全 文 ：2 0 0 3 V白1 .1 5 N o .5
天然产物研究与开发
N 戌 r [J’I 几AL PR O」〕 C UT F P只p A R CHAI 吸 EV D )EL ( )P州[E N l ,
新疆紫草细胞生产阶段培养中细胞生长
及产物合成的研究 且 :发酵培养
康强胜 李洪林 吴玉兰 卢大炎 `
(中国科学院武汉植物研究所 武汉 4 300 7 4)
摘 要 用内循环气升式反应器进行新疆紫草细胞生产阶段培养 ,当培养基浓度增加时 , 色素产率也随
之提高 ,其数量及增长的幅度远大于悬浮培养 。 当接种量为 180 g FW 1/ ,培养基为 3 倍的呱 时能获得
最大的色素产率 : 2 . 25 9几 ,是培养基非加倍时的 5 . 4 倍 ,太高的接种量不利于色素的合成 。 为降低成本
而减少培养基中某些成份的用量时 ,要得到较高的色素产量 , 需同时调整其它成份的浓度。
关键词 新疆紫草 ;细胞培养 ;气升式反应器 ;紫草色素
利用植物细胞大量培养生产有用次生代谢产
物 ,在大多数情况下 ,产物产率都随培养规模的扩大
而下降 。 如在长春花细胞培养过程中 ,培养规模扩
大 10 倍时 ,产物的比产率要下降 170 倍〔`〕。 解决
产物产率下降这个问题可以多方面人手 , 如筛选适
于大规模培养条件的高产细胞株系 、 优化培养过程
中的理化条件 、改进反应器的结构及选择适当的培
养工艺等 z[] 。 增大培养细胞的密度也可有效地提
高生物量及产物产率汇” , ’ ” ,川 。 从理论上讲 ,培养过
程中植物细胞的密度可以达到 90 9 DW 1/ 川 。 在高
密度培养条件下 ,反应器的混和及溶氧性能成为面
临的主要问题〔” 〕 , 同时还需考虑加大培养基 的浓
度 ,以利于高密度条件下细胞的生长与代谢 仁`。 ,川 。
新疆紫草细胞在培养规模扩大时紫草色素的产
量也大幅下降川 。 由于涉及二步培养及第二步培
养时细胞密度较高 , 色素产量的下降可能是由多方
面原因造成的 。 如反应器的传质及混合性能 、 接种
量的大小 、培养基的浓度 、 某些特殊养分的浓度等 。
虽然陈士云等研究了继代次数及通气量对色素产率
的影响 ,但到目前为止对新疆紫草细胞培养规模扩
大时色素产率大幅下降的原因仍缺乏根本性的了
解 ,也没有系统性的扩大培养规模时提高色素产率
的研究报道 。 本文在对反应器进行改进的前提下 ,
研究了在大量培养条件下接种量 、 培养基浓度以及
培养基中某些成分浓度的改变等对新疆紫草细胞色
素产量的影响 , 为今后在大规模培养条件下 ,进一步
的提高生物量及色素产量并进而实现工业化生产打
下了良好基础 。
收稿日期 : 2 0 0 2一 0 9一 1 1 修回 日期 : 2 0 0 3 一 0 3一 2 0
` 通信联系人 ( cb r es op dn ign au t ho r)
1 材料和方法
1
.
1 实验材料 : 用于实验的新疆紫草细胞系我室长
期继代培养的未经筛选的愈伤组织 。
1
.
2 细胞的悬浮培养 :挑选生长旺盛 、 色泽透明的
愈伤组织接种到装有 10 m l A G 一 7 培养基的 250 iln
锥瓶中〔5〕 , 置摇床上进行扩增培养 。 每 12 天继代一
次 。 取悬浮培养 3 一 4 代的细胞作为反应器培养的
接种材料 #[] 。 悬浮培养条件为黑暗 , 温度 2 一 25
℃ ,摇床转速 12 0 r m/ i n 。
1
.
