全 文 ：云南商品牛肝菌中易混淆毒牛肝系统学研究 *
李树红 1，2，3， 赵永昌 2，3， 于富强 1， 王向华 1， 张小雷 2，3， 刘培贵 1**
（1.中国科学院昆明植物研究所， 云南 昆明 650204； 2.云南农业生物技术重点实验室， 云南 昆明 650223；
3.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所， 云南 昆明 650223）
摘要： 基于 ITS序列的分子系统学与形态分类学方法，对云南商品牛肝菌进行分子系统学研究。研究结果显示，易混
淆毒牛肝菌不是一个自然类群，它们镶嵌在牛肝菌目的各分支中；牛肝菌属不是单系群；绿盖裘氏牛肝菌 Chiua virens
(W.F.Chiu) Y.C.Li & Z.L.Yang、圆花孢牛肝菌 Heimioporus retisporus (Pat. & C.F. Baker) E.Horak、黄粉末牛肝菌 Pulver－
oboletus ravenelii (Berk. & M.A. Curtis) Murrill、紫盖牛肝菌 Tylopilus eximius (Peck) Singer和小孢粉孢牛肝菌 Tylopilus
microsporus S.Z.Fu, Q.B.Wang & Y.J.Yao是云南商品牛肝菌中易混淆的 5种毒牛肝菌。
关键词： 云南；毒牛肝；商品牛肝菌；分子系统发育
中图分类号： S646.9 文献标识码： A 文章编号： 1003-8310 （2011） 05-0034-03
Systematics of the Easily Confusing Poisonous Boletes from
Yunnan Wild Mushroom Markets
LI Shu-hong1,2,3, ZHAO Yong-chang2,3, YU Fu-qiang1, WANG Xiang-hua1, ZHANG Xiao-lei2,3, LIU Pei-gui1
(1.Kunming Institute of Botany, the Chinese Academy of Sciences, Kunming Yunnan 650204;
2.Yunnan Key Lab of Agricultural Biotechnology, Kunming Yunnan 650223;
3.Biotechnology and Genetic Germplasm Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming Yunnan 650223)
Abstract: Morphological characters and the phylogeny based on the nucleotide sequences of the internal transcribed
spacer ( ITS) regions of the nuclear ribosomal gene cluster of the commercial boletes on Yunnan mushroom markets
were studied. The phylogeny of easily confusing poisonous boletes in specimens collected from mushroom markets were
analyzed. The research results revealed that the poisonous boletes was not a naturally monophyletic group, which were
scattered in different family or genus. The genus Boletus was not the monophyletic group. Five poisonous species of the
commercial boletes, i.e. Chiua virens (W.F.Chiu) Y.C.Li & Z.L.Yang, Heimioporus retisporus (Pat. & C.F.Baker) E. Ho-
rak, Pulveroboletus ravenelii (Berk. & M.A.Curtis) Murrill, Tylopilus eximius (Peck) Singer and Tylopilus microsporus S.
Z.Fu, Q.B.Wang & Y.J.Yao, were confused easily.
Key words: Yunnan; Poisonous boletes; Commercial boletes; Phylogeny
商品牛肝菌 （Commercial bolete） 是泛指一类大型 、
肉质、 孔状贸易菌类的名称， 但也包括部分具有褶状、 产
褐色牛肝菌类孢子的伞状高等菌物 ， 如褶孔牛肝菌属
（Phylloporus Quél.） 的种类等 [1]。 商品牛肝菌主要由可食牛
肝菌组成， 其中美味牛肝菌 （Boletus edulis complex） 是世
界著名的美味野生食用菌之一 ， 其它如双色牛肝菌 （B.
bicolor Peck）、 小美牛肝菌 （B. speciosus Frost）、 深褐牛肝
菌 （B. obscureumbrinus Hongo）、 华丽牛肝菌 （B. magnifi-
cus W.F.Chiu）、 淡灰褐色网柄牛肝菌 （Retiboletus griseus
Frost）、 美柄牛肝菌 （B. calopus Fr.）、 茶褐牛肝菌 （B.
