全 文 ：足测定要求 。在此基础上考察了氯仿 、二氯甲烷 、叔丁基甲
醚 、环己烷 、正己烷 、正庚烷 、乙酸乙酯 、丙酮等多种有机溶剂
的萃取效果 ,其中乙酸乙酯萃取效率最高 , 可满足分析测定要
求。故本实验选择 1mol·L-1氢氧化钠溶液作为碱化试剂 ,乙
酸乙酯作为萃取溶剂。
大鼠灌胃靛玉红后的血药浓度达峰时间 Tmax为 16.4h ,
可以看出靛玉红吸收较为缓慢 , 并且血药浓度 Cmax仅为
0.022±0.01mg·L-1 , 绝对生物利用度只有 10.19%。造成这
种现象的原因可能与首过效应以及靛玉红的水溶性差有
关〔6〕。
综上所述 ,采用超声 、碱化及萃取等方法对大鼠全血样品
进行处理 , 可有效去除杂质 、减少采血量 , 经本法处理的血样
可满足实验及分析要求 。方法操作简便 、重现性好。为研究
靛玉红大鼠体内药动学过程提供了一个简便可靠的方法。
参考文献
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新疆紫草水提部位对小鼠 T 淋巴细胞亚群和血液学指标的影响
米克热帕·阿布都买买提1 , 2 ,买尔旦·马合木提1 ,2＊ ,古丽仙·胡加1(1.新疆医科大学附属肿瘤医院 乌鲁木齐
830011;2.新疆医科大学药剂教研室 乌鲁木齐 830011)
摘要:目的　观察新疆紫草水提部位对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。方法　以腹腔注射环磷酰胺(CTX)制造小鼠免疫抑制模型 ,应用新疆
紫草水提部位给小鼠连续灌胃 15天 ,经流式细胞仪对小鼠 T 淋巴细胞亚群进行测定 ,用血细胞分析仪测定血液学指标。结果　新疆紫草水提
部位能显著增加免疫低下小鼠的 CD+3 、CD +4 T 淋巴细胞的百分含量 ,增高 CD+4 / CD+8 比值 ,降低CD +8 T 淋巴细胞的百分含量;同时提高血液中红
细胞 、白细胞 、淋巴细胞计数和提高血红蛋白量 、淋巴细胞百分比。结论　新疆紫草水提部位可以有效地调节机体的兔疫功能。
关键词:新疆紫草;T 淋巴细胞亚群;血液学指标;流式细胞仪
中图分类号:R969　文献标识码:A　文章编号:1006-3765(2012)-02-0026-03
作者简介:米克热帕·阿布都买买提 ,女。硕士研究生。研究方向:中药民族药研究。联系电话:15292852913 , E-mail:mk rpyl@126.com
通讯作者:买尔旦·马合木提 ,男(维吾尔族)。教授 ,硕士生导师。主要从事中药民族药的开发工作。联系电话:09917968007 , E-mail:maierdan60
@sina.com
基金项目:国家自然科学基金(项目编号:81060356)
Effects of water extraction site of Arnebia euchroma(Royal)Johnston on
subgroups of T lymphocytes and haematological Indexes in mice
Mikerepa·Abudumaimaiti1 ,Maierdan·Mahemuti1 ,2＊ , gulixian·hujia1(1.The tumor Hospital aff iliated to Xinjiang
Medical University ,Urumqi 830011 ,China;2.Department of pharmaceut ics ,Xinjiang Medical University , Urumqi
8300112 , Chian)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To investigate the Immunomodulatory ef fects of w ater ext racts from Arnebia euchro-
ma (Royal)Johnston(AE)on immune deficit mice.METHODS　The immune def icit mice modal w ere induced
w ith cyclophosphamide(CTX)by ip.The w ater ext racts of AE were given to the mice by ig fo r 15 days continu-
·26·
海峡药学　2012年　第 24卷 第 2期
ously.T cell subsets were analyzed w ith f low cytometer.Haematological Indexes were analyzed with Hematology
analy zer.RESULTS 　The water ext racts of AE markedly reduced the number of CD+3 、CD+4 T cell , CD+4 /
CD+8 ratio ,while those of CD+8 T cells increased;Meanwhile , the number of RBC 、WBC 、LY 、Hb , LY% ratio in-
creased.CONCLUSION　The w ater ex t racts of AE can effectively improve the immunological function.
