全 文 ：大黄饮片 ＭＥＫＣＤＡＤ指纹图谱的研究
刘训红，李俊松，张月婵，蔡宝昌，尹娣
（南京中医药大学 药学院，南京 ２１００４６）
［摘要］ 目的：建立大黄饮片ＭＥＫＣＤＡＤ指纹图谱分析方法，并对大黄及其炮制品的指纹谱进行比较。方法：选择胶束
电动毛细管电泳分离模式，以２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１硼砂２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＳＤＳ１０％乙腈（ｐＨ１０９０）为运行缓冲液，分离电压１２ｋＶ，以
大黄酸为参照物（ＩＳ），测定其指纹图谱，并作模糊聚类法分析和相似度评价。结果：初步建立了以１１个共有峰为特征指纹信
息的１０批大黄地产药材ＭＥＫＣＤＡＤ指纹图谱；发现少数产地大黄药材的指纹图谱有一定差异，生品与其炮制品的指纹谱中
共有峰相对峰面积差异显著。结论：方法准确可靠，重现性好，可作为大黄饮片内在质量评价的依据。
［关键词］ 大黄；胶束电动毛细管色谱二极管阵列检测法；指纹图谱
［收稿日期］ ２００９０６２２
［基金项目］ 江苏省中药炮制重点实验室开放式课题（ＺＹＰＺ００７）
［通信作者］ 刘训红，Ｔｅｌ：（０２５）８５８１１５１１，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｘｕｎｈ１９５９＠
ｓｏｈｕｃｏｍ
大黄为历版药典收载的常用中药，系蓼科植物
掌叶大黄 ＲｈｅｕｍｐａｌｍａｔｕｍＬ、唐古特大黄 Ｒｔａｎ
ｇｕｔｉｃｕｍＭａｘｉｍｅｘＢａｌｆ或药用大黄 Ｒｏｆｉｃｉｎａｌｅ
Ｂａｉｌ的干燥根及根茎［１］，具泻热通肠，凉血解毒，逐
瘀通经之功效，历代本草均有记载。临床上用生大
黄、酒大黄、熟大黄及大黄炭。生品泻下作用峻烈，
用于实热便秘，积滞腹痛；酒炙后，其力稍缓，善清上
焦血分热毒，用于目赤咽肿，齿龈肿痛；酒炖后，泻下
力缓，主泻火解毒，用于火毒疮疡；炒炭后，泻下力极
弱，主凉血化瘀止血，用于血热有瘀出血症。现代研
究证明，大黄具抗病原微生物、真菌、病毒、肿瘤及寄
生虫等作用［２］，其主要活性成分为蒽醌类化合物，
故对大黄的质量评价多以蒽醌类化合物的含量为标
准，但是这些成分的含量不一定反映大黄的整体特
征。有关大黄指纹图谱的研究已有文献报道，采用
的方法多为高效相色谱法［３～８］或微乳电动毛细管色
谱法［９］。本文采用胶束电动毛细管色谱二极管阵
列检测法（ＭＥＫＣＤＡＤ）对１０批大黄地产药材进行
指纹图谱研究，并与其炮制品进行比较分析。该法
分离效果好，色谱信息多，可为大黄饮片内在质量的
综合评价和全面控制提供依据。
１ 材料
ＡｇｉｌｅｎｔＧ１６００ＡＸ型高效毛细管电泳仪，包括
惠普化学工作站，ＤＡＤ检测器，自动进样器；ＢＵＣＨＩ
旋转蒸发仪（ＲｏｔａｖａｐｏｒＲ３）；ＡＧ２８５电子天平；
ＰＨＳ３Ｃ型 ＰＨ计（上海康仪仪器有限公司）；ＫＱ
５００Ｅ型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公
司）。
大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚及大黄素
甲醚由中国药品生物制品检定所提供（批号分别为
１１０７５６２００１１０，０７９５９８０３，０７５７２００２０６，１１０７９６
２００７１６，０７５８２００２０６）；硼砂、氢氧化钠、甲醇、十二
烷基硫酸钠（ＳＤＳ）为分析纯，乙腈为色谱纯（ＴＥＤＩＡ
公司），各种溶液配制用水均为重蒸馏水。
