全 文 ： 收稿日期:2010-05-26
作者简介:冯文文(1983-),女 , 硕士生 ,专业方向为天然药物活性成分的研究。
通讯作者:王金辉(1972-),男 , 教授 ,从事天然药物化学研究;e-mail:w jh.1972@yahoo.com.cn。
第 29卷 第 1期
2011年 2月
石河子大学学报(自然科学版)
Journal of Shihezi University(Natural Science)
Vo l.29 No.1
Feb.2011
文章编号:1007-7383(2011)01-0067-04
新疆紫草中萘醌类成分的提取工艺研究
冯文文1 ,李国玉1 ,谭勇1 ,王航宇1 ,王金辉1 , 2
(1 石河子大学药学院/教育部省部共建新疆特种植物药资源重点实验室 , 石河子 832002;
2 沈阳药科大学中药学院 ,沈阳 110016)
摘要:为了确定新疆紫草中萘醌类成分的最佳提取工艺 ,本研究以新疆紫草中主要萘醌类成分的含量为指标 , 利用
反相高效液相色谱(RP- HPLC)法测定其含量 ,采用 L9(34)正交实验进行提取工艺全面优选。结果显示 , 最佳提
取工艺为:新疆紫草粗粉 ,用 12 倍量 95%乙醇冷浸 8 h。采用冷浸法提取新疆紫草中萘醌类成分 ,操作简便 , 方法
可行 , 降低了生产成本 ,提高了药材利用率 , 使实验结果具有实际应用价值。
关键词:新疆紫草;萘醌;正交设计法;高效液相色谱
中图分类号:R28 文献标识码:A
Extraction Process of Naphthaquinones in Radix Arnebiae
FENG Wenwen1 , LI Guoyu1 , TAN Yong1 ,WANG Hangyu1 ,WANG Jin-hui1 , 2
(1 Schoo l o f Pharmacy , Shihezi Univer sity/
Key Labo rato ry o f Phy tomedicine Resour ces &M ode rniza tion of TCM , Shihezi 832002 , China;
2 Schoo l of T raditional Chine se Materica Medica , Shenyang Pharmaceutical Univ ersity , Shenyang 110016 , China)
Abstract:To study the best ex traction method o f naphthaquinones in Radix A rnebiae.The ext raction process w as studied by or-
thogonal design with the contents o f naphthaquinone s de te rmined by RP-HPLC as index.The best me thod of ex traction is cold-
soaking w ith 12 times 95% alcohol for 8 hours.The ex trac tion method fo r Radix A rnebiae can save ene rgy and be suitable fo r
the modern production.
Key words:Radi x Arnebiae;Naphthaquinones;Or thogonal design;H PLC
紫草(Rad ix Arnebiae , Radix Lithospermi)为
紫草科植物新疆紫草 Arnebia euchroma (Royle)
Johnst 、紫草 Lithospermum ery throrhizon Sieb.et
Zucc.或内蒙紫草 Arnebia guttata Bunge 的干燥
根 ,其味甘 、咸 ,性寒 ,归心 、肝经 ,有凉血 、活血 、解毒
透疹的功效[ 1] 。现代药理实验表明紫草具有抗肿
瘤[ 2-3] 、抗炎[ 4] 、抗氧化[ 5] 、保肝护肝[ 6] 等多种药理活
