全 文 ：ISSN　1007-7626
CN　11-3870 Q
中国生物化学与分子生物学报
Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology
2006 年 1月
22(1):55 ～ 58
收稿日期:2005-03-08 ,接受日期:2005-06-28
北京市教委科学和技术发展计划资助项目(No.00KJ108)
＊联系人 Tel:(010)63051488 , E-mai l:chenrui46@126.com
Received:March 8 , 2005;Accepted:June 28 , 2005
Supported by Science and Technology Development Program of Beijing Education Committee(No.00KJ108)
＊Corresponding author Tel:(010)63051488, E-mail:chenrui46@126.com
小鼠短暂前脑缺血海马中半胱天冬酶-3酶原表达的变化
刘天会1) , 　陈　瑞2)＊ , 　杜艳玲2)
(1)首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心 , 北京　100050;
2)首都医科大学生物化学与分子生物学系 , 北京　100054)
摘要　通过测定脑缺血再灌注时海马中半胱天冬酶-3酶原(procaspase-3)的表达变化 ,从细胞凋亡
的角度探讨脑缺血再灌注损伤的分子生物学机制及 procaspase-3的活化机制.将 C57BL 6N小鼠随
机分为假手术组(正常对照组)、缺血再灌注组(I R组),后者夹闭双侧颈总动脉 20 min后再通血
流 ,建立前脑缺血再灌注模型 ,分别于再灌注 6 h 、12 h 、24 h 和 48 h取海马.采用蛋白免疫印迹
(Western blotting)方法检测海马中 procaspase-3的表达变化.结果显示 ,12 h I R及24 h I R组海马中
总procaspase-3水平与假手术组相比有明显升高 ,且差异有统计学意义(P <0.05);24 h I R组海马
中去磷酸化水平与假手术组相比有明显升高 ,且差异有统计学意义(P<0.05);而各组 procaspase-3
磷酸化水平与假手术组相比差异无统计学意义.结果提示 ,脑缺血再灌注损伤诱发 procaspase-3表
达增加;其中 procaspase-3去磷酸化水平高明显 ,提示脑缺血再灌注损伤可能诱发 procaspase-3去磷
酸化 ,继而促进 procaspase-3转化为活性形式.
关键词　脑缺血再灌注;半胱天冬酶-3酶原;磷酸化;去磷酸化
中图分类号　Q255;Q78
Expression of Procaspase-3 in the Mouse Hippocampus after
Transient Forebrain Ischemia
LIU Tian-Hui1), CHEN Rui2)＊ , DU Yan-Ling2)
(1)Liver Research Center , Beijing Friendship Hospital , Affiliate of Capital University of Medical Sciences , Beijing　100050, China;
2)Department of Biochemistry and Molecular Biology , Capital University of Medical Sciences , Beijing　100054 , China)
Abstract　The expression of procaspase-3 in hippocampus following transient forebrain ischemia was explored ,
and the possible relationship of ischemia reperfusion and procaspase-3 activation was observed.C57BL 6N
micewere divided into two groups:sham -operated group (control), and ischemia reperfusion group (I R
group).Transient forebrain ischemia was induced by bilateral common carotid occlusion (BCCAO)for 20
minutes.Hippocampus sections were obtained at reperfusion time points of 6 hours , 12 hours , 24 hours and 48
hours respectively after 20 minutes of ischemia.Western blotting was used to detect the level of procaspase-3.
Total procaspase-3 level increased in hippocampus at reperfusion time points of 12 hours and 24 hours post-
BCCAO , and the dephosphorylated procaspase-3 level increased in hippocampus at reperfusion time point of 24
hours post-BCCAO.The increased expressions were significant(P <0.05)when compared with expression
level in sham-operated mice.While the phosphorylated level did not change significantly .These data indicated
that ischemia reperfusion upregulated procaspase-3.Further observation found out that the increase of
dephosphorylated form of procaspase-3 was higher than the increase of phosphorylated form of procaspase-3
upon cerebral ischemia reperfusion injury , which indicated that cerebral ischemia reperfusion injury possibly
induced procaspase-3 dephosphorylate , and then activated procaspase-3 into active caspase-3.