3 反应器培养 :反应器采用我室自制的经改进后
的 7 1 内循环气升式反应器 。 取悬浮培养 12 天的细
胞 ,滤掉培养基 ,然后接种于装有 41 A G 一 7 培养基的
上述反应器中 ,依所设计的第二阶段培养的初始细
胞密度决定接种量 。 培养 15 天后用设于击底的过
滤装置滤掉培养基并用无菌蒸馏水冲洗一次 ,然后
换人 41 呱 培养基或 2 ` M g 、 3 * M g 培养基 ( 2 * 呱
为呱 中各组份用量培加一倍 , 但激素浓度同呱 ,
蔗糖为 4 % 。 3 ` 呱 中各组份用量则为叽 的三倍 ,
激素浓度也同呱 , 蔗糖为 6% ) , 同时测沉降体积 ,
并取样测样品沉降体积 、鲜重及干重 ,根据沉降体积
比计算出生产阶段的接种量 。 培养过程中定期测沉
降体积及取样测色素含量 。 用沉降体积作为细胞生
长的尺度 。 根据新疆紫草细胞生产阶段色素含量高
峰在细胞生长高峰之后的特点以及对反应器中色素
含量的直接观察来确定反应器培养的收获时间。 生
长阶段培养时通气量为 1 . 5 !m/ in ,生产阶段时根据
接种量的多少定为 1 . 5 1m/ in 或 2 . 0 1m/ in , 以利于
DOI : 10. 16333 /j . 1001 -6880. 2003. 05. 015
天然产物研究与开发 2 00 61 3 V .15 N o .5
高密度培养条件下细胞的生长与代谢 。 培养过程中
温度为 2 2 一 2 5 ℃ ,黑暗条件 。
根据悬浮培养的实验结果 , 选择每升 180 克鲜
重和 250 克鲜重左右的两个接种量 , 依不同的培养
条件设计了 A 、 .B · · … G 七个类型的实验 ,具体见表
1
。
表 1 不同培养基浓度和接种皿对生产阶段新疆紫草细胞生长及色素合成的影响
T ab 悦 1 nI fl u ecn
e of m ed iuxn ~ en
tr a t 、 o n 邵记 in oc ul uln 溢ez on
c
el gr
0 W t h an d hs i k
。 川 n d er iv iat v es 比。 m l a t ion in A . eu 汰 or 刀砚
e e lls i n s e co n d
s t a g e
实验类型 A B C D E F G
接种量 ( 9 1乃刀 ) Ion e己um s iz e 7 9 3 9 2 5 8 5 6 1 53 9 13 4 5 13 7 5 13 15
培养基 M e d iurn M 9 2 釜 M 9 3 关 M9 2 芳 M9 3 补 M9通气量 ( lm/ in ) A er a t i o n ar t e 1 . 5 1 . 5 1 . 5 2 . 0 2 . 0 2 . 0 2 . 0
实际培养体积 ( l)W6 rk in g vo luern 5 5 5 5
.
5 5
.
5 5
.
5 5
.
5
培养时间 ( d a y ) C d t u er t im e 1 9 2 0 2 4 2 6 2 8 2 2 2 2
收获量 ( 9 1〕W ) Y i e ld o f b iom as 1 0 8 8 1 12 2
.
5 8 2
.
5 11 9
.
5 1 17
.
5 7 5
干重倍增数 1〕W in e r e as e d 一 t im e s 2 . 3 1 . 4 9 2 . 4 5 1 . 17 1 . 9 4 1 . 87 1 . 25
培养物中色素含量 (% )
P ig l l e n t
con
ten t in e e ll 0
.
7 5 2 3
.
0 3 5
.
1 1 2
.
3 2
.
4 6 2
.
0 9 2
.
8 9
培养基中色素含量 (m g尔 l1)
P ig l l e n t co n t e n t in me d iurn 0
.
3 2 5 1
.
7 5 1
.
6 1
.
4 5 1
.
6 1 1
.
4 1 1
.
8
色素总产量 ( g )Y i e ld o f p ig l n e nt 2 . 1 14 7 8 . 84 18 1 1 、 3 8 18 7 . 7 0 9 9 . 6 32 8 , 0 9 74 9 3 6 7 5
色素产率 ( g月 )
P or d u e t iv i t y o f P ig l n e n t 0
.
4 2 2 9 1
.
7 7 2
.
2 8 1
.
2 9 1
.
7 5 1
.
4 7 1
.
7
色素外泌的百分比 ( % )
Per c e n t a g e o f
exc
r e
edt pi日卫
e n t 6 1
.
4 7 7 2
.
24
_
4 4
.
9 8 7 5
.
