全 文 ：脱氢酶能使外源性 MT T 还原为水不溶性的蓝紫色
结晶甲瓒(Fo rmazan)并沉积在细胞中 ,而死细胞无
此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲
瓒 ,用酶联免疫检测仪在 550 nm 波长处测定其光
吸收值 ,可间接反映活细胞数量 。在一定细胞数范
围内 ,MT T 结晶形成的量与细胞数成正比 。但由
于 MTT 经还原所产生的甲瓒产物不溶于水 ,需被
溶解后才能检测 ,本研究所用的样品为混合物 ,难免
有不溶性的物质 ,导致个别样品的 OD 值超过 1.0 ,
使测得的抑制率或保护率超过 100%,引起了一定
的误差。
关于新疆紫草的水溶性成分的研究 ,日本学者
报道中国内蒙古生长的新疆紫草干燥根的热水提取
物有很强的抗 HIV-l活性 ,其 70%含水丙酮提取物
具有对抗急性感染的 H9细胞中的 HIV 复制的作
用 ,其有效成分为咖啡酸四聚体的钠 、钾盐 ,提出了
用新疆紫草的化学成分之一咖啡酸四聚体的钠 、钾
盐治疗 HIV 的可能性 ,但除了咖啡酸四聚体的钠 、
钾盐以外的其他成分没有报道 。在 M T-4细胞系观
察了常用 204种天然药物的体外抗 HIV-1活性[ 6] ,
包括紫草在内的 45个植物药在 M T-4细胞上抑制
了 HIV-1诱导的细胞致病性 。课题组初步提取了
产自新疆的软紫草的水溶性组分 ,并在 MT-2 细胞
系 ,采用 MT T 染色法 ,观察了这些提组分对 HIV
感染细胞的保护作用和对细胞的毒性作用。实验结
果表明 ,样品 Ⅰ和 Ⅱ在 2.5 ～ 320.0 μg/ml浓度范围
内 , Ⅲ在 2.8 ～ 360.0 μg/ml浓度范围内 , Ⅳ在 3.1
～ 400.0μg/ml范围内均对 HIV-1感染细胞有一定
的保护作用 ,活性大小顺序为Ⅲ>Ⅰ >Ⅳ>Ⅱ ,表明
其对 HIV-1的复制有一定的抑制作用。同时以上
样品对 MT-2细胞也有一定的毒性 ,其毒性大小顺
序为Ⅰ <Ⅳ<Ⅲ<Ⅱ。
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[ 收稿日期:2008-12-20]
新疆紫草提取物抗 HIV-1体外活性研究(Ⅱ)＊
买尔旦·马合木提1 ,2＊＊ , 古丽仙·胡加1＊＊＊ , 秦冬梅2
(新疆医科大学1附属肿瘤医院 , 2药学院 , 新疆　乌鲁木齐　830011)
摘要:目的:研究新疆紫草水溶性组分Ⅰ 、Ⅱ 、 Ⅲ 、 Ⅳ对 H IV-1 3 个关键酶的体外活性。方法:分别选用
HIV-1 整合酶(HIV-1 ing ra se , HIV-1 IN), HIV-1 蛋白酶(HIV-1 pro tease , HIV-1 PR), HIV-1 逆转录酶(HIV-1
rever se transcriptase , H IV-1 RT)体外药效筛选模型 , 观察组分Ⅰ 、Ⅱ 、 Ⅲ和Ⅳ对以上酶的抑制作用。结果:新疆
紫草水溶性组分Ⅰ 、Ⅱ 、 Ⅲ和Ⅳ对 H IV-1 IN 具有一定的抑制活性 , 50%有效浓度(EC50)分别为 2.21 、 14.71 、5.71
和 66.08 μg/ ml。组分Ⅰ对 HIV-1 RT 的抑制活性小 , EC50为5.63μg/ ml。结论:新疆紫草水溶性提取物对 HIV-1
IN 具有抑制活性 ,对 HIV-1 PR均无抑制活性。
关键词:新疆紫草;逆转录酶;整合酶;蛋白酶
中图分类号:R93;R978.7;R34　　文献标识码:A　　文章编号:1009-5551(2009)04-0377-03
377新疆医科大学学报　JOURNAL OF XINJIANG MEDICAL UNIVERSITY　2009 Apr., 32(4)
＊
＊＊
＊＊＊
基金项目:新疆维吾尔自治区地方病分子生物学重点实验室开放课题(编号:XJDX0208-2006-01);新疆维吾尔自治区高校科研计划科
学研究重点项目(编号:XJEDU2004I25)
作者简介:买尔旦·马合木提(1960-),男(维吾尔族),主任药师 ,研究方向:中药民族药开发。
通讯作者:古丽仙·胡加(1962-),女(维吾尔族),副主任中药师 ,研究方向:中药学基础 , E-mail:gulixian 0919@hotm ail.com。
Activity of extracts from Arnebia Euchroma (Royle)Johnst.