brunneissimus W.F.Chiu）、 桃红牛肝菌 （B.regius Krombh.）、
中华牛肝菌 （B. sinicus W.F.Chiu） 等是云南野生菌贸易市
场上的优势种类 [2-8]，在夏秋季是市场上非常普遍， 深受当
地群众喜爱。
但不幸的是由于牛肝菌物种多样性丰富， 种间形态相
似性高， 形态学鉴定相对较困难， 以及民间 “以貌择食”
* 项目来源： 云南省科技创新强省计划资助项目 “商品牛肝菌及其易混淆种类分子鉴定技术应用基础研究” （2007C0002Z）。
作者简介： 李树红 （1978-）， 男， 在读硕士， 主要从事食用菌分类和分子生物学等方面的研究。
** 通讯作者： 刘培贵 pgliu@mail.kib.ac.cn
收稿日期： 2011-08-12
中国食用菌 2011， 30 （5）： 34~36
EDIBLE FUNGI OF CHINA
CN53－1054 ／ Q ISSN 1003－8310
李树红等： 云南商品牛肝菌中易混淆毒牛肝系统学研究
的传统习惯， 导致食用牛肝菌中毒的事件频繁发生。 因此
学术界和消费者一致要求探索新的方法来鉴定商品牛肝菌
中的混淆毒菌。 随着分子生物学的快速发展， 基因序列分
析对比成为了现实， DNA 序列分析技术在揭示大型真菌
系统发育及物种鉴定方面受到重视， 本研究也就是基于这
样的理论， 结合形态学特征， 应用 ITS 序列对云南商品牛
肝菌中易混淆毒菌展开分子系统学研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集
在野生菌出菇期赴野生菌主产区的交易市场采集商品
牛肝菌及其易混淆毒菌， 作为形态学和分子生物学研究材
料。
1.1.2 显微形态特征观察使用的试剂
5%和 10%氢氧化钾试剂 （KOH） ， 1%刚果红试剂
（Congo Red）， 梅氏试剂 （Melzer’s eagent）， 蒸馏水。
1.1.3 ITS 序列扩增引物
本研究应用通用引物 ITS4 和 ITS5， 对商品牛肝菌及
易混淆毒菌的 ITS 序列进行扩增。 引物碱基组成见表 1。
1.1.4 GenBank 中下载的 ITS 序列
为了加强对比， 充分了解各物种种质资源多样性， 构
建更加趋于自然的牛肝菌系统树， 在研究中从 GenBank 中
下载了 5 条 ITS 序列， 见表 2。
1.2 方法
1.2.1 显微形态特征的研究
显微观察是形态分类的关键环节， 也是构建系统学及
分子检测研究的基础， 本研究应用现代真菌分类学方法对
收集标本进行研究。
1.2.2 DNA 提取
CTAB 法[9，10]。 选取无虫蛀的大型真菌的干样， 取适量
菌肉， 液氮磨碎； 加入 700 μL 65℃预热的 DNA 提取缓冲
液， 轻轻振荡混匀， 65℃水浴 30 min， 期间混匀 2 次~3
次； 加入 230 μL 5 mmol·L-1 KAc， 冰浴 20 min； 等体积的
氯仿 :异戊醇 （24:1） 抽提 1 次 （10 000 r·min-1， 4℃离心
10 min） 取上清， 加入 2/3 倍体积的-20℃预冷异丙醇， 混
匀， -20℃静置约 30 min； 离心 （8 000 r·min-1， 4℃离心 8
min）， 倒去上清液， 用 80%乙醇和无水乙醇各漂洗 1 次，
晾干 ， 加入 500 μL TE buffer 溶液 ； 加入 20 μL RNAase
