全 文 ：北方园艺 2010(8):125 ～ 128 ·生物技术 ·
第一作者简介:袁永娴(1982-),女 ,在读硕士, 研究方向为生物有
机化学。E-mail:tiantian-yuan@126.com。
通讯作者:王晓军(1962-),男 ,研究员,研究方向为植物资源利用。
E-mail:wangxj@ms.xjb.ac.cn。
基金项目:中国科学院西部行动高新技术资助项目(KGCX2=
YW-509)。
收稿日期:2009-12-11
新疆雪莲胚性愈伤组织的诱导及原生质体分离
袁永 娴1 ,2 , 王 晓军1 , 郝秀 英3 , 赵民 安1 , 朱 金刚1 ,2 , 祁鑫 星1, 2
(1.中国科学院新疆理化技术研究所 ,乌鲁木齐新疆 830011;2.中国科学院研究生院,北京 100039;
3.新疆农业科学院 微生物应用研究所,乌鲁木齐 新疆 830091)
　　摘　要:以新疆雪莲无菌叶片为材料 ,诱导其产生胚性愈伤组织 ,再以胚性愈伤组织为分离
原生质体的起始材料 ,研究质壁分离时间、渗透压浓度 、酶液组合 、酶解时间等因素对其原生质体
分离效果的影响。结果表明:对诱导胚性愈伤组织有较好效果的培养基组合为:MS+2 ,4-D 0.1
mg/ L+BA 0.5 mg/L+NAA 1.5 mg/ L+葡萄糖 30 g/L;原生质体分离最佳体系为:含纤维素酶
2.5%、离析酶0.2%、果胶酶1%、MES 0.1%和甘露醇 10%的酶解液 ,在温度(26±1)℃,pH 5.8
条件下酶解 14 ～ 16 h ,游离原生质体的产量和活性均较高。
关键词:新疆雪莲;胚性愈伤组织;原生质体;分离
中图分类号:S 567.23+9(245)　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2010)08-0125-04
　　新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)为菊
科(Compositae)菜蓟族(Trib .Cynareae Less)凤毛菊属
(saussurea DC)的多年生草本药用植物[ 1-2] ,又名天山雪
莲。在我国主要分布在西北部的高寒山地。它是中药 、
民族药中的珍稀药材 ,含黄酮 、生物碱 、多糖等多种有效
成分 ,具有活血通经 、散寒除湿 、强筋壮阳等功效 ,多用
于风湿性关节炎 、经血不调 、阳痿 、跌打损伤的治疗[ 3-5] 。
新疆雪莲一般生长在极端环境下 ,种子自然发芽率低 ,
生长周期长 ,人工栽培困难。近几年在利益的驱使下 ,
大规模掠夺式的采挖使得野生雪莲数量急剧下降 ,导致
野生资源日益匮乏 ,目前新疆雪莲已被列为国家三级保
护植物。新疆雪莲组织培养再生植株的快繁体系建
立[ 6-7] ,为原生质体分离 、培养及融合提供基础。原生质
体是研究细胞生理现象的理想材料 ,也是遗传转化的理
想受体[ 8] ,能够获得数量大、活力强的分离原生质体是
对新疆雪莲种质资源进行创新的前提[ 9] 。现国内关于
新疆雪莲原生质体的分离和培养尚未见报道。
该研究以新疆雪莲无菌叶片为试材 ,诱导其产生胚
性愈伤组织 ,进而以胚性愈伤组织为起始材料进行原生
质体分离和纯化 ,研究预处理时间 、酶液组合、酶解时
间 、渗透压 、酶解温度等不同因素对原生质体产量和活
力的影响 ,建立最佳的原生质体分离和纯化体系 ,以便
为后续的原生质体培养 、遗传转化和体细胞杂交奠定良
好的基础[ 10] 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
种子:新疆雪莲的成熟种子取自新疆和静县;纤维
素酶 R-10、果胶酶 R-10 、离析酶 R-10为宝生物公司生
产;甘露醇为上海沪试公司生产;2-(N-吗啡啉)乙磺酸
(MES)为北京欣经科公司[ 11] 。
1.2　试验方法
1.2.1　无菌苗的培养　筛选出颗粒饱满的新疆雪莲种
子 ,用自来水冲洗 2 h进行表面清洗 ,然后在超净工作台
上用 75%的酒精浸泡50 s ,0.1%的升汞灭菌4 min ,15%
