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MEKC-DAD fingerprint of Radix et Rhizoma Rhei

大黄饮片MEKC-DAD指纹图谱的研究



全 文 :大黄饮片 MEKCDAD指纹图谱的研究
刘训红,李俊松,张月婵,蔡宝昌,尹娣
(南京中医药大学 药学院,江苏 南京 210046)
[摘要] 目的:建立大黄饮片MEKCDAD指纹图谱分析方法,并对大黄及其炮制品的指纹谱进行比较。方法:选择胶束
电动毛细管电泳分离模式,以25mmol·L-1硼砂25mmol·L-1SDS10%乙腈(pH1090)为运行缓冲液,分离电压12kV,以
大黄酸为参照物(IS),测定其指纹图谱,并作模糊聚类法分析和相似度评价。结果:初步建立了以11个共有峰为特征指纹信
息的10批大黄地产药材MEKCDAD指纹图谱;发现少数产地大黄药材的指纹图谱有一定差异,生品与其炮制品的指纹谱中
共有峰相对峰面积差异显著。结论:方法准确可靠,重复性好,可作为大黄饮片内在质量评价的依据。
[关键词] 大黄;胶束电动毛细管色谱二极管阵列检测法;指纹图谱
[收稿日期] 20090622
[基金项目] 江苏省中药炮制重点实验室开放式课题(ZYPZ007)
[通信作者] 刘训红,Tel:(025)85811511,Email:liuxunh1959@
sohucom
  大黄为历版药典收载的常用中药,系蓼科植物
掌叶大黄 RheumpalmatumL、唐古特大黄 Rtan
guticumMaximexBalf或药用大黄 Roficinale
Bail的干燥根及根茎[1],具泻热通肠,凉血解毒,逐
瘀通经之功效,历代本草均有记载。临床上用生大
黄、酒大黄、熟大黄及大黄炭。生品泻下作用峻烈,
用于实热便秘,积滞腹痛;酒炙后,其力稍缓,善清上
焦血分热毒,用于目赤咽肿,齿龈肿痛;酒炖后,泻下
力缓,主泻火解毒,用于火毒疮疡;炒炭后,泻下力极
弱,主凉血化瘀止血,用于血热有瘀出血症。现代研
究证明,大黄具抗病原微生物、真菌、病毒、肿瘤及寄
生虫等作用[2],其主要活性成分为蒽醌类化合物,
故对大黄的质量评价多以蒽醌类化合物的含量为标
准,但是这些成分的含量不一定反映大黄的整体特
征。有关大黄指纹图谱的研究已有文献报道,采用
的方法多为高效液相色谱法[3~8]或微乳电动毛细管
色谱法[9]。本文采用胶束电动毛细管色谱二极管
阵列检测法(MEKCDAD)对10批大黄地产药材进
行指纹图谱研究,并与其炮制品进行比较分析。该
法分离效果好,色谱信息多,可为大黄饮片内在质量
的综合评价和全面控制提供依据。
1 材料
AgilentG1600AX型高效毛细管电泳仪,包括
惠普化学工作站,DAD检测器,自动进样器;BUCHI
旋转蒸发仪(RotavaporR3);AG285电子天平;
PHS3C型 pH计(上海康仪仪器有限公司);KQ
500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限
公司)。
大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚及大黄素
甲醚(中国药品生物制品检定所,批号分别为
110756200110,07959803,0757200206,110796
200716,0758200206);硼砂、氢氧化钠、甲醇、十二
烷基硫酸钠(SDS)为分析纯,乙腈为色谱纯(TEDIA
公司),各种溶液配制用水均为重蒸馏水。
大黄不同产地、不同批次样品实地采集或由当地
药材公司提供,S1~S4为青海4个批次,S5~S7为四
川3个批次,S8~S10为甘肃3个批次,均经作者鉴定
为蓼科植物掌叶大黄Rpalmatum的根及根茎;炮制
品原药材为青海样品(S1),由浙江中医药大学中药饮
片厂按2005年版《中国药典》加工制得,S11酒大黄,
S12熟大黄,S13大黄炭。留样凭证存放于南京中医
药大学江苏省中药炮制重点实验室。
2 方法与结果
21 对照品溶液制备
取大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚及大黄素
甲醚对照品各5mg,精密称定,分别置于10mL量瓶
中,用80%甲醇溶解并定容至刻度;再各精密量取1
mL,置于10mL量瓶中,摇匀,用80%甲醇定容,制成
大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚质
量浓度各为50mg·L-1的混合对照品溶液。
22 供试品溶液制备
取样品粉末(过50目筛)04g,精密称定,加重
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蒸馏水30mL超声提取30min,抽滤,弃去滤液,再
加入甲醇30mL超声提取30min,抽滤,滤渣再加入
甲醇30mL超声提取30min,抽滤,合并滤液,转移
至100mL量瓶中,加80%甲醇定容至刻度,摇匀,