性 ,萘醌类成分为其主要的活性成分 ,故其含量高低
必定影响药品质量。紫草萘醌类成分极性较小 ,易
溶于石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯等有机溶剂和植物油。
王阳等[ 7] 采用麻油作为提取溶剂 ,用均匀设计来优
化紫草素的提取工艺 ,结果表明 130 ～ 135℃提取 13
～ 39 min为最佳提取工艺。油炸法虽然安全性较
高 ,但萘醌类化合物在温度大于 80℃时稳定性急剧
下降 ,容易遭到破坏[ 8] ,所以萘醌类成分提取时控制
温度很重要 ,冷浸法 、渗漉法[ 9]等提取方法的应用可
以保证紫草色素的稳定性 。
本实验以新疆紫草中 9种主要萘醌类成分为指
标 ,比较了不同浓度乙醇和超声法 、冷浸法 、渗漉法
3种提取方法对紫草萘醌类成分的提取效果 ,并采
用正交设计法考察 、建立了冷浸法提取萘醌成分的
最佳工艺 ,可为新疆紫草的深度开发奠定基础 。
DOI :10.13880/j.cnki.65-1174/n.2011.01.023
1 材料与方法
1.1 材料
新疆紫草 2007年采自新疆天山 ,经生药学鉴定
为新疆紫草(Arnebia euchroma (Royle)Johnst )
的根 ,粉碎后过筛备用 。萘醌对照品(1 、2 、3 、4 、5 、6 、
7 、8 、9)均为本实验室自制 ,经 UV 、HR-MS 、 NMR
鉴定 , HPLC 测定纯度均在 99%以上 。液相用乙
腈 、甲醇均为色谱纯 , 购自 J.T .Baker Co.Ltd
(USA),乙醇为 95%医用乙醇 ,水为重蒸水 ,其余试
剂为分析纯。
Waters 2695型高效液相色谱仪(美国 Waters
公司);SK5200HP 超声波清洗器(上海科导超声仪
器有限责任公司);AR1140电子分析天平 Sarto rius
(北京赛多利斯仪器系统有限公司);鼓风干燥箱(上
海齐欣科学仪器有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 新疆紫草萘醌类成分含量测定方法的建立
新疆紫草中萘醌类成分在波长 274 nm 、517 nm
处均有着较强的紫外吸收 ,且无干扰 ,在进行提取工
艺考察时 ,利用 RP-HPLC 法测定新疆紫草提取液
中萘醌类成分的含量[ 10] ,对新疆紫草中萘醌类成分
的提取工艺进行评价。
1.2.1.1 干膏量测定
参照 2005年版《中国药典》附录 XA 浸出物测
定法 ,精密量取相当于新疆紫草 3 g 的药液 ,置于已
干燥恒重的蒸发皿中 ,在水浴上蒸干后 ,于 105 ℃干
燥 3 h ,移于干燥器中冷却 30 m in ,迅速精密称定重
量 ,计算干膏重量 。
1.2.1.2 药材中萘醌的含量测定
色谱条件:色谱柱为 Scienhome Kromasil C18
(4.6 mm ×200 mm , 5 μm)及预柱 ,流动相为乙腈
(A)-0.3%磷酸水(B),梯度洗脱过程(A 梯度)0 ～ 10
min 70%,10 ～ 30 min 70%～ 75%, 30 ～ 31 min 75%
～ 95%,31 ～ 36 min 95%,36 ～ 37 min 95%～ 70%,37
～ 50 min 70%。检测波长 274 nm ,柱温 30 ℃,流速
1.0 mL/min ,理论板数萘醌计不低于 3000。
药材的测定:取新疆紫草粗粉约 0.5 g ,精密称
定 ,置具塞锥形瓶中 ,精密加入甲醇 50 mL ,密塞 ,摇
匀 ,称定重量 ,超声处理 30 min ,放冷 ,再称定重量 ,
用甲醇补足减失的重量 ,摇匀 ,滤过 ,取续滤液 ,用微
孔滤膜(0.22 μm)滤过 ,按前述色谱条件进样 10 μL
分析。
1.2.1.3 样品中萘醌的含量测定
将新疆紫草提取液过滤 ,定容后精密量取滤液
1 mL 用甲醇定容至 10 mL 容量瓶中 ,微孔滤膜过
滤 ,取滤液 ,按 1.2.1.2色谱条件 ,进样 10 μL ,计算
其中九种萘醌总含量 、质量分数 ,然后按下式计算萘
醌的收率 。
萘醌的收率= 萘醌含量/g新疆紫草药材萘醌含量/g×100%。