大黄不同产地、不同批次样品实地采集或由当
地药材公司提供，Ｓ１～Ｓ４为青海４个批次，Ｓ５～Ｓ７
为四川３个批次，Ｓ８～Ｓ１０为甘肃３个批次，均经作
者鉴定为蓼科植物掌叶大黄Ｒｐａｌｍａｔｕｍ的根及根
茎；炮制品原药材为青海样品（Ｓ１），由浙江中医药
大学中药饮片厂按 ２００５年版《中国药典》加工制
得，Ｓ１１酒大黄；Ｓ１２熟大黄；Ｓ１３大黄炭。留样凭证
存放于南京中医药大学江苏省中药炮制重点实验
室。
２ 方法与结果
２１ 对照品溶液制备 取大黄素、芦荟大黄素、大
黄酸、大黄酚及大黄素甲醚对照品各５ｍｇ，精密称
定，分别置于１０ｍＬ量瓶中，用８０％甲醇溶解并定
容至刻度；再各精密量取１ｍＬ，置于１０ｍＬ量瓶中，
摇匀，用８０％甲醇定容，制成大黄素、芦荟大黄素、
大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚质量浓度各为５０ｍｇ·
Ｌ－１的混合对照品溶液。
２２ 供试品溶液制备 取样品粉末（过５０目筛）
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０４ｇ，精密称定，加重蒸馏水 ３０ｍＬ超声提取 ３０
ｍｉｎ，抽滤，弃去滤液，再加入甲醇３０ｍＬ超声提取
３０ｍｉｎ，抽滤，滤渣再加入甲醇３０ｍＬ超声提取３０
ｍｉｎ，抽滤，合并滤液，转移至 １００ｍＬ量瓶中，加
８０％甲醇定容至刻度，摇匀，经０４５μｍ微孔滤膜
过滤，即得供试品溶液。
２３ 电泳条件 未涂渍标准熔融石英毛细管 ７５
μｍ×６４５ｃｍ，有效长度５６ｃｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ公司）；运行
缓冲液 ２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１硼砂２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＳＤＳ１０％
乙腈（ｐＨ１０９０）；检测波长 ２５４ｎｍ；分离电压 １２
ｋＶ；压力进样５ｋＰａ，５ｓ；毛细管温度２４℃。毛细管
使用前以０１ｍｍｏｌ·Ｌ－１氢氧化钠溶液，重蒸馏水
和运行缓冲液依次通过压力冲洗５，１０，５ｍｉｎ。样品
分析间隔用缓冲液平衡５ｍｉｎ。
２４ 方法学考察
２４１ 精密度试验 取同一批次供试品（Ｓ１）溶
液，连续进样５次，测定指纹图谱，用“中药指纹图
谱相似度评价系统（２００４Ａ）”软件计算，结果相似度
均大于０９５，表明供试品进样精密度良好。
２４２ 稳定性试验 取同一批次供试品（Ｓ１）溶
液，分别在１，２，４，８，１６，２４ｈ进样６次，测定指纹图
谱，用“中药指纹图谱相似度评价系统（２００４Ａ）”软
件计算，结果相似度均大于０９１，说明供试品溶液
在２４ｈ内稳定。
２４３ 重复性试验 取同一批次样品（Ｓ１）粉末６
份，平行操作，制备供试品溶液，测定指纹图谱，用
“中药指纹图谱相似度评价系统（２００４Ａ）”软件计
算，结果相似度均大于０８７，表明本法测定的重复
性尚好。
以上结果表明，指纹图谱中各色谱峰的相对迁移时
间和峰面积基本一致，相似度较高，符合指纹图谱研
究的的技术要求。
２５ 指纹图谱的建立
将供试品溶液分别放入自动进样的样品管中，
按选定的测试条件进行检测。同一上述实验条件
下，测定所有供试品ＭＥＫＣＤＡＤ色谱图。根据不同
批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值（积分值）
和峰位（相对迁移时间）等相关参数，进行分析、比