KEY WORDS:Arnebia euchroma(Royal)Johnston;Cyclophosphamide;Subgroups of T lymphocytes;Haematological Indexes;Flow
Cy tometer
　　新疆紫草 Arnebia euchroma 为紫草科 Boraginaceae 多年
生草本植物 ,以根入药。 以往研究表明紫草具有抗病原微生
物 、抗炎及抗过敏 、抗生育 、解热 、抗肿瘤 、保肝 、止血 、降血糖 、
镇静和影响免疫功能等作用〔1〕。 现代药理学研究证明 , 紫草
丙酮水提取物具有抗 HIV-l活性〔2〕 , 其 70%含水丙酮提取物
具有对抗急性感染的 H9 细胞中的 HIV 复制的作用。本课题
组〔3〕在以往的研究中发现新疆紫草根的水溶性提取物在
M T-2 细胞系对 HIV 感染的 M T-2 细胞有明显的抑制作用 ,
对 HIV-1 整合酶具有一定的抑制活性。 AIDS 是由 HIV 引起
的一组综合征 ,HIV 主要侵犯人 CD+4 T 淋巴细胞 , 导致其数
量上的减少和功能缺陷 , 使机体免疫平衡被打破造成免疫功
能低下 ,最终导致各种机会感染和肿瘤。因而 , 免疫调节作用
对防治 AIDS 有着重要的意义。为进一步了解新疆紫草水提
部位(Water ex traction site o f A rnebia euchroma(Royal)John-
ston , WEAE)对免疫抑制小鼠免疫功能的影响 ,我们初步考察
了WEAE 对免疫抑制小鼠的脏器指数 、吞噬指数 、血清溶血
素水平和淋巴细胞增殖率等指标的影响。结果显示 , WEAE
可明显提高免疫抑制小鼠的胸腺指数 、脾脏指数和吞噬指数 ,
升高血清 HC50值和脾淋巴细胞 OD 值。本实验考察了
WEAE 对免疫低下小鼠 T 淋巴细胞亚群和血液学指标的影
响 ,旨在明确新疆紫草免疫调节作用的物质基础 , 为进一步开
发利用新疆紫草积累基础研究资料。
1　仪器与材料
冷冻干燥机(美国 Edwards pirani1001), 分析天平(中山
市衡新电子有限公司), TDL5A-WS 台式低速离心机(湘仪),
旋转蒸发仪 RE-52(上海亚荣生化仪器厂), IX71-12FL/ PH 研
究级荧光倒置三目显微镜(上海优浦科学仪器有限公司), 流
式细胞仪(FCM , Flow Cytometer COULTER EPICS AL-
TRETM), 全自动血细胞分析仪 LH-750 型/AL14117(Back-
man Coulter 有限公司), 灌胃管 , 注射器。新疆紫草(新疆参
茸药业有限责任公司 , 批号 10082004), 注射用环磷酰胺(江
苏恒瑞医药股份有限公司 , 批号 32020857), 香菇菌多糖片
(福建省闽东力捷迅药业有限公司 , 批号 35021351), CD3-Per-
CP(美国 Becton Dickinson 公司产品 , 货号 553065), CD4-PE
(美国 Becton Dickinson 公司产品 , 货号 553048), CD8-FITC
(美国 Becton Dickinson 公司产品 ,货号 553030), DMEM 培养
液(Hyclone公司产品 , 批号 NWG0446), 胎牛血清(Gibco 产
品 ,批号 12657029)。昆明种小鼠 , 体质量 18 ～ 22g , 雌雄各
半 ,由新疆医科大学动物实验中心提供 , 合格证号:SCXK(新)
2003-0001。
2　方法
2.1　供试品的制备　称取新疆软紫草干燥根 ,适量 ,剪碎 , 用
石油醚加热回流 3次 , 回收溶剂 ,得到沉红色粘稠状的石油醚
提取物。药材残渣用 70%丙酮水溶液回流 3 次 , 每次 2h , 合
并滤液 , 减压回收丙酮。所得水溶液适当浓缩后 , 依次用乙酸
乙酯 、正丁醇萃取 ,回收溶媒 , 冷冻干燥 , 得乙酸乙酯提取物 、
正丁醇提取物和水层萃取物。将水层萃取物加适量水混悬 ,
依次经 MCI-GEL CHP20P、Sephadex LH-20 及 ODS-A C18柱
层析 , 以水-甲醇体系洗脱 , 冷冻干燥 , 得水溶性部位(以下简