经045μm微孔滤膜过滤,即得供试品溶液。
23 电泳条件
未涂渍标准熔融石英毛细管75μm×645cm,
有效长度 56cm(Agilent公司);运行缓冲液 25
mmol·L-1硼砂25mmol·L-1SDS10%乙腈(pH
1090);检测波长 254nm;分离电压12kV;压力进
样5kPa,5s;毛细管温度24℃。毛细管使用前以
01mmol·L-1氢氧化钠溶液,重蒸馏水和运行缓冲
液依次通过压力冲洗5,10,5min。样品分析间隔用
缓冲液平衡5min。
24 方法学考察
241 精密度试验 取同一批次供试品(S1)溶
液,连续进样5次,测定指纹图谱,用“中药指纹图
谱相似度评价系统(2004A)”软件计算,结果相似度
均大于095,表明供试品进样精密度良好。
242 稳定性试验 取同一批次供试品(S1)溶
液,分别在1,2,4,8,16,24h进样6次,测定指纹图
谱,用“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)”软
件计算,结果相似度均大于091,说明供试品溶液
在24h内稳定。
243 重复性试验 取同一批次样品(S1)粉末6
份,平行操作,制备供试品溶液,测定指纹图谱,用
“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)”软件计
算,结果相似度均大于087,表明本法测定的重复
性尚好。
以上结果表明,指纹图谱中各色谱峰的相对迁移时
间和峰面积基本一致,相似度较高,符合指纹图谱研
究的的技术要求。
25 指纹图谱的建立
将供试品溶液分别放入自动进样的样品管中,
按选定的测试条件进行检测。同一上述实验条件
下,测定所有供试品MEKCDAD色谱图。根据不同
批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值(积分值)
和峰位(相对迁移时间)等相关参数,进行分析、比
较,制定优化的指纹图谱(图1)。
5大黄素;6芦荟大黄素;9大黄酸;10大黄酚;11大黄素甲醚。
图1 大黄的MEKCDAD指纹图谱
26 指纹图谱分析
261 共有指纹峰标定 经对供试品 MEKCDAD
色谱图的分析、比较,不同产地及不同批次大黄生品
标定11个共有峰作为指纹图谱的特征峰,5,6,9,
10,11号峰与对照品对照分别鉴定为大黄素、芦荟
大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚。以9号峰大
黄酸为参照峰,分别求出各共有峰与之相比的 α值
(调整迁移时间之比)和各共有峰的相对峰面积(峰
面积之比)(表1)。
表1  大黄MEKCDAD指纹图谱中共有峰的相对迁移时间α值和相对峰面积
峰号 α
相对峰面积
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
1 0.34 0.43 0.43 0.46 0.43 0.25 0.27 0.26 0.19 0.20 0.25
2 0.50 1.34 0.47 0.96 0.84 0.16 0.34 0.59 0.05 0.16 0.26
3 0.59 0.60 0.54 0.62 0.51 0.18 0.13 0.16 0.08 0.38 0.21
4 0.70 0.34 0.20 0.60 1.01 0.14 0.13 0.16 0.07 0.13 0.12
5 0.72 0.38 0.39 0.38 0.44 0.35 0.25 0.24 0.17 0.23 0.23
6 0.76 0.63 0.47 0.52 0.48 0.20 0.23 0.32 0.25 0.51 0.31
7 0.80 0.48 0.44 0.50 0.47 0.11 0.10 0.11 0.03 0.20 0.21
8 0.87 0.49 0.55 0.46 0.48 0.09 0.06 0.07 0.02 0.12 0.10
9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
10 1.16 0.47 0.47 0.45 0.45 0.44 0.46 0.49 0.57 0.64 0.66
11 1.31 0.05 0.05 0.07 0.06 0.09 0.08 0.08 0.08 0.08 0.15
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262 指纹图谱的聚类分析 选择大黄 MEKC
DAD指纹图谱中11个比较明显的共有峰,根据表1
中的数据,用SPSS软件中的系统聚类分析对10个
大黄样品进行聚类分析,所用聚类方法为平均距离
(组间),距离公式为欧式距离平方,得不同样品大
黄的聚类分析图(图2,3)。
图2 不同样品大黄MEKCDAD指纹图谱聚类分析图
图3 大黄MEKCDAD指纹图谱中共有峰组分
质量分数图
结果显示,当距离标尺在1时,样品 S5,S6,样
品S9,S10各归为一类;在2时,样品 S5,S6与 S9,