较，制定优化的指纹图谱。（图１）
５大黄素；６芦荟大黄素；９大黄酸；１０大黄酚；１１大黄素甲醚。
图１ 大黄的ＭＥＫＣＤＡＤ指纹图谱
２６ 指纹图谱分析
２６１ 共有指纹峰标定 经对供试品 ＭＥＫＣＤＡＤ
色谱图的分析、比较，不同产地及不同批次大黄生品
标定１１个共有峰作为指纹图谱的特征峰，５，６，９，
１０，１１号峰与对照品对照分别鉴定为大黄素、芦荟
大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚。以９号峰大
黄酸为参照峰，分别求出各共有峰与之相比的 α值
（调整迁移时间之比）和各共有峰的相对峰面积（峰
面积之比）（表１）。
表１ 大黄ＭＥＫＣＤＡＤ指纹图谱中共有峰的相对迁移时间α值和相对峰面积
峰号 α
相对峰面积
Ｓ１ Ｓ２ Ｓ３ Ｓ４ Ｓ５ Ｓ６ Ｓ７ Ｓ８ Ｓ９ Ｓ１０
１ ０．３４ ０．４３ ０．４３ ０．４６ ０．４３ ０．２５ ０．２７ ０．２６ ０．１９ ０．２０ ０．２５
２ ０．５０ １．３４ ０．４７ ０．９６ ０．８４ ０．１６ ０．３４ ０．５９ ０．０５ ０．１６ ０．２６
３ ０．５９ ０．６０ ０．５４ ０．６２ ０．５１ ０．１８ ０．１３ ０．１６ ０．０８ ０．３８ ０．２１
４ ０．７０ ０．３４ ０．２０ ０．６０ １．０１ ０．１４ ０．１３ ０．１６ ０．０７ ０．１３ ０．１２
５ ０．７２ ０．３８ ０．３９ ０．３８ ０．４４ ０．３５ ０．２５ ０．２４ ０．１７ ０．２３ ０．２３
６ ０．７６ ０．６３ ０．４７ ０．５２ ０．４８ ０．２０ ０．２３ ０．３２ ０．２５ ０．５１ ０．３１
７ ０．８０ ０．４８ ０．４４ ０．５０ ０．４７ ０．１１ ０．１０ ０．１１ ０．０３ ０．２０ ０．２１
８ ０．８７ ０．４９ ０．５５ ０．４６ ０．４８ ０．０９ ０．０６ ０．０７ ０．０２ ０．１２ ０．１０
９ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １
１０ １．１６ ０．４７ ０．４７ ０．４５ ０．４５ ０．４４ ０．４６ ０．４９ ０．５７ ０．６４ ０．６６
１１ １．３１ ０．０５ ０．０５ ０．０７ ０．０６ ０．０９ ０．０８ ０．０８ ０．０８ ０．０８ ０．１５
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２６２ 指纹图谱的聚类分析 选择大黄 ＭＥＫＣ
ＤＡＤ指纹图谱中１１个比较明显的共有峰，根据表１
中的数据，用ＳＰＳＳ软件中的系统聚类分析对１０个
大黄样品进行聚类分析，所用聚类方法为平均距离
（组间），距离公式为欧式距离平方，得不同样品大
黄的聚类分析图。（图２，３）
图２ 不同样品大黄ＭＥＫＣＤＡＤ指纹图谱聚类分析图
图３ 大黄ＭＥＫＣＤＡＤ指纹图谱中共有峰组分含量图
结果显示，当距离标尺在１时，样品Ｓ５，Ｓ６，样品Ｓ９，
Ｓ１０各归为一类；在２时，样品 Ｓ５，Ｓ６与 Ｓ９，Ｓ１０，Ｓ８
归为一类；在３时，样品Ｓ５，Ｓ６，Ｓ８，Ｓ９，Ｓ１０，Ｓ７，样品
Ｓ３，Ｓ４各归为一类；在８时，样品 Ｓ３，Ｓ４与 Ｓ１归为
一类；在１１时，样品 Ｓ２与 Ｓ５，Ｓ６，Ｓ８，Ｓ９，Ｓ１０，Ｓ７归
为一类；当距离标尺在２５时，所有样品才归为一类。
２６３ 色谱峰的重叠率 以大黄对照谱图（Ｒ）为
基准，按以下公式计算［待测样品与对照谱图共有
的峰数 ×２／（待测样品与对照谱图峰数和）］×
１００％，Ｓ１～Ｓ１０号样品色谱峰的重叠率依次为