to HIV-1 key enzymes in vitro.
Maierdan·Mahemuti , Gulixian·Hujia , QIN Dong-mei
(Aff i liated Tumor Hospi tal , X inj iang Medical Universi ty ,Urumqi 830011 ,China)
Abstract:Objective:To study the activi ty o f Arnebia euchroma (Roy le)Johnst .water soluble ex tracts(Ⅰ ,
Ⅱ , Ⅲ and Ⅳ)to H IV-1 three key enzymes in vit ro.Methods:The pharmacodynamical select ing model of
H IV-1 ing rase(HIV-1 IN), HIV-1 protease (HIV-1 PR)and HIV-1 reverse t ranscriptase (HIV-1 RT)
were used to detect the activity of ex t racts on the above enzymes.Results:All o f the ext racts , the re w ere
inhibitory effects to H IV-1 IN , the value of EC50 was 2.21 , 14.71 , 5.71 and 66.08 μg/ml , respectively.
All the ex t racts , there w ere no inhibitory ef fects to H IV-1 PR;And ex tract Ⅰ , there w as slight ly inhibito-
ry ef fects to H IV-1 RT , the value of EC50 was 5.63μg/ml.Conclusion:Water soluble ex tracts of Arnebia
euchroma(Royle)Johnst .showed inhibi to ry ef fect to HIV-1 IN in vit ro.
Key words:Arnebia euchroma (Roy le)Johnst;HIV-1 reverse t ranscriptase;HIV-1 ingrase;HIV-1 pro tease
　　HIV 是单链 RNA病毒 ,分为 HIV-1和 HIV-2
两种 ,目前在世界范围内流行的以 HIV-1为主 ,约
占95%左右。在 HIV-1病毒感染中 ,有3种酶起着
关键的作用 ,即:HIV-1 逆转录酶(HIV-1 reverse
t ranscriptase , RT),HIV-1整合酶(HIV-1 ingrase ,
IN)和 HIV-1蛋白酶(HIV-1 protease , PR)。HIV
复制过程依赖 RT , RT 将病毒 RNA 逆转录为 DNA
前病毒 , RT 抑制剂能有效地抑制病毒的复制 。PR
可催化 HIV 前体蛋白加工成熟 ,而 PR抑制剂可阻
止前体蛋白的裂解 ,导致无感染病毒颗粒的堆积 ,达
到抗病毒的效果。 IN 具有内切酶的活性 ,缺乏 IN
基因的 HIV 所装配出的病毒颗粒缺乏感染能力 。
近十年来抗 A IDS/HIV 药物的研制以及临床应用
主要是针对抑制上述 3个关键酶进行的[ 1-2] 。为了