S10,S8归为一类;在3时,样品 S5,S6,S8,S9,S10,
S7,样品S3,S4各归为一类;在8时,样品 S3,S4与
S1归为一类;在 11时,样品 S2与 S5,S6,S8,S9,
S10,S7归为一类;当距离标尺在25时,所有样品才
归为一类。
263 色谱峰的重叠率 以大黄对照谱图(R)为
基准,按以下公式计算[待测样品与对照谱图共有
的峰数 ×2/(待测样品与对照谱图峰数和)]×
100%,S1~S10号样品色谱峰的重叠率依次为
8710%,9121%,8450%,8268%,8576%,
9012%,8910%,8125%,7453%,8212%。
264 相似度评价 将测试数据导入国家药典委
员会“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)”软
件,经校正选峰,设定匹配模式,将色谱峰自动匹配,
生成对照图谱(图4),进行色谱峰差异性评价和整
体相似性评价。各相似度值为 S10863,S20876,
S30885,S40861,S50924,S60942,S70946,
S80887,S90897,S100848。
图4 大黄样品MEKCDAD指纹图谱共有模式
265 生品与其炮制品的指纹谱比较 经对大黄生
品(S1)与其炮制品(S11,S12,S13)的指纹谱比较、分
析,酒大黄、熟大黄、大黄炭均具有生大黄的11个共
有峰,但色谱峰的重叠率、n强峰峰面积比值及色谱
图相似度均具有一定差异。以大黄生品谱图为基准,
计算炮制品色谱峰的重叠率,酒大黄、熟大黄、大黄炭
分别为8710%,7453%,8212%;以大黄素、芦荟大
黄素、大黄酸、大黄酚及大黄素甲醚为n强峰,其峰面
积比值,生大黄为1∶13∶32∶14∶02,酒大黄为1∶
05∶11∶33∶08,熟大黄为1∶06∶02∶43∶07,大黄
炭为1∶15∶21∶25∶06;以大黄生品谱图为基准,计
算炮制品色谱图的相似度,酒大黄、熟大黄、大黄炭分
别为0904,0731,0874(图5)。
3 讨论
实验考察了硼砂、硼砂SDS及硼砂SDS乙腈3
个体系的缓冲液,发现选用硼砂水缓冲液,分离度
很差,大黄酚和大黄素甲醚不能分开,在硼砂水液
加SDS,分离有所改善,但大黄素和芦荟大黄素的分
离度达不到要求,需要加入有机溶剂以增加非水物
质的溶解度,同时也会影响胶束相和流动相的性质,
进而改变溶质在水相和胶束相的分配比例,有利于
提高分离效率,当在硼砂SDS液加入乙腈后分离度
变好,故选择硼砂SDS乙腈缓冲体系。
实验考察了8~50mmol·L-1硼砂浓度的缓冲
液,结果发现迁移时间和分离度随着硼砂浓度的升
高而增大。当硼砂为25mmol·L-1时,样品各组分
分离较好,其5种蒽醌的峰形和分离度均较好,故选
择硼砂为25mmol·L-1。
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1大黄素;2芦荟大黄素;3大黄酸;4大黄酚;
5大黄素甲醚;A酒大黄;B熟大黄;C大黄炭。
图5 大黄炮制品HPCE图
缓冲液pH是影响组分迁移时间及分离度的重要因
素,实验考察了 pH92~110的缓冲液,发现随着
pH的增大,各组分的分离度增加而迁移时间延长,
峰高亦增加,当pH为1090,样品各组分分离很好,
5种蒽醌可达到基线分离,故选择缓冲液 pH为
1090。
比较10,15,20,25,30,35,40mmol·L-17个
SDS浓度下的分离情况,当 SDS为 25mmol·L-1
时,样品各组分分离较好,其5种蒽醌的峰形及迁移
时间均较好,故选择SDS为25mmol·L-1。
实验考察了 5%,10%,15%,20%乙腈对成分
分离的影响,发现乙腈在10%时,样品各组分分离
效果较好,高于此浓度,峰形变差,重复性也较差。
实验考察了分离电压在10~20kV的条件下对
各组分迁移时间的影响,结果表明分离电压增高,组
分迁移时间缩短,分离效果较差,当分离电压为12
kV时,样品各组分分离效果较好,故选择分离电压
为12kV。
实验考察了运行温度20~25℃的条件下对各
组分迁移时间的影响,结果表明运行温度越高,组分
迁移时间越短,当运行温度为24℃时样品各组分分
离效果好,且分析时间缩短,故选24℃为运行温度。
采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察,
  
记录并比较不同波长的色谱图,结果在254nm检测
波长处,色谱图中色谱峰较多,信息丰富,故选择
254nm为检测波长。
指纹谱分析结果表明,不同产地、不同批次大黄
样品之间既有相关性,又有区别。相应共有指纹峰
均已在色谱图上体现,色谱峰重叠率、指纹谱相似度
较好,但各峰面积有所不同,说明不同产地、不同批
次药材其成分含量有一定差异。通过与对照品对照
分析,大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚及大黄素
甲醚可列为大黄指纹谱共有特征峰中 n强峰,其配