８７１０％，９１２１％，８４５０％，８２６８％，８５７６％，
９０１２％，８９１０％，８１２５％，７４５３％，８２１２％。
２６４ 相似度评价 将测试数据导入国家药典委
员会“中药指纹图谱相似度评价系统（２００４Ａ）”软
件，经校正选峰，设定匹配模式，将色谱峰自动匹配，
生成对照图谱（图４），进行色谱峰差异性评价和整
体相似性评价。各相似度值为 Ｓ１０８６３，Ｓ２０８７６，
Ｓ３０８８５，Ｓ４０８６１，Ｓ５０９２４，Ｓ６０９４２，Ｓ７０９４６，
Ｓ８０８８７，Ｓ９０８９７，Ｓ１００８４８。
图４ 大黄样品ＭＥＫＣＤＡＤ指纹图谱共有模式
２６５ 生品与其炮制品的指纹谱比较 经对大黄生
品（Ｓ１）与其炮制品（Ｓ１１，Ｓ１２，Ｓ１３）的指纹谱比较、分
析，酒大黄、熟大黄、大黄炭均具有生大黄的１１个共
有峰，但色谱峰的重叠率、ｎ强峰峰面积比值及色谱
图相似度均具有一定差异。以大黄生品谱图为基准，
计算炮制品色谱峰的重叠率，酒大黄、熟大黄、大黄炭
分别为８７１０％，７４５３％，８２１２％；以大黄素、芦荟大
黄素、大黄酸、大黄酚及大黄素甲醚为ｎ强峰，其峰面
积比值，生大黄为１∶１３∶３２∶１４∶０２，酒大黄为１∶
０５∶１１∶３３∶０８，熟大黄为１∶０６∶０２∶４３∶０７，大黄
炭为１∶１５∶２１∶２５∶０６；以大黄生品谱图为基准，计
算炮制品色谱图的相似度，酒大黄、熟大黄、大黄炭分
别为０９０４，０７３１，０８７４。（图５）
１大黄素；２芦荟大黄素；３大黄酸；４大黄酚；
５大黄素甲醚；Ａ酒大黄；Ｂ熟大黄；Ｃ大黄炭。
图５ 大黄炮制品ＨＰＣＥ图
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３ 讨论
实验考察了硼砂、硼砂ＳＤＳ及硼砂ＳＤＳ乙腈３
个体系的缓冲液，发现选用硼砂水缓冲液，分离度
很差，大黄酚和大黄素甲醚不能分开，在硼砂水液
加ＳＤＳ，分离有所改善，但大黄素和芦荟大黄素的分
离度达不到要求，需要加入有机溶剂以增加非水物
质的溶解度，同时也会影响胶束相和流动相的性质，
进而改变溶质在水相和胶束相的分配比例，有利于
提高分离效率，当在硼砂ＳＤＳ液加入乙腈后分离度
变好，故选择硼砂ＳＤＳ乙腈缓冲体系。
实验考察了８～５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１硼砂浓度的缓冲
液，结果发现迁移时间和分离度随着硼砂浓度的升
高而增大。当硼砂为２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１时，样品各组分
分离较好，其５种蒽醌的峰形和分离度均较好，故选
择硼砂为２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１。
缓冲液ｐＨ是影响组分迁移时间及分离度的重
要因素，实验考察了 ｐＨ９２～１１０的缓冲液，发现
随着ｐＨ的增大，各组分的分离度增加而迁移时间
延长，峰高亦增加，当ｐＨ为１０９０，样品各组分分离
很好，５种蒽醌可达到基线分离，故选择缓冲液 ｐＨ
为１０９０。
比较１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０ｍｍｏｌ·Ｌ－１７个
ＳＤＳ浓度下的分离情况，当 ＳＤＳ为 ２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１
时，样品各组分分离较好，其５种蒽醌的峰形及迁移
时间均较好，故选择ＳＤＳ为２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１。