的过氧化氢灭菌 20 min ,无菌水冲洗 3 ～ 4次 ,再浸泡
5 min ,用消毒滤纸吸干表面水分 ,接种于无激素的 MS
基本培养基上 ,培养条件为:温度(23±1)℃,光照强度
2 500～ 3 000 lx ,光照时间 16 h/d ,20 d后萌发。
1.2.2　胚性愈伤组织的诱导　以萌发的无菌苗的子叶
和真叶为外植体 ,切成1 ～ 2 cm 的片段 ,接种于设计好的
培养基(见表1)中诱导愈伤组织 ,基本培养基均为 MS ,
培养期 25 d ,每个处理接种 30个外植体 ,20 d后统计愈
伤组织颜色 、质地及出愈率。挑选黄绿色 、颗粒状 、质地
松散生长旺盛的愈伤组织接种至MS+NAA 1.5 mg/L+
6-BA 0.5 mg/ L+2 ,4-D 0.1 mg/L 培养基中继代培养。
1.2.3　原生质体分离和纯化　选取约 1 g生长均一 、颜
色黄绿 、质地松散 、分散性高的胚性愈伤组织(见图 1),
切碎放入20 mL CPW-13M(含13%甘露醇)[ 12] 溶液的三
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·生物技术· 北方园艺 2010(8):125～ 128
角瓶中 , 置于 26℃摇床上 , 100 rpm , 避光质壁分离
1～ 2 h。然后换入 10 mL 酶解液(参见表 2)并附加
5 mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES),温度(26±2)℃,
50rpm ,避光酶解10 ～ 14 h ,待酶完全溶解后 ,调节pH 5.8 ,然
后通过直径 0.22 mm 的微孔滤膜过滤灭菌。在黑暗 ,温
度(26±1)℃,100 rpm ,条件下酶解 10 、12 、14 、16 、18 h
后 ,将原生质体悬浮液经500目镍丝网过滤到小烧杯中 ,
除去未完全酶解的细胞团或组织。将滤液1 000 rpm离
心10 min ,取下层沉淀用 CPW-9M(含9%甘露醇)溶液
洗涤 2次 ,将留下的原生质体悬浮于2 mL CPW-9M 溶
液中 ,将其缓缓加入6 mL CPW-21S(含21%蔗糖)中 ,再
以500 rpm离心5 min。这时 ,在2个液面中间出现一条
绿色原生质体带 ,用吸管小心地吸出再用原生质体培养
液清洗 1次 ,即可获得纯化的新疆雪莲原生质体(图2)。
　　表 1 新疆雪莲胚性愈伤组织诱导
培养基的激素浓度组合
培养基编号 激素组合/mg·L-1
6-BA 2 , 4-D NAA
碳源
葡萄糖/g·L-1蔗糖/g·L-1
H1
H2
H3
H4
Y1
Y2
Y3
Y4
Z1
Z2
Z3
Z4
0.1
0.5
1.0
1.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.1
0.1
0.1
0.1
-
-
-
-
0.2
0.4
0.5
0.5
-
-
-
-
0.5
1.0
1.5
2.0
-
-
-
-
30
30
-
-
30
30
-
-
30
30
-
-
-
-
30
30
-
-
30
30
-
-
30
30
　　表 2 酶液组成及含量
酶液 纤维素酶/ % 离析酶/ % 果胶酶/ %
ER1
ER2
ER3
ER4
ER5
1
1.5
2
2.5
3
0.1
0.1
0.2
0.2
0.5
2
2
1.5
1
1
图 1　新疆雪莲胚性愈伤组织
1.2.4　原生质体产量和活性的测定　血球计数板的每
个最小的方格与植物原生质体的大小差不多 ,会有很多
原生质体被挤出视野 ,计数不准确 ,因此 ,采用侯岁稳等
(1999)的方法进行原生质体简单计数。用移液枪吸取分
离纯化后的原生质体悬浮液 8 μL ,滴在载玻片上 ,加盖
18 mm×18mm的盖玻片 ,在40×物镜下(视野面积3.14×
0.252=0.2 mm2)观察到 6个不同视野原生质体的平均
值是 20个时 ,则其密度为[(1 000/8)×(18 ×18 /0.20)