称水提物 , WEAE)。 临用前 , 水提物用蒸馏水溶解。 参照
2011年版药典 , 生药紫草的临床患者用量 5 ～ 9g/(人·天)。
则小鼠给药剂量计算方法为:(WEAE 的提取率×患者用量
×9.01×1000/60kg)mg·kg-1 。
2.2　动物分组及给药方法　取小鼠 60只 , 雌雄各半 ,随机分
为模型组(环磷酰胺:50mg·kg-1)、空白对照组(生理盐水)、
阳性对照组(香菇菌多糖片:4.5mg·kg-1);WEAE 高 、中 、低
剂量(3.3、2.6 、1.8mg·kg-1)共 6 组 , 每组 10 只。各给药组 ,
每天灌胃给药 1次 , 连续给药 15d。
2.3　流式细胞仪检测免疫低下小鼠 T 淋巴细胞亚群　分组
及给药方法同“ 2.2” ,第 2 天起 , 除空白对照组外 ,其他各组灌
胃的同时腹腔注射环磷酰胺 , 空白对照组注射生理盐水 , 连续
3 天。末次给药后 24h 于颈椎脱臼处死小鼠后取脾 , 用 PBS
常规制备脾细胞悬液 , 加入红细胞裂解液 20μL 使红细胞裂
解 , 调整细胞浓度为 1×105 ～ 1×106·mL-1 , 取脾细胞悬液
200μL ,依次取 5μL CD3-PerCP 、5μL CD4-PE 、2μL CD8-F ITC
加入离心管中 , 混匀避光反应 30min , 取 PBS 1mL 加入到离心
管中 , 离心去上清。 再加入 500μL PBS , 用 COULTZER
EPICS XL-MCL 流式细胞仪测定 CD+3 、CD+4 、CD+8 的水平。
2.4　对免疫低下小鼠血液学指标的影响　末次给药后24h摘
眼球抗凝取血 , 以全自动血细胞分析仪测定小鼠红细胞计数
(RBC)、白细胞计数(WBC)、淋巴细胞(LY)计数 、血红蛋白
(Hb)、淋巴细胞百分比(LY%)。
2.5　数据处理　各组间比较用单因素方差分析 , 数据 x±s
用表示 , 采用 SPSS 17.0系统软件包进行统计学处理。
3　结果
3.1　WEAE 对 T 淋巴细胞亚群的影响　与空白对照组相
比 , 模型组小鼠的 CD+3 、CD+4 和 CD+4 /CD+8 比值均下降 , CD+8
水平升高 , 其差异有统计学意义(P <0.05), 说明造模成功;
与模型组比较 , WEAE 各剂量组的 CD+3 、CD+4 、CD+8 水平和
CD+4 /CD+8 比值均有显著升高(P<0.05)。其中 ,中剂量组对
其影响明显。 与阳性对照组比较 , 各剂量组对 CD+3 、CD+4 、
CD+8 值的影响不如阳性对照组明显。提示 , WEAE 能提高小
·27·
Strait Pharmaceutical Journal Vol 24 No.2 2012
鼠 CD+3 、CD+4 、CD+8 水平 ,提高 CD+4 / CD+8 比值(见表 1)。
3.2　WEAE 对免疫低下小鼠血液学指标的影响　与空白对
照组相比 , 模型组小鼠的 RBC 、WBC 、LY、Hb、LY%均下降 ,
其差异有统计学意义(P<0.05),说明造模成功;与模型组比
较 ,WEAE 各剂量组的 RBC 、LY 和 Hb 均有显著升高(P <
0.05)。 WEAE 高 、中剂量组 LY%和 WBC 显著升高(P <
0.05), WEAE 低剂量组淋巴细胞百分比也有所升高 , 但其差
异无统计学意义(P>0.05)。 其中 , 中剂量组对 RBC、WBC、
LY、Hb 、LY%的影响比较明显。提示 , WEAE 能提高小鼠的
RBC、WBC 、LY、Hb 、LY%(见表 2)。
表 1　WEAE对免疫低下小鼠 T 淋巴细胞亚群的影响　(n=10 , x±s , %)
组别 剂量(mg·kg -1) CD +3 CD +4 CD +8 CD +4 / CD +8
空白对照组 - 53.63±7.92 44.16±8.06 26.02±5.18 1.74±0.38
模型组 50 42.79±6.76a 35.99±4.98a 28.43±5.13a 1.29±0.20a
阳性对照组 4.5 62.42±8.30 57.74±6.32 37.32±2.80 1.56±0.24