1.2.2 萘醌类成分提取工艺研究
1.2.2.1 提取溶剂的考察
根据萘醌类成分的理化性质 ,结合临床常规应
用方法 ,本文考察了 95%乙醇 、70%乙醇 、50%乙醇
对萘醌成分的提取效果。精密称取新疆紫草粗粉
1.0 g ,加入 100 mL 提取溶剂 ,超声处理 30 min ,提
取液过滤 ,取滤液 ,按 1.2.1.2项下色谱条件 ,测定
提取液中萘醌的含量 ,并计算萘醌收率 。
1.2.2.2 提取方法的比较
根据萘醌类成分对热不稳定的性质 ,本文没有
采用回流提取 、索式提取等热提取方法 ,而是对超声
法 、冷浸法(室温20 ℃)和渗漉法等冷提方法提取萘
醌类成分的效果进行了比较。精密称取 5.0 g 新疆
紫草粗粉以 15 倍量 95%乙醇提取 ,比较不同提取
方法对萘醌收率的影响 ,平行操作 3份 ,计算萘醌平
均收率。
1.2.2.3 正交设计法优选萘醌类成分的最佳提取
工艺
在萘醌类成分的提取工艺研究过程中 ,拟对乙
醇浓度 、乙醇用量以及提取时间的不同水平进行考
察 ,以便寻找出最佳提取工艺参数 。具体因素水平
的设计详见表 1。
精确称量新疆紫草粗粉 5.0 g ,按 L9(34)设定
具体工作安排表进行实验 ,测定并计算萘醌收率 ,结
果用极差法及方差法进行分析 。
表 1 正交设计因素水平
Tab.1 Factors and level in the cold- infuse extraction
水平 乙醇浓度 溶剂倍量/(mL/ g)
提取时间/
h
1 95% 8 8
2 80% 12 16
3 65% 15 24
1.2.2.4 验证实验
采用以上确定的最佳条件进行三批验证实验 ,
即以 10.0 g 新疆紫草药材 ,按最佳提取工艺进行提
取 ,测定并计算萘醌平均收率 。
68 石河子大学学报(自然科学版) 第 29 卷
2 结果与分析
2.1 新疆紫草萘醌类成分的含量测定方法
按 1.2.1.2中色谱条件对新疆紫草进行分析 ,
结果显示新疆紫草药材中 9种萘醌化合物含量之和
为 6.264 mg/100mg 。
萘醌对照品 HPLC色谱图见图 1 , 2。
1:阿卡宁;2:β-羟基异戊酰阿卡宁;3:乙酰阿卡宁;4:β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁;5:去氧阿卡宁;
6:异丁酰阿卡宁;7:β ,β-二甲基丙烯酰阿卡宁;8:α-甲基-正丁酰阿卡宁;9:和异戊酰阿卡宁
图 1 萘醌对照品 HPLC色谱 图 2 新疆紫草供试品 HPLC色谱
Fig.1 HPLC chromatograms of reference standards Fig.2 HPLC chromatograms of Radix Arnebiae
2.2 萘醌类成分提取工艺研究
2.2.1 提取溶剂的考察
95%乙醇 、70%乙醇 、50%乙醇超声提取 30
min ,萘醌收率分别为 99.80%、97.56%、33.09%。
由此可知 95%乙醇对紫草萘醌提取效率最高 , 70%
乙醇的提取效率次之 , 50%乙醇对萘醌的提取率急
剧下降 。
2.2.2 提取方法的比较
各提取方法萘醌类成分收率如表 2所示:渗漉
法>冷浸法>超声法。
表 2 不同提取方法提取萘醌类成分效果的比较
Tab.2 Comparation of results of different extraction methods
in naphthaquinones extracting
提取方法 提取时间/ h
萘醌平均收率
/ %
RSD
/ %
超声法 1 92.75 1.2
冷浸法 24 93.17 0.9
渗漉法 4(浸泡 2h , 渗漉 2h) 95.96 1.8
冷浸法是常用的提取方法之一 ,新疆紫草中萘
醌类成分对光 、热不稳定 ,冷浸提取有利于保护萘醌
成分的稳定性 。
由表 2结果可知 ,本实验采用的 3种提取方法
对萘醌类收率均大于 90%,且差别不大。超声提取
与冷浸提取相比 ,虽提取时间短 ,但收率略低 ,有文
献报道超声大于半小时对新疆紫草中萘醌成分会有