阐明新疆紫草水溶性提取物(Ⅰ 、Ⅱ、 Ⅲ和Ⅳ)对 3
种酶的抑制活性和抗 HIV 可能的作用靶点 ,本文分
别用 Ⅰ 、Ⅱ、 Ⅲ、Ⅳ对 RT 、IN 和 PR进行了体外干
预研究 ,以筛选其初步的活性 。
1　材料与方法
1.1　实验材料　紫草提取物由新疆医科大学药学
院生药/天然药物化学教研室制备。 HIV-1 RT 、
HIV-1 IN 和 HIV-1 PR由中国医学科学院医药生
物技术研究所病毒药物实验室提取并保存。抗
HIV-1 RT 阳性对照药奈韦拉平(Nevirapine ,
NVP)由南京泽众医化信息研究中心提供。抗
HIV-1 IN 阳性对照物 S-y(非药品)由上海有机所
提供 ,供体底物和靶底物由上海生工生物工程技术
服务有限公司生产 。抗 HIV-1 PR阳性对照药印地
那韦(indinavir ,葛兰素公司),底物(Invi t rogen 公
司),Bio tin-dUP 和基因工程靶酶 ,亲合素标记的辣
根过氧化物酶等由中国医学科学院医药生物技术研
究所病毒药物实验室提供。
1.2　实验方法
1.2.1　体外抗 HIV-1 RT 抑制活性　样品临用前
溶于 DMSO 配成适当浓度 ,并用双蒸水作 5倍稀释
度 。阳性对照药为奈韦拉平 。样品稀释后加入供体
底物包被 96 孔板中 ,并加入含有基因工程靶酶和
biotin-靶底物的反应 Buf fer 中 ,在最佳反应条件下
孵育 ,以生物素标记的碱性磷酸酶系统显色 ,测定
405 nm 处 OD值 ,计算抑制率(%)。抑制率(%)=
[ 1-(实验孔 OD值-空白孔 OD 值)/(对照孔 OD
值-空白孔 OD 值)] ×100。具体操作按试剂盒说
明进行 。
1.2.2　体外抗 HIV-1 IN 抑制活性　样品临用前
溶于 DMSO 配成适当浓度 ,并用双蒸水作 5倍稀释
度 。阳性对照药为 S-y 。样品稀释后加入供体底物
包被96孔板中 ,加入纯化的 HIV-1整合酶 , 在最佳
反应条件下进行 ELISA 反应 ,以生物素标记的碱性
磷酸酶系统显色 , 酶标仪测定 OD值 ,计算抑制率。
具体操作按试剂盒说明进行 。
1.2.3　体外抗 HIV-1 PR的抑制活性　将稀释后
的样品加入含有荧光标记底物的缓冲液中 ,并加入
378 新疆医科大学学报　JOURNAL OF XINJIANG MEDICAL UNIVERSITY　2009 Apr., 32(4)
基因工程靶酶 ,在最佳反应条件下孵育 ,以印地那韦
为阳性对照药 ,用 FLUO sta r Galaxy 荧光仪测定荧
光值并计算抑制率。
2　结果
提取物Ⅰ 、Ⅱ、 Ⅲ、Ⅳ对 HIV-1 IN 均有抑制活
性 ,抑制活性强弱顺序为Ⅰ> Ⅲ>Ⅱ>Ⅳ,同时Ⅰ对
HIV-1 RT 也有一定的抑制活性 ,而其它提取物对
HIV-1 RT 没有抑制活性(表 1)。提取物Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ对
HIV-1 PR均无抑制活性 , Ⅳ有较弱的活性(表 2)。
表 1　各组分体外抗 HIV-1 RT和 HIV-1 IN活性结果(μg/ml)
提取物 H IV-1 IN初始浓度 EC50
HIV-1 RT
初始浓度 EC50
Ⅰ 100 2.21 200 5.63
Ⅱ 100 14.71 200 -
Ⅲ 100 5.71 200 -
Ⅳ 100 66.08 200 -
阳性对照 12 0.83 10 0.32
　　注:表中“ -”表示样品在初始浓度无抑制活性
表 2　样品体外抗 HIV-1 PR活性结果(μg/ml)