（1 mg·mL-1）， 37℃温浴 1 h； 加等体积酚 （pH8.0） ∶氯仿 ∶
异戊醇 （25 ∶24 ∶1） 和氯仿 ∶异戊醇 ( 24 ∶1) 各抽提 1 次
（ 10 000 r·min-1， 4℃离心 10 min）； 取上清液， 加入 2/3
倍体积的异丙醇轻摇 ， 沉淀过夜 ； 离心 （10 000 r·min-
1， 4℃离心 10 min）； 沉淀用 80%乙醇漂洗， 晾干， 溶于
30 μL TE buffer 溶液中， -20℃保存备用。
1.2.3 PCR 扩增反应体系
PCR 扩增反应体系选用 50 μL 反应体系， 其中包括
10×扩增缓冲液 （含 MgCl2） 5 μL， 200 μmol·L-1 dNTP 5
μL， 5 μmol·L-1 的引物各 1 μL， Taq DNA 聚合酶 0.6 μL
（2.5 μ·μL-1）， DNA 模板 1 μL （量的多少因 DNA 浓度而
异）， 用 ddH2O 定容至 50 μL。
1.2.4 PCR 扩增反应程序
PCR 扩增反应程序的热循环参数 ： 94℃变性 5 min，
然后进入连续 35 个循环 （94℃变性 0.5 min， 56℃退火 0.4
min， 72℃延伸 0.4 min）， 循环结束后于 72℃延伸 5 min，
最后于 4℃保存。
1.2.5 PCR 扩增产物检测
分别取 2 μL PCR 产物和 Marker 与 2 μL 溴酚蓝混匀，
点样于 1%的琼脂凝胶上， 于 1.0×TAE 缓冲液中电泳 30
min后， 再在紫外线凝胶成像仪上观察、 照相并记录结果。
1.2.6 PCR 扩增反应产物测序及序列比对
PCR 扩增产物送上海生工胶回收后测序， 测序引物与
PCR 扩增引物相同。 对所得到的序列对照测序的峰形图，
仔细核查每一个碱基以确保其准确性。 如果同一序列是用
不同引物进行扩增， 则用 SeqMan 软件将这些序列进行拼
接后再进行比对。 将从 GenBank 中得到的序列与本研究中
所测的序列用 ClustalX 2.1 进行序列比对， 确定序列边界，
构造矩阵后再进行手工调整以保证对应碱基的同源性， 比
对完毕后采用 PAUP 4.0 进行系统发育分析。
1.2.7 DNA 序列分析
最大简约性分析 （Most Parsimony， MP）
2 研究结果与分析
2.1 基于 ITS 序列构建的云南商品牛肝菌及其易混淆毒
菌的最大简约树
ITS 具有进化速度快、 易扩增、 GenBank 中数据信息
丰富等优点， 所以常被研究者用来构建物种系统树， 阐释
物种间的亲缘关系以及物种的鉴定。 本研究用于分析的
ITS 序列有 64 条， 其中 5 条为 GenBank 中下载获得 （表
2、 图 1）。
根据系统树的拓扑结构， 云南商品牛肝菌及其易混淆
毒菌形成 5 个较大的分支。 Clade I 中的种是云南鲜菇市场
和干片商品中易见的混杂种类， 涉及裘氏牛肝菌属 [10]、圆
孔牛肝菌属、 条孢牛肝菌属、 金牛肝菌属、 松塔牛肝菌属
和牛肝菌属共 6 个属， 这 6 个属， 除了牛肝菌属外， 其余
5 个属的牛肝菌资源在地方上， 没有人将新鲜子实体直接
炒食， 老百姓都说有毒， 其中 Subclade I 是最大的混杂类
群， 流入市场的主要原因是绿盖裘氏牛肝菌资源量丰富，
采集容易， 加之当地老乡认为鲜食有毒， 但加工成干片，
可以去掉毒素 ； 其次 Subclade Ⅱ中的亚绒盖牛肝菌 （B.
