全 文 ：第 30卷　第 4期 海 洋 环 境 科 学 Vol.3 0 , No.4
2 0 1 1年 0 8月 MARINEENVIRONMENTALSCIENCE August2 0 1 1
【调查与研究】
两种粒径氧化镍纳米颗粒对小球藻
(Chlorelavulgaris)的生物毒性
巩　宁 1 ,邵魁双 2 ,梁长华 1 ,王　阳 2 ,姜　涛 1 ,冯　威3 , 孙野青 1
(1.大连海事大学环境系统生物学研究所 ,辽宁大连 116026;2.国家海洋环境监测中心 ,辽宁 大连 116023;3.大连海事大
学 物理系 ,辽宁大连 116026)
摘　要:采用藻类生物毒性测试方法(OECD201)研究了两种粒径氧化镍(NiO)纳米颗粒对小球藻(Chlorelavulgaris)的生
物毒性。发现纳米颗粒的毒性与其尺度有关 , 7 nmNiO的毒性大于 20 nmNiO,二者 72 hEC50分别为 18.01和 74.64mg
NiO/L。利用扫描电子显微镜(SEM)观察了对照组与 nNiO处理组小球藻的表面结构 ,处理组小球藻出现了表面皱缩和塌
陷 、细胞结构不完整等现象。纳米材料暴露下 ,藻类细胞与纳米颗粒发生团聚 、共沉淀现象 ,小球藻表面覆盖了大量 NiO颗
粒。纳米材料引起的遮光效应是小球藻生长抑制的原因之一。
关键词:NiO;纳米颗粒;小球藻;生物毒性;生长抑制;扫描电镜;团聚
中图分类号:Q945.78　　文献标识码:A　　文章编号:1007-6336(2011)04-0457-04
Biotoxicityoftwo-sizenickeloxidenanoparticlesonChlorelavulgaris
GONGNing1 , SHAOKui-shuang2 , LIANGChang-hua1 , WANGYang2 , JIANGTao1 , FENGWei3 , SUNYe-qing1
(1.InstituteofEnvironmentalSystemsBiology, DalianMaritimeUniversity, Dalian116026, China;2.NationalMarineEnvironmental
MonitoringCenter, Dalian116023, China;3.PhysicalDepartment, DalianMaritimeUniversity, Dalian116026, China)
Abstract:Biotoxicityoftwo-sizenickeloxidenanoparticlesonChlorelavulgarisweredeterminedbyalgalgrowthinhibitiontestand
morphologicobservationviascanelectronmicroscopy(SEM).ResultsshowedthatnNiOhadsevereimpactsonalgae, causedgrowth
inhibitionandmorphologicchanges.The7nmnNiOshowedhighertoxicthan20nmnNiO, with72hEC50 valuesof18.01and74.64
mgNiO/L, respectively.UnderthestressofNiOnanoparticles, C.vulgariscellsbecamewrinkledandcollapsed, andtheintegralityof
partofcelshasbeendestroyed.NiOnanoparticlesformedcoagulationanddepositedinalgalculturemedia.Thepresenceofalgalcels
acceleratedaggregationofnanoparticles.Theaggregatesatachedandrecoveredalgalcellsurface, resultinginthereductionofavailable
light, wasoneofthetoxiccausesofnanoparticlesonmicroalgae.