24 6 9
.
3 5 6 9
.
6 5 7 6
.
8 6
注 : 2 * M ; 及 3 ` 呱 中成分见文中论述 。 F 实验中 eF + + 及激素浓度同呱 , KN (乃和以 ( N3Q ) 2 · 4姚 O加一倍 ,其余同 3 , 呱 。 G实验中蔗糖浓
度改为 4 % , 其余同 F 。 色素产率为总产量除以实际培养体积的近似值。
No
t e :
hT
e
com po ne
t s o f m ed ium 2
X
Mg an d 3
X M g s e t h e des cr ip t io n in ht e art i
e le
.
In e x p e r in en t F
, t h e co n e e n t r a t lon of eF
十 十 a n d ho
moner
in rl l e cli
-
um un
e h a n g e d
,因 u习 to t ha t in m ed ium Mg ; t h e q u ant it y u se d o f K N0 3 an d aC ( N (石) 2
·
4ZH O i
s
do ub led
; th 。 con
e e n
tra t ion
o f o t he r i n g l℃ d i e n t s i s th e
sam
e as th a t in me d iitm 3
X M g
,
I n e x p e r im en t G
, t he
con
en t ar t ion of
s u g a r 15 e h a n g e d ot 4 % ; t h e q u an t i t y
u s de o f o th er
com op
u n d s 云5 id e n t ica l w i th
t h a t in e x p e石m e n t F . hT
e p r浏 u e t i v i ty o f p ig n 飞e n t i s an 叩 P or x iarn t e va lue o f the y i e ld o f P ig l l e n t d ivi d e d b y ow r k i眼 vo lurne
.
ǎ瞬à-u。树ou勿罗的工qnl的
侧经卑划处险。·呼
书,八曰厌0CU, .七`」
ǎ巴醉a斗侧ù;
1
.
4 紫草色素含量的测定 : 细胞中色素含量的测定
方法为 :将烘干的培养物磨碎后反复用低沸程石油
醚冷浸提取至无色 ,合并浸提液定容后用 7 520 型分
光光度计在 入= 520 n m 处测吸光值 , 根据标准曲线
计算色素含量 。 滤液中色素用低沸程石油醚冷浸萃
取 ,然后同上测定色素含量 。
1
.
5 培养基中可溶性糖的测定 :用葱酮法测定 。 设
最初培养液中可溶性糖的浓度为 10 % 。
2 结果与讨论
2
.
1 新疆紫草细胞发酵培养的时间进程 :使用呱
培养基进行高密度反应器培养时 (实验 A ,见表 1 ) ,
细胞生长及色素合成动态与悬浮培养时大致相同
(图 1 、 图 2) 。 细胞生长的曲线呈 S 形 , 细胞量的倍
增数约为 2 . 3 , 高于悬浮培养时的结果 。 培养基中
可溶性总糖的含量随细胞的生长而降低 ,表明生产
阶段培养时细胞对蔗糖的需要 。 与悬浮培养相同 ,
色素含量的高峰略落后于生物量的高峰 (图 2 ) 。 反
培养时间 C u l t u er t i m e (d a y )
图 1 新疆紫草细胞在 7 升反应器中发酵培养的时间进
程一细胞生长
iF g
.
1 T im e cou ser of A
.
eu 动 or ma ce U f~ en at it on in
71 a ir lif t bior ea
c t o r - - e el l g or wt h
应器培养时色素产量为 0 . 4 229 9乃 , 与悬浮培养相
比 (0 . 7 5 9月 )有较大幅度的下降 。 在培养的后期 ,
培养基中色素含量增加较快 ,且占到总的色素量的
6 1
.
5%
,证明新疆紫草细胞在反应器培养时有较强
的外泌能力 ,这极有利于运用产物原位移除方法进
2 00 3 V 61
.
15 N 6
.
5 康强胜等 :新疆紫草细胞生产阶段培养中细胞生长及产物合成的研究 且 :发酵培养 4 31
ǎ健\的已à庄nōP.utu喇-。祠uo。-昆乙
叫如权切番砌株奢óI叩
哪%0%R产024.0ǎ水à的1。uǐ祠-olut.`
蜘如很切任纂导ù·V。
培养时间 e u l t u er ti m e ( da y )
图 2 新疆紫草细胞在 7升反应器中发酵培养的时间进
程一色素合成
F i g
.