Key words　cerebral ischemia reperfusion;procaspase-3;phosphorylation;dephosphorylation
　　脑缺血后神经元有两种死亡方式 ,除了缺血中
心区的急性神经元坏死之外 ,还在轻 、中度缺血的区
域出现选择性神经元缺失 ,且需时间较长 ,这种神经
元死亡称为迟发性的神经元死亡.国内外大量的研
究结果证明 ,这种迟发性的神经元死亡具有典型的
细胞凋亡的形态特征 ,它的本质是凋亡[ 1 , 2] .而再灌
注作为凋亡刺激因素会诱发凋亡 ,使神经元凋亡提
早出现 , 并且范围增加.半胱天冬酶(cysteinyl
aspartate-specific proteinases , caspase)是一类富含半胱
氨酸的蛋白酶家族 ,是导致细胞凋亡解体的蛋白酶
系统.目前已经发现 14 种 , 其中半胱天冬酶-3
(caspase-3)是位于神经元凋亡下游的一种重要蛋白
酶 ,它水解一系列关键底物 ,使神经元凋亡解体.在
脑缺血损伤后 ,半胱天冬酶-3酶原(procaspase-3)的
活性形式表达量及蛋白酶活性明显增加 ,这一点在
不同的脑缺血及脑缺血再灌注模型中已经得到印
证[ 3 ～ 7] .Procaspase-3存在磷酸化与去磷酸化两种方
式 ,国内外仅见脑缺血再灌注后关于 procaspase-3去
磷酸化形式(分子量为32 kD)变化的报道.本文针对
procaspase-3两种形式进行研究 ,旨在从细胞凋亡的
角度探讨脑缺血再灌注损伤的分子生物学机制及
procaspase-3的活化机制.
1　材料与方法
1.1　材料
化学发光试剂及 caspase-3多克隆抗体(可同时
识别酶原磷酸化与去磷酸化形式)购自美国 CST 公
司;电转移装置为 LKB 公司产品;紫外凝胶成像分
析系统为 Bio-Rad公司产品.
1.2　动物分组与模型制作
实验用动物为三级雌性 C57BL 6N小鼠 ,体重
18 ～ 22 g ,动物许可证号为 scxk(京)2002 ～ 2003.按
随机数字表 ,将 C57BL 6N小鼠随机分为 5 个组 ,每
组6 只.其中有 4 个脑缺血再灌注组(ischemia
reperfusion , I R组),分别为 6 h 、12 h 、24 h和 48 h I R
组;另有 1组为假手术组 ,即对照组.以 10%水合氯
醛腹腔注射麻醉(300mg kg)小鼠 ,取颈部正中切口 ,
分离并用无创性动脉夹将双侧颈总动脉夹闭 ,准确
计时 20min ,取下动脉夹 ,再通血流 ,即为前脑缺血
再灌注模型.假手术组同样手术 ,但不夹闭颈总动
脉.I R组分别于再灌注 6 h 、12 h 、24 h 和 48 h断头
处死 ,假手术组于 24 h 后断头处死 ,分离海马置于
冷冻管中 , -70℃冰箱保存待检.
1.3　HE染色观察海马细胞形态和数量的变化
取假手术组及24 h I R组小鼠 ,用4%多聚甲醛
行心脏灌注.将灌注后的小鼠断头处死 ,剥离大脑 ,
放入 Bouin液固定 24 h.上行脱水后浸蜡 ,包埋 ,修
块.切片机切为 5 μm ,贴片烤干后 ,置于 37℃烤箱
中.行HE染色:下行入水※蒸馏水※苏木精 10 min
※自来水※盐酸酒精 10 s※自来水 20 min蓝化※蒸
馏水※伊红 10 min※蒸馏水 ,脱水 ,透明 ,封片 ,在高
倍物镜下观察细胞的形态改变.
1.4　蛋白质免疫印迹检测 procaspase-3含量
分别提取各组海马总蛋白后进行 12%的 SDS-
PAGE ,经转膜后用 caspase-3多抗进行杂交 ,用化学
发光法使 X光胶片感光 ,扫描照片并以 BandScan软
件进行分析 ,以光密度(IOD)值表示各组的蛋白相
对表达量.
1.5　统计学方法
采用SPSS11.5统计软件 ,数据以均数±标准差
( x ±s)表示 ,各 I R组与假手术组之间 procaspase-3
的差异采用 F检验.
2　结果
2.1　缺血再灌注损伤后海马 HE染色镜检
假手术组海马神经元形态结构正常 ,神经细胞
核大而圆 ,染色浅.24 h I R组细胞数量明显下降 ,
多数细胞形态不规则 ,细胞体积缩小 ,胞浆浓缩 ,染
色质凝集 ,嗜酸性染色增强.具有凋亡细胞的主要特
征.结果见Fig.1A ,B.