Keywords:NiO;nanoparticles;Chlorelavulgaris;biotoxicity;growthinhibition;SEM;aggregation
　　随着纳米材料的广泛应用 , 纳米生物毒性研究得到
越来越多的关注 [ 1, 2] 。在水生纳米毒理学研究方面 , 多集
中在富勒烯 、nTiO2、 nZnO、nCuO等大规模生产和使用的
纳米材料上。研究发现这些纳米粒子会对水生生物产生
各种影响 , 如藻类的生长抑制 [ 3] , 浮游动物的急性毒性 [ 4]
以及鱼类脑部的过氧化反应 [ 5]等 , 但对于海洋环境中工
业生产活动无意暴露和释放的纳米粒子对海洋生物毒性
的研究则鲜有报道。
氧化镍纳米颗粒(nNiO)作为一种功能材料 , 主要用
作燃油催化剂 、着色剂 、磁性材料和电子元件等 , 同时大
量存在于汽车尾气和焊接废气中 [ 6] 。随着我国沿海临港
工业群迅猛发展 , 大型临港机械加工制造厂及大型船舶
　　收稿日期:2010-09-01,修订日期:2011-04-06
基金项目:国家自然科学基金(20977012);交通部基础研究项目(2007329225040);国家海洋局近岸海域生态环境重点实验室开放
基金(201017)
作者简介:巩 宁(1975-),女 ,辽宁省大连市人 ,讲师 ,主要从事海洋环境有害物质的系统生物学研究 , E-mail:cospar06@dlmu.edu.cn
通讯作者:孙野青 , E-mail:yqsun@hit.edu.cn
海　洋　环　境　科　学 第 30卷
修造企业不断增加 , 其生产过程中所产生的尾气含有大
量的 NiO纳米粒子 [ 7] , 成为海洋环境的重要纳米污染源
之一 , 亟待对其进行毒性研究和危害评估。本文选取海
洋微藻小球藻(Chlorelavulgaris)作为受试对象 , 研究了
两种粒径 nNiO的生物毒性 ,以期为水生纳米毒理研究提
供基础数据 , 并为纳米污染的防治 、风险评估提供依据。
1　材料与方法
1.1　nNiO的制备与结构表征
采用李永仙等的均匀沉淀法 [ 8] , 制备了平均粒径 20
nm的 nNiO;采用固相法制备了平均粒径 7 nm的 nNiO。
具体步骤如下:按摩尔比为 1∶1准确称取Na
2
CO
3
· 10H
2
O
和 Ni(NO3)2· 6H2O, 置于玛瑙研钵中 , 混匀后研磨 ,约 3
min,观察到混合物有少量气泡且呈稠状 , 颜色由蓝色转
为绿色。充分研磨 30 min后 , 将混合物转移至高速离心
试管中 , 用去离子水洗涤沉淀 6 ～ 8次 , 再用无水乙醇洗
涤 2次 , 至无杂质离子。于 60℃下干燥 15 h,得浅绿色粉
体(NiCO3· 4H2O), 将该粉体置于马弗炉中 , 在 300℃下
焙烧 2 h,得黑色 NiO纳米颗粒。
利用透射电镜(TEM)和 X-射线衍射分析(XRD)对
所制备的纳米材料进行结构表征 ,确定其平均粒径大小。
1.2　nNiO悬浊液的制备
在消毒过滤海水中加入一定量的 nNiO纳米颗粒 ,磁
力搅拌 48h,使其充分分散 ,制得相应浓度的氧化镍悬浊
液用于藻类生长抑制实验。悬浊液浓度为测试浓度的 2
倍 , 实验时加入等量的藻液 ,稀释至所需浓度。
1.3　藻类生长抑制实验
小球藻来源于国家海洋环境监测中心。按照 OECD
201[ 9]的标准方法配置不同浓度 nNiO测试溶液。藻液初
始细胞数为 106 cell/mL。实验期间培养条件为, 温度:
(23±1) ,光强:3000 ～ 3500 lx, 光暗周期比为 12∶12。实
验烧瓶放置在水平往复式摇床上 , 设定摆动:停止周期为
30min∶15min,保持紊流状态 , 以模拟自然水体条件。每个
处理组设三个平行 ,每组实验重复三次。每隔 24 h测定各
组藻液在 685nm的 OD值(贝克曼 DU800紫外 /可见分光
光度计),据方程 y=48.08x+0.599(R2 =0.996,其中 x为
OD685 , y为细胞数)计算各组的细胞数。按以下公式计算
生长抑制率:抑制率%= [ 1-N/N0] ×100%。其中:N为
各处理组的细胞数;N0为对照组的细胞数。
1.4　小球藻细胞的扫描电镜(SEM)观察
对 20nmnNiO处理 72 h后的小球藻进行了扫描电
镜观察。藻细胞用 2.5%的戊二醛固定 , 固定后的细胞
经叔丁醇梯度逐级脱水后真空干燥 、喷金 , 于扫描电子显
微镜下(JEM-2000FX)观察。