2 T im e uco
r es o f A
. 己“ `丙ro am ec l f~ en
t a t ino i n 71
a
i
r li f t biro ae e to
lew ew s h i k o xl ln d叮 i v a t lv es f o rn l a t ino
一步提高色素产率 〔` 2 ] 。 细胞量的倍增数高于悬浮
培养时的结果可能反应了在高密度培养条件下 ,用
内循环气升式反应器具有更好的传质及混合效果 ,
使之更有利于高密度条件下新疆紫草细胞的生长 。
而色素产量的下降则反映了培养规模增大时 ,产物
产量下降的一般趋势〔`」。
2
.
2 培养基浓度加倍后进行反应器培养的结果 :培
养基加倍后的实验结果 , 连同非加倍的实验 A 结果
列于表 1 。 从表中的数据可 总结出如下的结论 : ①
同悬浮培养一样 ,用 2 * 呱 培养时生物量的倍增数
要低于用叽 培养 (实验 B 为 1 . 49 , 低于实验 A 的
2
.
3 )
,但进一步提高培养基的浓度 ,可提高倍增数的
值 (实验 C 为 2 . 45 , 高于实验 A ) 。 ②培养基浓度加
大后 ,色素产量有明显 的提高 。 其中实验 B 中色素
的产量是实验 A 的 4 . 19 倍 ,实验 C 是实验 A 的 5 . 4
倍 。 这种培养基浓度增大后色素产量增加的结果与
悬浮培养时相同 ,但色素产量增长的幅度及增加后
的值要大大高于悬浮培养 。 ③加大接种量后 , 色素
产量反而下降 。 其中培养基同为 2 * 呱 的实验 D
与实验 B 相 比 , 色素产量下降了 2 7 % , 同为 3 * 呱
的实验 E 比实验 C 下降了 23 % 。 不仅如此 , 细胞干
重的倍增数也减小 ,最终收获的生物量也不比低接
种量时高多少 ,有的甚至还要低 。 同时 ,加大接种量
后 ,培养的时间也相应延长 。 ④细胞的倍增数和色
素的外泌与培养基中蔗糖的浓度有一定关系 。 当蔗
糖用量增大时 ,生物量增加 ,但色素的外泌 比例则减
少 。 ⑤在所有的七个实验中 ,实验 C 所获得的色素
产量最高 ,达 2 . 2 8 克万1. ,培养时间也较短 。
以上结果表明 , ①在增加培养细胞的密度时 ,适
当增加培养基的浓度可有效提高生物及色素产量 。
②与锥瓶培养相比 ,用气升式反应器更利于新疆紫
草细胞的生长和色素的合成 。 其原因可能在于用气
升式反应器培养时具有更好的传质及混合效果 。 ③
太高的细胞密度不利于细胞的生长 ,也不利于色素
的合成 。 这也说明盲 目加大接种量并不能获得较满
意的结果 。 ④生物产量与色素的外泌量与培养基的
蔗糖浓度有密切关系 ,若能详实地研究这种关系 ,将
为今后运用产物原位移除方法来进一步提高色素产
率打下基础 。 ⑤本实验的结果说明 , 本室经改进的
气升式反应器适于新疆紫草细胞的大量培养 。 且采
用 3 * 呱 培养基及每升 18 0 克鲜重左右的接种量 ,
能获得较高的色素产量 。
2
.
3 培养基成份的局部调整对色素产量的影响 : 在
3 * M g 培 养基 的基 础 上 , 降低 N aF e - ED T A 及
K N q
、
aC ( N恤 ) : · 4姚O 等的用量 (实验 )F , 与实验
E 相 比 , 生物量的倍增数和色素产量分别下 降了
3
.