比关系为(017~044)∶(020~063)∶1∶
(044~066)∶(005~015),这对评价药材质量
具有一定意义。
大黄生品与其炮制品的色谱图比较表明,酒大
黄、熟大黄、大黄炭均具有生大黄的11个共有峰,但
色谱峰的重叠率、n强峰峰面积比值及色谱图相似
度均具有一定差异。尤其是炮制前后 n强峰(大黄
素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚及大黄素甲醚)峰
面积比值变化较大,生大黄为 1∶13∶32∶14∶
02,酒大黄为1∶05∶17∶33∶08,熟大黄为1∶
06∶02∶43∶07,大黄炭为1∶15∶21∶25∶
06,这可以作为大黄饮片质量控制的一项重
要指标。
本实验初步建立了大黄饮片 MEKCDAD指纹
图谱分析方法,为大黄饮片内在质量的评价和控制
提供了依据。
[参考文献]
[1] 中国药典一部[S]2005:17
[2] 宋立人,洪恂,丁绪亮,等现代中药学大辞典[M]北京:人
民卫生出版社,2001:116
[3] 孔亮,包永明,于志远,等色谱指纹谱用于中药大黄抗肿瘤
活性成分的筛选[J]色谱,2005,23(5):470
[4] 李磊,刘瑞,袁波,等大黄 HPLC指纹图谱研究[J]中国药
学杂志,2005,40(17):1302
[5] 周剑波,蒋福全,文怀秀,等唐古特大黄乙醇提取物的HPLC
指纹图谱研究[J]分析试验室,2006,25(11):1
[6] 陈斌,蔡宝昌,潘扬,等不同产地掌叶大黄HPLC指纹图谱的
比较[J]中草药,2003,34(5):457
[7] 朱玲英,任爱农,葛进,等大黄药材蒽醌苷元类成分的HPLC
指纹图谱研究[J]中成药,2003,25(6):438
[8] 刘欣,胡芳弟,封士兰,等大黄药材指纹图谱研究[J]分析
测试技术与仪器,2004,10(3):141
[9] 李楠,潘红,丁绍东,等微乳电动毛细管色谱在掌叶大黄指
纹图谱上的应用[J]分析试验室,2008,27(9):69
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MEKCDADfingerprintofRadixetRhizomaRhei
LIUXunhong,LIJunsong,ZHANGYuechan,CAIBaochang,YINDi
(PharmacologyColege,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nangjing210046,China)
[Abstract] Objective:ToestablishtheanalyticalmethodforthefingerprintofRadixetRhizomaRheibyMEKCDADandcom
parethefingerprintsofRadixetRhizomaRheianditsprocessedproductsMethod:Basedonthemodeofmicelarelectrokineticchro
matography,25mmol·L-1borax25mmol·L-1SDS10% acetonitrilewasselectedfortherunningbufer(pH92)Theseparation
voltagewas12kVandthedetectionwavelengthwassetat254nmRheinwasusedasareferencestandard,thechromatographicfinger
printwasdeterminedviathedataanalyzedbyfuzzyclusterandfingerprintsimilarityevaluationsoftwaretocomparethesimilarityof
samplesResult:MEKCDADfingerprintswith11commonpeaksof10batchesofRadixetRhizomaRheifromtheplaceofthegenu
inewereestablishedpreliminarilyItwasdiscoveredthatasmalnumberofsamplesdiferedfromothersRegardingtothefingerprints
ofRadixetRhizomaRheianditsprocessedproducts,therewereobviousdiferencesintherelativeareasofcommonpeaksConclu
sion:Themethodisreliable,accurateandcanbeusedforqualitycontrolofRadixetRhizomaRhei
[Keywords]RadixetRhizomaRhei;MEKCDAD;fingerprint
[责任编辑 周驰]
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