1.5　数据分析
利用 SPSS13.0 软件计算各处理组两种粒径 NiO
95%置信区间下的半数效应浓度(EC50)、抑制率及显著
性分析 , 结果以平均值 ±标准差(SD)表示。
2　结果与讨论
2.1　nNiO的结构表征
20 nmnNiO的结构表征同李永仙 [ 8] 。
7 nmnNiO的结构表征如图 1。图中可见 , 粒子形状
类似球形 , 粒度分布较均匀 , 平均粒径为 7 nm左右 , 选区
电子衍射结果表明制备的 NiO纳米粒子呈非晶状态。插
图中 XRD的测试结果表明制备的 NiO为纯相的 NiO, 根
据布拉格公式计算得晶粒尺寸约为 7 nm, 与 TEM结果相
一致。
图 1　nNiO纳米颗粒的 TEM图(插图 1为选区电子衍射
图;插图 2为 X射线衍射图)
Fig.1 TEMmicrographofNiOnanoparticles(theinset1 is
themicrographcorrespondstotheelectrondifraction
imageofNiOnanoparticles;theinset2 istheX-ray
diffractionspectrum.)
2.2　nNiO对小球藻生长的影响
图 2a为不同浓度(1、 5、 10、30、 50 mg/L)20 nmnNiO
对小球藻生长的影响。由图可见 , 在暴露初期 ,不同浓度
的处理组对小球藻生长状况的影响差别不大 , 随着暴露
时间的延长 , 48 h后出现明显的抑制效应。随着 NiO纳
米颗粒处理浓度的增加 , 生长抑制程度不断增强。在低
浓度处理下(1 mg/L、10 mg/L), 抑制率出现负值 , 说明低
浓度的处理对小球藻的生长有一定的刺激效应。当浓度
达到 100 mg/L时 , 72 h抑制率接近 50%, 120 h抑制率接
近 80%, 生长基本停滞(图 2c)。
图 2b为不同浓度(0.1、 1、 10、 30、 50 mg/L)7 nmnNiO
颗粒对小球藻生长的影响。与 20 nmnNiO处理组相似 , 在
48 h之前各处理组对小球藻的生长状况的影响没有明显
区别 , 72 h后出现显著变化。 0.1 mg/L、1 mg/L两个低浓
度组与空白对照组生长趋势相近 , 抑制效应不明显;而随
浓度增大 , NiO纳米颗粒对小球藻的抑制作用明显增强。
利用 spss软件拟合出两种粒径 nNiO对小球藻 72h抑
制率曲线(图 2c),计算 72 hEC50及 NOEC, 结果如表 1所
示。两种粒径下的生长抑制实验均表明 , nNiO胁迫下 , 小
球藻出现了生长抑制 ,并表现出较好的浓度-效应关系。相
同浓度下(1mg/L, 30mg/L), 7nmnNiO的毒性高于 20nm
nNiO。
2.3　nNiO对小球藻表面结构的影响
如图 3所示 , 对照组细胞饱满 、完整 , 细胞表面光滑
(图 3, A, C)。处理组细胞表面皱缩 、粗糙;部分细胞破
裂 、塌陷 ,结构不完整(图 3, B, D, E, F);细胞间粘连 、附着
严重。随机选取对照组正常细胞及处理组受胁迫细胞各
30个进行细胞直径的测量 , 得出正常细胞平均直径为
(2.78±0.34)μm;受胁迫发生形态改变细胞的平均直径
458
第 4期 巩　宁 , 等:两种粒径氧化镍纳米颗粒对小球藻(Chlorellavulgaris)的生物毒性
图 2　nNiO对小球藻生长的影响
a:7nmnNiO作用下小球藻的生长曲线;b:20nmnNiO作用下小球藻的生长曲线;C:72h两种粒径 nNiO对小球藻生长的抑制率曲线。
Fig.2BiomassofC.vulgariswithtwosizesnNiOexposure
表 1　两种粒径 nNiO对小球藻的毒性
Tab.1 BiotoxicityoftwosizesnNiOonC.vulgaris
nNiO
平均粒径
72hEC50 /
mgNiO· L-1
95%
置信区间
NOEC/
mgNiO· L-1
20nm 74.64 72.05, 77.40 <1.00
7nm 18.01 17.52, 18.50 <0.10
为(1.14±0.27)μm,小于正常细胞 , 二者差异显著(P<
0.01)。因此我们得出 , 在 nNiO胁迫下 ,小球藻细胞的表
面结构发生了改变 , 受胁迫细胞的体积小于正常细胞。
类似现象 Dashi等 [ 9]在研究 Cu2+和 Ni2+对 Chlorelasp.