6% 和 1 5 . 9 % ,若进一步降低蔗糖用量 (实验 G ) ,
与实验 E 相比 ,细胞量的倍增数和色素产量则分别
下降 35 . 5 7 % 和 2 . 7 % 。 一般而言 ,在一定的细胞密
度下 ,培养基中每种组分都应有一适当的浓度范围 ,
过高或过低都将对细胞的生长及色素的合成造成不
利影响 。 从经济角度讲 , 也需力求在获得较高产量
的前提下 ,尽量减小各种成分的浓度 , 以降低成本 。
在硬紫草愈伤组织培养中 ,高浓度的 eF + 十及 aC 十 +
抑制色素的合成 , 而高浓度的蔗糖则有利于色素的
形成 ,其最适浓度为 5% 6[] 。 N呀 浓度过高或过低
都不利于硬紫草细胞色素的合成 l7[ 。 方德秋等通
过实验认为 3 % 的蔗糖和 14 0 m g月 的 aC (N马 ) : ·
4姚O 对新疆紫草细胞的生长及色素合成较为有
利s[] 。 从本实验结果看 , 同时降低 eF + + 、 C+a + 、
N呀 等的浓度 , 对细胞生长影响较小 ,但却影响了
色素的得率 (实验 F 与实验 E 相比 ) 。 若能同时降
低蔗糖浓度 ,则能提高色素产量 (实验 G ) 。 由此可
以推论 ,在减小某些成分用量的同时 ,要保证较高的
色素得率 ,需对其它一些组份作适当调整 。 由于时
间及经费的关系 ,生产阶段反应器培养时 ,本实验未
能就呱 中各组份不同浓度的组合对新疆紫草细胞
生长及色素合成的影响进行深人研究 。
2
.
4 培养基浓度的增加对生产成本的影响 :在培养
基成本中占较大比重的是耗量较大的一些有机化合
物如蔗糖 、 肌醇 、 水解酪蛋 白等 。 相对来讲 ,无机盐
类在培养基成本中所占比重不大 。 对 M g 而言 , 除
蔗糖 、 N a F e ~ E l〕T A 及激素外 ,其余都是无机盐类 , 控
4 3 2天然产物研究与开发 20 03 V o l . 15 N c ). 5
制使用这些有机物而增加无机盐的用量不会大幅提
高培养基的成本 。 从实验结果看 ,浓度增加到三倍 ,
色素产量却增长了 5 . 4 倍 。 所以新疆紫草细胞生产
阶段反应器培养时 , 增加 呱 培养基的浓度应是一 7
条较好的生产紫草色素的途径 。
参考文献
段 r a g g A H , M o r is P , lA la n EJ , e t a l . fE fce t o f s e al -e u p on
s e月〕 e n t in e fo n n a t io n b y 及ht a ar n ht u s oser u s s u sP即 s ion
e u l ut er
.
nE
之 , 刀 e 几五e护动 了袄流 on l . , 198 7 , 9 : 6 19一 624
uB it el
a ar R M
,
rT 田 n l〕er J
.
trS
a t e g i es ot t ha p
r
de ut lon o{
s
ceo
n der y m e t a比 li tes 俪 t h p lan t e ul t ur es : a lit aer t u r e er -
v iew
.
J B io z“ 五n o l , 19 92 , 2 3 : 1 11一 14 1
M
a st u bar a K
,
K it an i S
, 、乞 s h io k a T , et a l . 且 g h dens i t y
e u lut r e of L o P t i s aj 加儿撇 e el ls in ceasr
e bebr ier
n e pedr
u e -
t
lon
.
J hC em eT
c h n ol
,
19 89
,
4 6 : 6 1一 6 9
陈士云 ,侯篙生 ,张 健等 . 新疆紫草细胞的逐级放大培
养试验 , 植物资源与环境 , 1994 , 3 ( 3) : 27 一 31
叶和春 ,尹作鸿 ,李国凤等 . 不同理化因子对新疆紫草愈
伤组织生长及紫草宁衍生物合成 的影响 . 植物学报 ,
19 91
,
33 ( 12 )
: 927一 93 1
陇 z u k a l n i H , Kons h ianr M
,
aT b
a t a M
.
E ffeC t of
n u t ir t io n
-
a l af e t o r on
s h i k o n in d e ir v a t io n f o m l a t io n i n L i ht O S介 , . -
m u m e J ) th or hr 乞勿 n cal lu s e己 tur se . 外皿戚 em 该st 即 , 197 7 ,
16 : 2 7一 3 1
ujF i
t a y
,
I l
a r a
Y
,
S u g a C
,
et a l
.