高剂量组 3.3 54.98±7.50bc 42.72±5.42c 31.09±6.34c 1.46±0.35
中剂量组 2.6 59.53±6.66b 50.25±7.62c 35.34±5.83b 1.46±0.35
低剂量组 1.8 47.9±9.61c 36.83±8.41bc 28.85±8.13c 1.32±0.28
注:与空白对照组比较 , aP<0.05;与模型组比较 , bP<0.05;与阳性对照组比较 , cP<0.05
表 2　WEAE对免疫低下小鼠血液学指标的影响(n=10 , x±s)
组别 剂量(mg·kg -1) LY% LY WBC(×109/ L) RBC(×1012/ L) Hb(g·L -1)
空白对照组 - 79.34±5.65 4.54±1.01 6.3±1.31 4.5±1.78 138.66±14.02
模型组 50 73.67±8.63a 3.44±0.57a 5.81±1.64a 3.8±0.97a 104.5±20.7a
阳性对照组 4.5 80.51±12.1 4.15±0.74 6.3±0.97 6.1±0.97 139.57±11.73
高剂量组 3.3 85.37±7.74b 4.41±1.59b 5.1±1.54b 5.1±1.54b 140.87±11.21b
中剂量组 2.6 87.61±7.41b 5.42±2.4b 6.12±2.49b 6.62±1.21b 142.87±9.37b
低剂量组 1.8 82.57±10.54 3.5±0.85b 5.32±1.26 4.9±1.15b 137.71±11.69b
注:与空白对照组比较 , aP<0.05;与模型组比较 , bP<0.05
4　讨论
环磷酰胺是一种细胞毒性药物 , 它能杀死有丝分裂和进
入循环周期的细胞 ,能够显著降低机体的免疫水平 , 杀伤淋巴
细胞 ,常作为细胞免疫研究中的免疫抑制的模型制备药物。
T 淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一群细胞。
在正常机体内各淋巴细胞亚群相互作用 , 维持着机体正常免
疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时 , 可
导致机体免疫功能紊乱并发生一系列病理变化。因此 , T 淋
巴细胞亚群的免疫分型能够提供有关患者免疫状态的重要信
息。在 T 淋巴细胞分类中 , CD+3 T 为成熟 T 细胞表面标志 ,
CD
+
3 细胞水平反映总 T 淋巴细胞水平;CD+4 T 是辅助性 T 细
胞(Th ,包括 Th1 和 Th2)表面标志 , 是免疫反应的中心细胞 ,
它通过分泌多种淋巴因子激活其他 T 、B 细胞亚群及参与免
疫反应的其他细胞 ,使其增殖和分化 , 并协调免疫细胞间的相
互作用 , 发挥机体免疫系统的功能〔4〕;而 CD+8 T 是杀伤性 T
细胞(CTL)和抑制性 T 细胞(Ts)表面标志 ,是免疫反应的效
应细胞;CD+4 /CD+8 比值表示免疫功能状态〔5〕 , CD+4 /CD+8 的
比值上升 , 提示免疫应答的正调节占优势 , 而比值下降 , 提示
免疫功能低下。
本实验研究免疫抑制小鼠脾细胞悬液中 T 淋巴细胞亚
群 ,发现 CD+4 、CD+8 T 细胞显著下降 , CD+4 /CD+8 浓度降低 ,说
明免疫抑制后机体细胞免疫功能紊乱。并且发现 WEAE 能
够提高免疫低下小鼠脾细胞悬液中 CD+3 、CD+4 T 细胞的量和
CD+4 /CD+8 比值。 此外 , WEAE 均有降低免疫低下小鼠
CD+8 T细胞的作用 ,说明WEAE通过提高成熟 T 淋巴细胞数
量 , 调节 T 淋巴细胞亚群比例 , 提高细胞分泌的含量 , 达到纠
正细胞免疫功能紊乱的作用。
本实验研究免疫抑制小鼠的血液学指标 , 发现血液中
RBC、WBC 、LY、Hb 、LY%都下降 , 并且发现 WEAE 能提高免
疫低下小鼠血液中 RBC 、WBC、LY、Hb、LY%。
综上所述 , WEAE 可以有效地调节环磷酰胺致免疫低下
小鼠的兔疫功能。
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