2.2　缺血再灌注损伤后海马中 procaspase-3 蛋白
表达改变
与假手术组相比 , 12 h I R 组 、24 h I R 组总
procaspase-3水平与假手术组相比有明显升高 ,差异
有统计学意义(＊ P <0.05);24 h I R 组海马中
procaspase-3去磷酸化水平与假手术组相比也有明
显升高 ,差异有统计学意义(＊ P <0.05);而各 I R
组 procaspase-3磷酸化水平与假手术组相比 ,差异无
统计学意义.结果见Fig.2和 Table1.
3　讨论
Caspase-3在正常细胞内主要以无活性的酶原形
56 中国生物化学与分子生物学报 22卷
　　
Fig.1　Microphotographs of HE staining in the hippocampus sector obtained from sham-operated mice(A)and
ischemic mice 24 hours after 20 min of transient forebrain ischemia(B)
Panel B shows cell shrinkage and chromatin condensation(arrows)
Fig.2　Changes in procaspase-3 during reperfusion after 20
min bilateral common carotid artery occlusion(BCCAO)
Hippocampus lysates(60 μg lane)were subjected to 12% SDS-PAGE
and immunoblot analysis using 1∶1000 dilutions of polyclonal rabbit
antibody to caspase-3(#9662 , Cell Signaling Technology)which could
detect both phosphorylated and dephosphorylated procaspase-3.
The experiment was repeated six times.
1:Sham-operated group;2:6 h I R group;3:12 h I R group;
4:24 h I R group;5:48 h I R group
Table 1　Comparison of procaspase-3 level in different groups
Group
Total
procaspase-3
Dephosphorylated
procaspase-3
Phosphorylated
procaspase-3
Control 4 716.9±168.1　 3 825.8±155.6 891.1±21.7
6 h I R 10 131.0±3 412.0 8 701.7±2 781.4 1 429.3±748.5
12 h I R 9 133.1±2 216.3＊ 7 560.4±2 036.8 1 572.8±411.3
24 h I R 9 355.9±1 901.6＊ 7 812.0±1 625.1＊1 544.0±330.0
48 h I R 9 004.4±2 515.5 7 401.0±2091.8 1 603.4±544.4
　　Notes:n=6;＊ P<0.05 compared with sham-operated group
式存在 ,其分子量为 32 kD(277 个氨基酸),由氨基
末端的前结构域 、大亚基和小亚基 3 部分组成.
Procaspase-3活化时 ,首先在 Asp175及 Asp181处切
割 ,产生 p20 和 p11 两部分;接下来 p20 部分在
Asp28处切割产生 p17亚基 , p17亚基与 p11亚基形
成异源二聚体 ,两个异源二聚体又形成一个四聚体 ,
成为具有完全活性的 caspase-3.针对已知的参与
procaspase-3活化的调控因子 ,广大学者进行了大量
研究 ,试图从 procaspase-3活化过程的调节来治疗与
凋亡相关的疾病.
大部分文献提到 , procaspase-3 的分子量是 32
kD , procaspase-3 还存在一种磷酸化形式 , 在 SDS-
PAGE时位于 35 kD的位置.本实验中使用的抗体是
美国CST 公司生产的 caspase-3抗体 ,它可以同时识
别磷酸化及去磷酸化两种形式 ,小鼠C6细胞系经过
细胞色素 c促凋亡后 ,磷酸化形式蛋白量减少 ,去磷
酸化及活性形式增多.磷酸化是一种十分常见的翻
译后修饰方式 ,体内有许多酶通过磷酸化及去磷酸
化的方式来调节酶原与活性酶量的平衡 , 但对
caspase 蛋白家族的这种调节方式知之甚少.Caspase
家族已知的翻译后修饰有两种 ,procaspase-9 可以被
Akt(一种抑制凋亡的激酶)磷酸化 ,影响四聚体的组
装而抑制其活性[ 8] ;而 procaspase-3在正常人细胞中
活性位点被亚硝基化 ,在 Fas介导的凋亡中去亚硝
基化[ 9] .Lavina 发现 ,在不同的凋亡细胞系中存在多
种 caspae-3蛋白的不同形式 ,认为 Caspase-3存在多
种翻译后修饰的方式[ 10] ;而 Luis则最早发现Caspase
家族是磷酸化蛋白 ,并且证实至少有 3种 caspase被
磷酸化 , 其中 caspase-3 含有多个潜在的磷酸化位
点[ 11] ;Maria 最新的研究结果表明 , p38-MARK(p38-
mitogen-activated protein kinase)可以磷酸化 caspase-3
的酶原及活性形式 ,进而抑制凋亡[ 12] .以上研究结
果说明 ,翻译后磷酸化修饰在 procaspase-3活化过程
中发挥重要作用 ,但其确切机制仍需进一步研究.