提取物 初始浓度
50 10 2 0.4 0.08 EC50
Ⅰ 27.40 22.82 19.01 17.34 27.10 -
Ⅱ 22.89 26.56 13.15 15.70 31.09 -
Ⅲ 35.20 21.40 16.80 2.30 16.50 -
Ⅳ 65.94 30.03 18.25 22.73 30.44 34.08
　　注:表中“ -”表示样品在初始浓度无抑制 HIV-1 PR 的活性;样
品浓度大于 50μg/ml 时,自身有荧光 ,干扰检测系统 ,测得结果不准
确。印地那韦(浓度 10 nM),荧光强度为 85.3。
3　讨论
抗 HIV 药物的体外药效研究包括作用机制 、体
外抗病毒活性及其影响因素 、耐药性研究和联合用
药研究等内容[ 3] ,RT 、IN 和 PR常作为特定靶位的
抗 HIV 药物药效学研究的靶点 。 RT 是现有抗
HIV 药物的最主要的作用位点 ,采用重组 RT ,以寡
核苷酸 Poly(rA).olig o(dT)或 Po ly(rC).o ligo
(dG)为底物 ,在不同浓度待测药物存在时 ,检测同
位素或非同位素标记的核苷酸的掺入率 ,从而确定
药物对 RT 活性的抑制程度 。以不加药物的反应为
对照 ,计算出使酶活性抑制达 50%或 90%时药物浓
度 ,即 EC50或 EC90 ,同时检测该药物对细胞产生
50%细胞毒性时的浓度 ,即 TC50最后计算出该药物
的治疗指数(TI=TC50/EC50),以判断其抗 HIV 活
性的前景 。 HIV-1 RNA 基因在逆转录成双链
DNA 后 ,在 IN的作用下 ,双链 DNA 整合至宿主细
胞染色体。由于人体内没有这种酶的对应物 ,这使
IN 成为重要的抗 HIV 药物作用靶点 。整合过程相
当复杂 ,通常使用基于寡核苷酸的方法评价 ,体外测
定 IN 活性时 ,采用32 P 标记的互补寡核苷酸链 ,在
不同浓度待测药物存在时 ,以电泳和放射自显影技
术检测 IN 的活性 。PR 在病毒颗粒成熟过程中起
着重要的作用 ,在 Gag 和 Gag-pol前提蛋白水解成
病毒结构蛋白和病毒颗粒各种酶的过程中是必需
的 。PR活性的体外测定以多肽 NH 2-V al-Pro-Try-
Asn-G ln-Se r-Ala-A rg-COOH 或 NH 2-Val-Val-Pro-
Try-Asn-Gln-Ser-COOH 为底物 ,在不同浓度待测
药物存在时 ,分析多肽产物 ,计算方法同 RT 的体外
检测。本体外试验结果初步显示 ,样品 Ⅰ 、Ⅱ 、 Ⅲ、
Ⅳ对 HIV-1 IN均有一定的抑制活性 ,提示它们对
HIV-1 IN 可能具有相同的作用靶位 ,对 HIV-1 RT
和 PR无活性或活性小 ,也说明了这一点。具体作
用靶点及机制有待于进一步研究 。另外 ,样品 Ⅰ对
HIV-1 RT 可能有特定的作用靶点 。以上结果提
示 ,紫草水溶性提取物可能通过削弱整合酶的内切
活性 ,使 HIV 所装配出的病毒颗粒缺乏感染能力而
发挥作用。鉴于试验用样品均为紫草的粗提物 ,对
结果可能产生不同程度的影响。本文报告的初步结
果 ,为进一步深入研究提供了思路 ,结合以往的工作
结果 ,新疆紫草有效部位已显示出较强的生物活性 ,
对创新药物的发现具有较大的意义和应用前景 。
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[ 收稿日期:2008-12-20]
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