] ×20=4.05 ×106个/mL。每个处理随机观察 10个视
野 ,取平均值 ,每个处理重复 3次。原生质体活性检测
采用 0.1%酚藏花红染色法 ,每个样品重复观测 3次 ,按
原生质体活性=(未被染上红色的原生质体数/观察的
原生质体总数)×100%,计算原生质体活性 ,最后取平均
值。
图 2　原生质体分离图片
2　结果与分析
2.1　激素组合对胚性愈伤组织诱导的影响
全部接种在10 ～ 12 d后 ,外植体两端均出现膨大、
开裂 ,愈伤组织开始形成 ,3周左右 ,有大量的愈伤组织
产生。不同激素组合对外植体愈伤组织的形成影响不
尽相同。从表3可知 ,2 ,4-D在 0.1 ～ 1.0 mg/ L范围内
均可诱导愈伤 ,且随着 2 ,4-D浓度增大 ,愈伤诱导率也
增大 ,但当2 ,4-D浓度大于0.5 mg/L 时 ,外植体褐化程
度随之增加 ,不利于愈伤组织继代;在相同 2 ,4-D浓度
条件下 ,随着 6-BA浓度0.1 ～ 1.5 mg/ L的增加 ,愈伤诱
导率呈先增后减的趋势 ,过高浓度的6-BA会抑制2 ,4-D
的作用 ,这与文献报道一致[ 13] ;在相同 6-BA 浓度条件
下 ,随着NAA浓度的增大 ,愈伤组织发生速度增快 ,单
个外植体上出芽数降低 ,当 NAA浓度 1.5 mg/ L时 ,愈
伤组织形成的时间短 ,愈伤生长迅速 ,抑制了不定芽的
产生 ,同时加入葡萄糖的培养基可以有效的防止褐化现
象。综合考虑 ,选择MS+2 ,4-D 0.1 mg/ L+BA 0.5 mg/ L+
NAA 1.5 mg/L ,以葡萄糖为碳源的培养基作为诱导胚
性愈伤组织的最佳培养基。
2.2　质壁分离时间对原生质体分离效果的影响
质壁分离时间对原生质体的分离有较大的影响 ,不
同处理时间对原生质体的产量影响不同。试验比较了4
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北方园艺 2010(8):125 ～ 128 ·生物技术 ·
种质壁分离时间对新疆雪莲原生质体分离产量和细胞
碎片多少的影响。
　　表 3　不同激素组合对胚性愈伤组织诱导影响(22 d)
培养基编号 出愈率/ % 愈伤组织生长情况增殖量 颜色 质地
H1
H2
H3
H4
92.6
98.2
93
85
++++
++++
++++
+++
淡绿色
黄绿色
黄绿色
绿色
松散、粘稠状
紧实、颗粒状
紧实、块状
坚硬 、部分褐化
Y1
Y2
Y3
Y4
65
68.3
85
75.6
+
+
++
+++
淡绿色
淡绿色
黄绿色
黄绿色
有很多出芽点
坚硬 、有出芽点
紧实、颗粒状
紧实、块状
Z1
Z2
Z3
Z4
93.5
90.3
87.3
80.2
++++
+++
+++
+++
黄绿色
淡绿色
淡绿色
灰绿色
紧实、颗粒状
松散、粘稠状
松散、粘稠状
表面发白 、水渍状
　　注:出愈率=直径大于0.15 cm的愈伤组织块数/接种块数×100%。
　　表 4　　质壁分离时间对原生质体分离的影响
质壁分离时间/h 原生质体产量/个·g-1 细胞碎片
CK
1
2
3
4
1.32
1.46
1.67
1.83
1.53
+
+
+
++
++++
　　注:+指很少;++指较多;+++指很多;++++指极多。
由表 4可知 ,4个不同的预处理得到的原生质体产
率均比对照多 ,随着质壁分离时间的延长 ,原生质体产
量逐渐增加 ,但是细胞碎片也逐渐增加 ,也就是原生质
体活力在下降 ,质壁分离 3 h时原生质体产量最高达
1.83×106个/g ,继续延长时间 ,原生质体产量下降同时
细胞碎片也增多 ,因此从原生质体产量 、细胞碎片的多
少两方面因素综合考虑[ 14] ,新疆雪莲胚性愈伤组织适宜
的质壁分离时间为2 ～ 3 h。
2.3　渗透压浓度对原生质体分离效果的影响
以甘露醇为渗透压调节剂 ,比较了浓度范围 9%～
13%不同渗透压的酶液[ 15] 对胚性愈伤组织原生质体的
解离效果。由表 5可以看出 ,在甘露醇浓度为 9%～
13%范围内 ,随着酶液渗透压的增大 ,原生质体的产量