P
r ( x 】u e t i on o f s h ik on in
d ier
v at 污 es by e el s u s pesn lon
e u lutr es
o f L乞tho 咖~ m曰多入or hr 二 n . 1 A n ew m司 iurn for t h e p耐 u e t io n o f
s h ik o n i n d er iv a t iv es
.
lP
a n t 翻 l 八介 Jsrt , 198 1 , 1 : 6 1一 6 3
方德秋 ,侯篙生 ,李新明等 . 不同营养因子对新疆紫草悬
浮培养细胞生长及紫草宁衍生物形成的影响 . 武汉植物
学研究 , 1994 , 12 ( 4 ) : 3 48一 354
T a l l a k a H 厂1飞义 hno log i ca l p or blem in e u l t iva t ion o f p lan t
e el ls a t h ig h den
s it y
.
B io t仪云n ol B i〔劝 之召 , 198 1 , 23 : 120 3一
12 28
王红强 , 张蕴哲 ,陈旭峰等 . 中国红豆杉悬浮细胞高密度
培养 .华东理工大学学报 . 19 99 , 25 ( 1 ) : 55一 58
aT b
a t a M
,
F uj i t
a
Y
.
P r ed
u e t io n
o f s h iko
n
in by p lan t
e e ll
e u lutr es
.
In
“
B io t ec h no lo g y in P lan t 段 ien e e : R e le va n e e ot
A g icu l tuer i
n t h e E ig h t ies
, , ,
aZ i t lin M
, e t a l (
e
d
s
.
)
,
N ew
、 b r k : A e ad em ie rP既 , 198 5 . 20 7一 2 18
L in L
,
W
u
J
.
nE h an
e
o en
t o f hs i k
〔 Jn
in P
r
do
u e t i
o n in s i n
-
g le
一 a n d t
-wo
p ha
s e s
us p
e
ns i
o n e u l ut r es o f L it hos p
emr um
e r y t h or r h i功n e el ls u s i馆 lo -w en e r g y u lt
~
n d
.
B幻 t翻 -
n o l(黔 a耐 刀艺哪刀g inesr 鳍
,
2 00 2
,
78 ( 1 )
: 8 1一 88
S T U D Y O N G R O W T H A N D P R O D U C T FO R M A T IO N O F
A R N五丑卫A E U C月双 O叼胜 C E L L I N S E C O N D S T A G E
n
: F E R M E N T A T I O N
K A N G Q i a飞一 sh e n g , L I oH 眼一 l i n , WU uY 一 lan , L U D a 一 y an
( W说h a n nI st i t u t e of 肠 at 卿 ,以艺n es A〔?ad e 刀珍 , of & 乞en ces , W u ha n 4 300 74 , Ch in a )
A b s t r ac t T h is p a p e r d e al s w i t h t h e e f f e e t s of h ig h m e d i u m con
e e n t r a t io n a n d h ig h i n i t i a l e e l l d e n s i t y in i n n e r
-
lo p a i r li f t b i o r e a e t o r o n t h e g owr
t h a n d s h ikon i
n d e r iv a t iv e
’ 5 fo mr
a t io n i n s e co n d s t昭 e e e l l e u l t u r e o f A nr e b i a
e u认 or m a 厂Fh e r es u l t s s h o w e d t h a t t h e s h ik on i n y i e ld i n a n o p t im i z e d h ig h i n i t ia l e e l l d e n s i t y e u l t u r e e x h ib i t e d an
i n e r ae s e o f 4 3 9% t o 2
.
2 8 9 l/ o f s h iko
n in d e r i v a t ive s w h e n t h e m e d i u m co n e e n t r a t i o n i n e r e a s e d b y t h r e e
一
fo ld
.
A n
e x e es s iv e i n co u l u m s i z e w a s u n f a vo
r ab l e t o s h ik o n i n p r仪 lu e t io n . W h e n t h e m o u n t s o f so m e com 卯
s i t io n in m e d i
-
u m n e e d e u t d o w n fo
r r e d u e i n g cos
t of p
r
do
u e i n g
,
t h e co n e e n t r a t i o n o f o t h e r
com
p o n e n t i n m e d ium had ot
r e g u
-
la t e d o n co n d i t i o n t h a t w e w a n t t o m a i n t a i n t h e s arn
e s h ik o n i n p or d
u e t iv i t y
.
K叮 w o记 5 A r n eb ia e u hc or ma ; e e l l e u l t u r e ; a i r li f t b ior e a e t o r ; s h ikon i n d e r i v a t iv e s