , 3批样品每批
测定 3次的批内 、批间测定的迁移时间的相对标准
偏差(RSD)均小于 5%;线性关系分析显示 , ABL的
质量浓度为 0.005 ～ 1.5 g /L时与峰面积的线性关
系良好 ,相关系数为 0.997 5;最低检测限为 0.005
g /L(S N/ =3);回收试验结果 (见表 2)表明 ,该方
法的回收率大于 92%。以上结果说明所建方法的重
复性 、最低检测限和回收率均能满足微量药物检测
的需要 。
表 1　重复性试验结果
Tab le 1　Results of reproduc ib ility test of ABL
Ba tch Group
M ig ra tion time /m in
(±SD, n =10)
RSD /%
intra-
g roup
(n =5)
intra-
batch
(n =3)
inter-
batch
(n =3)
1 1 13. 44±0. 32 2. 45
2 13. 17±0. 21 1. 63 2. 82
3 13. 43±0. 53 3. 99
2 1 13. 15±0. 36 2. 72
2 13. 22±0. 58 4. 42 2. 94 3. 27
3 13. 40±0. 13 0. 98
3 1 13. 51±0. 55 4. 11
2 13. 40±0. 58 4. 34 3. 90
3 13. 56±0. 55 4. 09
表 2　回收试验结果(n =3)
Table 2　Resu lts of recovery test ofABL (n =3)
Backg round /
μg
Added /
μg
Found /
μg
Recovery /
%
3 5 7. 6 92. 0
3 15 17. 4 96. 0
2. 4　样品测定
　　利用本文所建立的 sw eeping-MECC方法分别
检测了旋覆花素中和大鼠血浆中 ABL的含量 。前
者组成成分简单 ,可采用外标法确定 ABL峰;后者
成分相对复杂 ,因此以 ABL为内标物 ,采用叠加法
确定 ABL峰。
　　图 3-a, b分别为旋覆花素和 ABL标准品的电
泳图谱 ,从而可以确定旋覆花素中的 ABL峰 。
　　将实验大鼠灌胃给药 0.5, 1.5, 3, 6, 8 h后 ,检测
其血浆中 ABL的动态变化。图 4-a, b分别为空白对
照组和给药组 (给药 1.5 h)大鼠血浆样品的电泳图
谱。结果显示 ,空白对照组未检出 ABL峰 ,给药组在
保留时间为 13.36m in时有 ABL峰出现 ,说明MECC
结合 sweeping在线富集可显著提高检测的灵敏度。
　　图 5所示结果表明 ,给药后 1.5 h时 ABL的质
量浓度在血浆中达到高峰 ,此后随着时间的延长而
逐渐下降。至于旋覆花素的其他成分及 ABL在体
内的生物转化将另文报道 。
图 3　外标法测定旋覆花素中 ABL的电泳图谱
F ig. 3　E lec tropherogram s ofABL in inu lic in
w ith external standardmethod
a. inu lic in;b. ABL standard.
图 4　(a)空白对照组大鼠血浆和(b)给药组
给药 1. 5 h时大鼠血浆的电泳图谱
F ig. 4　E lectropherogram s of rat plasm a of
(a) blank contro l and (b) drug group at
1. 5 h after adm inistration of inu lic in
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图 5　给药后不同时间 ABL的血药浓度
F ig. 5　ABL con cen trations in plasm a after adm ini-
stered inu lic in for differen t tim es
3　结论
　　本实验建立了一种采用 sw eeping-MECC技术
检测中药有效成分及其血药浓度的分析方法。该方
法具有操作简单 、分离高效 、检测灵敏的特点 ,简化
了样品预处理的繁琐过程 ,缩短了分离周期 ,弥补了
毛细管电泳在测定痕量组分方面的不足。
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