缺血再灌注损伤可诱发神经元凋亡 ,这已经是
公认的事实.在本实验中 ,我们通过简单地 HE染色
再次证明了这一点.并且有大量研究表明 ,缺血再灌
注损伤 caspase-3 mRNA转录水平升高 ,继而引起蛋
白表达水平增加.在本实验中 ,去磷酸化形式及总
procaspase-3在缺血再灌注后升高 , 与文献报道一
致.而其中去磷酸化形式酶原的增加明显 ,这提示在
57第 1期 刘天会等:小鼠短暂前脑缺血海马中半胱天冬酶-3 酶原表达的变化 　
增加的去磷酸化 procaspase-3中 ,除了因翻译水平增
加的外 ,可能还包括部分由磷酸化 procaspase-3去磷
酸化而形成.说明缺血再灌注损伤有可能诱发
procaspase-3磷酸化形式去磷酸化 ,而去磷酸化可能
是procaspase-3最终形成具有完全活性 caspase-3 的
前奏.去磷酸化形式及磷酸化形式 procaspase-3之间
的相互转换与数量平衡在凋亡过程中可能起到重要
作用.在未来的研究中 ,对 procaspase-3 磷酸化与去
磷酸化形式之间的具体调控机制进行深入研究 ,将
为脑缺血再灌注及其他凋亡相关疾病的治疗提供新
的思路.
参考文献(References)
1 　Armstrong R C , Aja T J , Hoang K D , Gaur S , Bai X , Alnemri E S ,
Litwack G , Karanewsky D S , Fritz L C , Tomaselli K J.Activation of
the CED3 ICE-related protease CPP32 in cerebellar granule neurons
undergoing apoptosis but not necrosi s.Neuroscience , 1997 , 17(2):553
～ 562
2 　White B C , Sullivan J M , DeGracia D J , O Neil B J , Neumar R W ,
Grossman L I , Rafols J A , Krause G S.Brain ischemia and
reperfusion:molecular mechanisms of neuronal injury.J Neurol Sci ,
2000 ,179(S1-2):1～ 33
3 　Krupinski J , Lopez E , Marti E , Ferrer I.Expression of caspases and
their substrates in the rat model of focal cerebral ischemia.Neurobiol
Dis , 2000 , 7:332～ 342
4 　Love S , Barber R , Srinivasan A , Wilcock G K.Activation of caspase-
3 in permanent and transient brain ischaemia in man.Neuroreport ,
2000 , 11(11):2495～ 2499
5 　Gill R , Soriano M , Blomgren K , Hagberg H , Wybrecht R , MissM T ,
Hoefer S , Adam G , Niederhauser O , Kemp J A , Loetscher H.Role of
caspase-3 activation in cerebral i schemia-induced neurodegeneration in
adult and neonatal brain.J Cereb Blood Flow Metab , 2002 , 22(4):
420～ 430
6 　Nakatsuka H , Ohta S , Tanaka J , Toku K , Kumon Y , Maeda N ,
Sakanaka M , Sakaki S.Histochemical cytochrome c oxidase activity and
caspase-3 in gerbi l hippocampal CA1 neurons after transient forebrain
ischemia.Neurosci Lett , 2000, 285:127～ 130
7 　Guegan C , Sola B.Early and sequential recruiment of apoptosis
effectors after focal cerebral permanent ischemia in mice.Brain Res ,
2000 , 856:93～ 100
8 　Cardone M H , Roy N , Stennicke H R , Salvesen G S , Franke T F ,
Stanbridge E, Frisch S , Reed J C.Regulation of cell death protease
caspase-9 by phophorylation.Science , 1998 , 282:1318～ 1321
9 　Mannick J B , Hausladen A , Liu L , Hess D T , Zeng M , Miao Q X ,
Kane L S , Gow A J , Stamler J S.Fas-induced caspase denitrosylation.
Science , 1999, 284:651～ 654
10　Lavina F , Ryuji K , Howard F , and Yuri L.Multiple species of CPP32
and Mch2 are the major active caspases present in apoptotic cells.
EMBO J , 1997 , 16(9):2271～ 2281
11 　Mart ins L M , Kottke T J , Kaufmann S H , Earnshaw W C.
Phosphorylated forms of activated caspases are present in cytosol f rom
HL-60 cells during etoposide-induced apoptosis.Blood , 1998 , 92(9):
3042～ 3049
12　Maria A K , Fredrik M , Karin L , Lars R, Christer W , Tommy A.p38-
MARK signals survival by phosphorylation of caspase-8 and caspase-3 in
human neutrophils.J Exp Med , 2004 , 199(4):449～ 458
58 中国生物化学与分子生物学报 22卷