实验考察了 ５％，１０％，１５％，２０％乙腈浓度对
成分分离的影响，发现乙腈在１０％时，样品各组分
分离效果较好，高于此浓度，峰形变差，重复性也较
差。
实验考察了分离电压在１０～２０ｋＶ的条件下对
各组分迁移时间的影响，结果表明分离电压增高，组
分迁移时间缩短，分离效果较差，当分离电压为１２
ｋＶ时，样品各组分分离效果较好，故选择分离电压
为１２ｋＶ。
实验考察了运行温度２０～２５℃的条件下对各
组分迁移时间的影响，结果表明运行温度越高，组分
迁移时间越短，当运行温度为２４℃时样品各组分分
离效果好，且分析时间缩短。故选２４℃为运行温
度。
采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，
记录并比较不同波长的色谱图，结果在２５４ｎｍ检测
波长处，色谱图中色谱峰较多，信息丰富，故选择
２５４ｎｍ为检测波长。
指纹谱分析结果表明，不同产地、不同批次大黄
样品之间既有相关性，又有区别。相应共有指纹峰
均已在色谱图上体现，色谱峰重叠率、指纹谱相似度
较好，但各峰面积有所不同，说明不同产地、不同批
次药材其成分含量有一定差异。通过与对照品对照
分析，大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚及大黄素
甲醚可列为大黄指纹谱共有特征峰中 ｎ强峰，其配
比关系为（０１７～０４４）∶（０２０～０６３）∶１∶（０４４
～０６６）∶（００５～０１５），这对评价药材质量具有一
定意义。
大黄生品与其炮制品的色谱图比较表明，酒大
黄、熟大黄、大黄炭均具有生大黄的１１个共有峰，但
色谱峰的重叠率、ｎ强峰峰面积比值及色谱图相似
度均具有一定差异。尤其是炮制前后 ｎ强峰（大黄
素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚及大黄素甲醚）峰
面积比值变化较大，生大黄为 １∶１３∶３２∶１４∶
０２，酒大黄为１∶０５∶１１∶３３∶０８，熟大黄为１∶
０６∶０２∶４３∶０７，大黄炭为１∶１５∶２１∶２５∶
０６，这可以作为大黄饮片质量控制的一项重要指
标。
本实验初步建立了大黄饮片 ＭＥＫＣＤＡＤ指纹
图谱分析方法，为大黄饮片内在质量的评价和控制
提供了依据。
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ｖｏｌｔａｇｅｗａｓ１２ｋＶａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓｓｅｔａｔ２５４ｎｍＲｈｅｉｎｗａｓｕｓｅｄａｓａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｔａｎｄａｒｄ，ｔｈｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｆｉｎｇｅｒ
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［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ＲａｄｉｘｅｔＲｈｉｚｏｍａＲｈｅｉ；ＭＥＫＣＤＡＤ；ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ
［责任编辑 周驰］
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