呈逐渐上升趋势 ,这是由于当溶液渗透压低于原生质体
内部渗透压时 ,部分原生质体因过分吸胀而破裂 ,随着
溶液渗透压的提高 ,原生质体内外渗透压逐渐趋于平
衡 ,因吸胀而破裂的原生质体比例逐渐减小 ,产量则稳
步提高。可见在甘露醇浓度为 10%时原生质体活力最
高 ,在此浓度获得的原生质体质量最好 ,过高或过低的
渗透压对原生质体均有损伤 ,不利于后期的培养 。因
此 ,采用 10%的甘露醇(CPW-10M)作为渗透压稳定剂。
2.4　酶液组成和浓度对原生质体产量和活力的影响
酶液的组成和浓度是影响原生质体分离的最大因
素之一 ,不同组合对原生质体产量和活力的影响明显不
同。由表 6可知 ,随着酶浓度的不断增加 ,胚性愈伤组
织原生质体的产量逐渐提高;从原生质体的活力来看 ,
较低浓度的酶液组成有利于原生质体存活。酶浓度达
到一定阈值后 ,随着酶浓度增加 ,原生质体存活率下降 ,
而且细胞碎片显著增多。因此从原生质体的产量 、活
力 、细胞碎片的多少及酶的使用量等多方面综合考虑 ,
原生质体分离的最佳酶液组合为 ER4 即:纤维素酶
2.5%、离析酶0.2%、果胶酶1%。
　　表 5 不同渗透压浓度对原生质体
分离效果的影响
甘露醇浓度
/ %
原生质体产量
/个·g-1
原生质体活力
/ % 原生质体形态
9
10
11
12
13
1.36
1.75
1.77
1.79
1.83
73.4
82.3
79.1
75.6
70.2
涨大
膨胀
膨胀
膨胀
收缩
　　表 6 酶液组成和浓度对原生质
体分离效果的影响
酶液 原生质体产量/个· g-1 原生质体活力/ % 细胞碎片
ER1
ER2
ER3
ER4
ER5
1.42
1.53
1.62
1.83
1.87
71.6
72.1
71.3
79.2
74.2
+
+
++
++
+++
2.5　酶解时间对原生质体分离效果的影响
由表 7可知 ,随着酶解时间的增加 ,原生质体产量
不断提高 ,酶解 16 h时 ,原生质体产量最高 ,这时胚性愈
伤组织已趋于完全解离 ,酶液呈绿色稠状。酶解时间继
续增加至 18 h ,原生质体产量反而下降 ,究其原因 ,可能
是由于长时间的酶解使一部分已解离的原生质体受损
而破裂。从原生质体活力看 ,酶解时间由 10 h增加到
16 h ,原生质体活力逐渐降低 ,酶解 14 h和 16 h原生质
体活力没有显著差异 ,酶解 18 h细胞碎片明显增多 ,原
生质体活力也显著下降。所以为了获得大量的具有活力
的原生质体 ,酶解时间以 14 ～ 16 h为宜。
　　表 7　　酶解时间对原生质体分离的影响
酶解时间/h 原生质体产量/个· g-1 原生质体活力/ % 细胞碎片
10
12
14
16
18
1.32
1.38
1.65
1.89
1.73
80.3
79.2
76.5
75.8
70.3
+
+
++
++
++++
3　结论与讨论
原生质体研究成功始于 1971年 Takebe 等首次报
导烟草叶肉原生质体培养得到再生植株[ 16] ,由于同一植
株获得的原生质体在遗传上是同质的 ,可为细胞生物
学 、发育生物学 、细胞生理学、细胞遗传学及其它一些生
物学科提供良好的试验体系。原生质体能够克服性细
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·生物技术· 北方园艺 2010(8):125～ 128
胞的不亲和障碍 ,进行远缘的体细胞杂交;原生质体可
以直接摄取外源的DNA 、细胞器 、病毒 、质粒等 ,是进行
遗传转化研究的理想受体 ,因此植物原生质体在改变植
物遗传性 、改良作物品种的应用研究以及生物学的基础
理论研究中有着广泛的用途[ 17] 。该试验仅选用了新疆
雪莲无菌苗幼嫩叶片诱导产生的胚性愈伤组织为外植
体分离原生质体 ,旨在于为新疆雪莲的原生质体培养和
体细胞杂交研究做铺垫。
该试验只进行了新疆雪莲幼嫩叶片诱导胚性愈伤
组织及其原生质体分离 ,其它材料 ,例如 ,新疆雪莲组培
苗的嫩茎 、根等均可以进行愈伤组织的诱导 ,利用这些