subtomentosus） 是否有毒说法不一， 市场上少见新鲜子实
体出售， 此菌在各地没有人鲜食， 一般主要以干片的形式
混杂于小美牛肝菌和美柄牛肝菌中出售； 另外， Subclade
表 1 ITS 区域 PCR 扩增采用的引物及碱基组成
引物 碱基组成 （5’-3’）
ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G
表 2 分子系统发育学研究中所用材料的 GenBank 序列号
种类 序列号
Boletus aereus AY680960
Boletus reticulatus EU417871
Boletus aestivalis DQ131611
Boletus pinophilus EU417866
Boletus edulis EU417870
第 30 卷 第 5 期 35
图 1 基于 ITS 序列构建的云南商品牛肝菌及其易混淆毒菌
7 棵最大简约树之一
注： 支持率 （%） 显示在枝上 （仅显示大于 50%的支持率）。
III 中的混淆松塔牛肝菌 （Strobilomyces confusus） 也主要
以干片混杂出售。 Clade Ⅱ分支中的牛肝菌种类主要以内
销为主， 如双色牛肝菌 （B. bicolor） 是品质优良的食用
菌， 市场价值高， 茶褐牛肝菌 （B. brunneissimus） 是滇中
地区商品量较大的食用菌； 在这个分支中也存在一些食毒
说法不一的种类 [1，11，12]，如赭黄牛肝菌 （B. luridus） 和红柄
牛肝菌 （B. erythropus）。 Clade III 分支中涉及到的种类是
属于美味牛肝菌复合群， 产量大， 市场价值高， 在采集和
销售中往往当作美味牛肝菌一个种来处理 。 在 Clade IV
中 ， 紫牛肝菌 （B. violaceo-fuscus） 的食用性存在争议 ，
在一些地区 （如宜良县） 老百姓说是毒菌， 不宜采食， 而
在另一些地区 （如南华县） 有人认为可食， 但未见单独加
工食用， 常常是采集或收购加工成干片后混杂于其它牛肝
菌中销售。 另外， 紫牛肝菌 （B. violaceo-fuscus） 与牛肝
菌属 （Boletus） 其它种的亲缘关系较远， 所以紫牛肝菌是
否属于牛肝菌属值得进一步研究。 Clade Ⅴ中涉及的种，
主要用于盐渍或干片， 特别是小孢粉孢牛肝菌 （T. mi-
crosporus） 量大[10]，价格便宜， 但在当地没人食用。
2.2 云南商品牛肝菌中易混淆毒菌种类
云南多元的立体气候， 为各种牛肝菌的生长提供了良
好的生境， 培育了繁荣的野生菌市场， 经形态学与分子生
物学结合研究发现， 云南商品牛肝菌资源量大， 约占野生
菌交易量的 1/3； 物种多样性丰富， 至少涉及 16 个属； 市
场上常见易混淆的有毒牛肝菌有绿盖粉孢牛肝菌 （Chiua
virens）、 圆花孢牛肝菌 （Heimioporus retisporus）、 黄粉末
牛肝菌 （Pulveroboletus ravenelii）、 紫盖牛肝菌 （Tylopilus
eximius） 和小孢粉孢牛肝菌 （Tylopilus microsporus） 共 5种。
3 讨论
云南特殊的生境资源， 孕育了丰富的大型真菌资源。
种类多、 生态复杂使得云南牛肝菌生物多样性丰富， 种间
形态相似性较高， 这给采菌者和消费者正确识别带来较大
困难。 目前， 国内外还没有一种科学快速鉴定或检测所采
或所食牛肝菌是否为毒菌的方法或技术， 所以人们判断一
种牛肝菌是否有毒的主要依据来源于文献和当地有采菌经
验者的认识。 但是， 有时不同文献对同一物种的可食性报
道说法不一致， 导致在信息的取舍上难以抉择； 有时还出
现文献之间 [2，12]、文献与实际食用之间矛盾的情况， 如美柄
牛肝菌 （B. calopus） 和小美牛肝菌 （B. speciosus） 文献报
道有毒， 而这两个种市场量大， 消费人群广， 老百姓和消
费者都说是安全的无毒菌， 另外， 老百姓 “以貌择食” 的
传统识别方法对某一种毒菌可以， 但不能用作区分所有毒
菌的一般规律， 如双色牛肝菌颜色艳丽却是美味食用菌，
而小孢粉孢牛肝菌颜色普通则为毒菌。
从以上的分析可以看出， 目前尚无统一或简单有效识
别毒牛肝菌的方法， 这给牛肝菌可食性判断带来很大影
响， 特别是市场上的少见种， 因此在确定某一种牛肝菌是
否可食时， 必须多走访调查有采集经验的人， 经他们确认
可食时， 方可确认无毒。
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