的影响时也有发现。对此 , 本文提出 2种假设:(1)藻类
细胞的正常生理代谢受到 NiO纳米颗粒的影响 , 阻碍了
细胞的生长;(2)小体积细胞更易于受到纳米材料的攻
击。小球藻通过细胞分裂进行生殖。刚分裂的细胞体积
较小 , 只有初生细胞壁 , 此时细胞可以生长。当细胞停止
生长以后 , 在初生壁的内侧继续积累形成次生细胞壁 ,次
生壁一旦形成 , 细胞就失去伸展生长的能力。藻类的细
胞壁由纤维素 、多聚糖等组成 , 具有金属的结合位点 ,在
图 3　20 nmnNiO处理下小球藻的扫描电镜观察(A、C:对照组;B、D-E:处理组)
Fig.3SEMmicrographsofC.vulgaris(AandC:generalviewofcontrolcellwithoutNSPstreatment;
B, D-F:generalviewofalgaecelltreatedwith20 nmnNiO;Bars=1 μm)
459
海　洋　环　境　科　学 第 30卷
重金属吸附 、吸收 、抵御环境胁迫中具有重要作用 [ 10] 。缺
少次生细胞壁的小球藻细胞更易于受到纳米材料的攻
击 , 使得细胞结构发生变化。此方面还需要进一步的研
究。
2.4　小球藻与 NiO纳米颗粒的共沉淀
小球藻与 NiO颗粒发生团聚 、共沉淀现象 , 如图 4a所
示。其中 1、2、3孔为不同浓度(10、 30、50 mg/L)的 nNiO
海水悬浊液 , 4、5、6孔为相同浓度 nNiO中加入小球藻后
的状态。 1 ～ 3孔的氧化镍悬浊液中少有肉眼可见的沉
淀;而加入藻液后在很短的时间内即可观察到培养板底
部有黑色沉淀出现。取一小块沉淀于相差显微镜下观察
(图 4b), 可见小球藻细胞周围粘附着大量的 NiO颗粒。
同一位置的荧光照片(图 4c)可以看到被 NiO包围下的藻
细胞(红色荧光)。因此推断 , nNiO的团聚对细胞产生遮
光效应 , 使得被围困细胞的可用光大量减少 , 从而影响其
生长。藻细胞与纳米材料的团聚共沉淀现象也与 SEM中
观察到的细胞附着 、粘连 , 细胞表面粗糙等现象相一致。
对于无修饰 、无包被的纳米材料来说 , 团聚和沉淀是
其固有属性。一般认为 , 与环境的 pH、有机质含量及离子
强度等条件有关 [ 7, 12] 。藻类的胞外分泌物 , 细胞外壁的多
糖 、蛋白等生物大分子增加了体系中的溶解 、颗粒有机
物 , 对纳米颗粒的团聚和沉降起到促进作用。因此 , 微藻
在海洋纳米污染的自净化过程中起到了重要的作用 , 也
为纳米污染的防治提供了生物修复的材料。
图 4　NiO纳米颗粒与小球藻的团聚与共沉淀
a:6孔板中的 nNiO悬液(1-3)和藻液(4-6);b:共沉淀的相差显微镜观察;c:共沉淀的荧光显微观察
Fig.4 Theaggregationandco-depositionofnNiOandalgalcells
3　结　论
我们对两种粒径 nNiO的藻类生物毒性进行了研究 ,
得出如下几点结论:
(1)nNiO可对海洋微藻产生毒性 , 引起生长抑制和
细胞结构的改变 , 表现出了较好的浓度-效应关系。
(2)nNiO毒性的大小与其粒径大小相关 , 小粒径材
料表现出更高的毒性 。这可能是由于小粒径的纳米材料
具有更大比表面积 , 增大了生物利用度 ,从而产生更大毒
性。另外小尺度的颗粒可能更容易穿过生物细胞膜 , 进
入细胞内部 , 对细胞造成损伤。
(3)纳米材料在藻液中发生团聚及共沉淀现象 , 对藻
体有一定程度的遮光效应 , 也是小球藻生长受到抑制的
原因之一。 nNiO对藻类的致毒机理将成为下一步研究的
重点。
参考文献:
[ 1] COLVINVL.Thepotencialenvironmentalimpactofengineered
nanomaterials[J] .NatBiotechnol, 2003, 21:1160-1170.