材料进行原生质体的分离是否有更好的效果还有待于
进一步研究。另外降解高等植物细胞壁一般由纤维素
酶、果胶酶 、离析酶和半纤维素酶中的 1种或者多种配
合使用。纤维素酶具有较强的纤维素酶活性及一定的
果胶酶的活性 ,一般情况下它与一定量的果胶酶配合使
用效果更佳 ,离析酶能减少细胞碎片的产生 ,试验表明 ,
新疆雪莲胚性愈伤组织在含有纤维素酶 2.5%、离析酶
0.2%、果胶酶1%的酶解液中进行酶解 14 ～ 16 h 后 ,游
离原生质体的产率和活性均较高 ,且酶解液中渗透压稳
定剂———甘露醇的浓度10%(CPW-10M)为宜。
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(该文作者还有牛力涛 ,单位同第一作者。)
Studies on Embryogenic Callus Induction and Protoplast Isolation of
Saussurea involucrate Kar et Kir.
YUAN Yong-xian1 ,2 ,WANG Xiao-jun1 ,HAO Xiu-ying3 , ZHAO Min-an1 , ZHU Jin-gang1 ,2 , QI Xin-xing1 ,2 , LIU Li- tao1 ,2
(1.Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry , Chinese Academy of Sciences ,Wulumuqi Xinjiang 830011;2.Graduate School of Chi-
nese Academy of Sciences , Beijing 100039;3.Institute of Microbiolog y , Xinjiang Academy of Ag ricultural Science ,Wulumuqi , Xinjiang 830091)
Abstract:The leaves of Saussurea involucrate were used as experiment materials and were induced embryogenic callus ,
then using them to isolate protoplast.The influential factors of plasmolysis time , concentration of osmotic solution , en-
zyme combinations and digestion time on protoplast isolation from embryogenic callus were studied.It is suitable to indi-
cate embryogenic calluses w hen the murashige and skoog medium which was MS+2 ,4-D 0.1 mg/L+BA 0.5 mg/L+
NAA 1.5 mg/L+glucose 30 g/ L.When the embryogenic calluses were used to isolation , the optimal condition was en-
zyme solution of 2.5%Cellulase Onzuka R-10 ,0.2%Mecerozyme R-10 ,1.0%Pectinase ,0.1%MES and 10%Mannitol
for digesting 14～ 16 h at pH 5.8 and the temperature of(26±1)℃.
Keywords:Saussurea involucrata Kar et Kir.;embryogenic callus;protoplast;isolation
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