[ 2] 赵宇亮 ,白春礼.纳米安全性:纳米材料的生物效应《科学发
展报告 2005》[ M] .北京:科学出版社 , 2005.3, 137-142.
[ 3] ARUOJAV, DUBOURGUIERHC, KASEMETSK, etal.Toxicity
ofnanoparticlesofCuO, ZnOandTiO2 tomicroalgaePseud-
okirchnerielasubcapitata[ J] .SciTotalEnviron, 2009, 407(4):
1461-1468.
[ 4] HUND-RINKEK, SIMONM.Ecotoxicefectofphotocatalyticac-
tivenanoparticlesTiO2 onalgaeanddaphnids[ J].EnvironSci
PolutRes, 2006, 13(4):225-232.
[ 5 ] OBERDORSTER E.Manufacturednanomaterials(fulerens,
C60)induceoxidativestressinthebrainofjuvenilelargemouth
bas[J] .EnvironHealthPerspect, 2005, 112:1058-1062.
[ 6] SALIMIA, SHARIFIE, NOORBAKHSHA, etal.Directelectro-
chemistryandelectrocatalyticactivityofcatalaseimmobilizedon-
toelectrodepositednano-scaleislandsofnickeloxide[ J].Bio-
physChem, 2007, 125:540-548.
[ 7] WIESNERMR, LOWRYGV, ALVAREZP, etal.Assessingthe
risksofmanufacturednanomaterials[ J] .EnvironSciTechnol,
2006, 40, (14):4336-4345.
[ 8] 李永仙 ,冯 威 ,巩宁 ,等.NiO纳米颗粒对小球藻细胞胁迫性
的研究 [ J] .海洋环境科学 , 2009, 28(2):151-153.
[ 9] OrganisationForEconomicCooperationandDevelopment.Algal
growthinhibitiontest.OECDguidelinesfortestingofchemicals
201[ R].Paris:OECD, 1984.
[ 10] XUH, WONGYS, FUNGN, etal.Surfacecomplexationmech-
anismandmodelinginCr(II)biosorptionbyamicroalgaliso-
late, Chlorelaminiata[ J].JournalofColoidandInterfaceSci-
ence, 2006, 303:365-371.
[ 11] DOSHIH, RAYA, KOTHARIIL, etal.Spectroscopicand
scanningelectronmicroscopystudiesofbioaccumulationofpol-
lutantsbyalgae[J].CurentMicrobiology, 2006, 53:148-157.
[ 12] KAHRUA, DUBOURGUIERHC, BLINOVAI, etal.Biotests
andbiosensorsforecotoxicologyofmetaloxidenanoparticles:A
minireview[ J] .Sensors, 2008, 8:5153-5170.
460