影响 ,且超声提取对设备要求高 ,能耗大;冷浸法收
率虽然稍低于渗漉法 ,但综合比较来看 ,冷浸法作为
提取萘醌类成分初始提取方法 ,可以节约能源 ,而且
对设备要求低 ,操作简便 ,转移率高 ,更适用于工业
化生产。
2.2.3 正交设计法优选萘醌类成分最佳提取工艺
按 L9(34)设定具体工作安排表进行实验 ,考察
冷浸法提取紫草萘醌类类成分的最佳工艺参数 ,具
体结果见表 3 、表 4。
表 3 正交设计试验安排及直观分析结果
Tab.3 The design and results of the orthogonal test
实验编号
A
乙醇浓度
/ %
B
乙醇用量
/(m L/g)
C
提取时间
/h
D
空白
实验
结果＊
1 1 1 1 1 0.73
2 1 2 2 2 0.76
3 1 3 3 3 0.73
4 2 1 2 3 0.62
5 2 2 3 1 0.56
6 2 3 1 2 0.58
7 3 1 3 2 0.35
8 3 2 1 3 0.39
9 3 3 2 1 0.39
K 1 0.739 0.567 0.567 0.560
K 2 0.589 0.569 0.588 0.561
K 3 0.373 0.565 0.547 0.581
R 0.366 0.004 0.041 0.021
注:＊表示萘醌质量分数和萘醌收率的权重系数分别为
0.6 和 0.4。
表 4 正交设计方差分析结果
Tab.4 Var iance analyzed in the orthogonal test
方差来源 偏差平方和 自由度 F P
A(乙醇浓度) 0.203 2 200.000 ＊
B (乙醇用量) 0.000 2 0.000
C (提取时间) 0.003 2 3.000
D(误差) 0.000 2
注:＊表示显著性 , F0.01(2 , 2)=99.0。
69 第 1 期 冯文文 , 等:新疆紫草中萘醌类成分的提取工艺研究
根据极差 R的大小 ,其影响因素顺序为 A >C
>B ,即乙醇浓度>提取时间>乙醇用量。由直观
分析可知最佳工艺为 A 1B2C2 ,即乙醇浓度为 95%、
乙醇用量为 12倍 、提取时间 16 h。
根据对方差和极差的综合分析可以发现 ,乙醇
浓度是新疆紫草冷浸工艺的最主要影响因素 ,故
95%为最佳冷浸浓度;提取时间为次要影响因素 ,8
h与 16 h提取量相差较小 ,从节约时间方面考虑 ,
采取冷浸提取 8 h;本实验考察的乙醇用量对萘醌
收率的影响最小 ,通过直观分析 ,优选 12倍量乙醇。
综上所述 ,我们筛选的冷浸法最佳工艺为 A1 B2C1 ,
即:药材粗粉 ,12 倍量 95%乙醇溶液 ,冷浸 8 h 后 ,
过滤并收集冷浸液即得。由于 A 因素已经是 95%
乙醇 ,大生产上无法使用更高浓度的乙醇 ,故关于此
因素的追加试验舍去。
2.2.4 验证实验
采用以上确定的最佳条件进行三批验证实验 ,
即以 10.0 g 新疆紫草药材 ,按最佳条件冷浸提取 ,
过滤并收集冷浸液 ,测定结果见表 5 ,其中萘醌平均
收率为 86.8%,重复试验 RSD 值小于 2%。
实验结果与正交实验中的最佳工艺相比相差较
小 ,故从时间 、能源各方面综合考虑 ,认为 A 1B2 C1
(药材粗粉 ,12倍量 95%乙醇溶液 ,冷浸 8 h 后 ,过
滤并收集冷浸液)为紫草萘醌冷浸提取法最佳工艺。
表 5 验证实验
Tab.5 Var ifying test in the cold- infuse extraction
实验编号 萘醌质量分数/(mg/ 100mg)
萘醌收率/
%
1 5.96 86.7
2 5.89 86.8
3 5.70 87.0
Average 5.85 86.8
RSD/ % 2.3 0.2
3 结论
直观分析和方差分析结果表明各因素对萘醌类
成分冷浸提取的影响大小依次为乙醇浓度>提取
时间>乙醇用量 。其中乙醇浓度对萘醌收率有显著
影响 ,其他因素无显著影响。根据缩短生产周期 ,降
低生产成本的原则 ,得出新疆紫草萘醌成分冷浸法
提取的最佳工艺为:药材粗粉 ,采用 12倍量 95%乙
醇冷浸 8 h , 过滤并收集冷浸液即得 。按最佳工艺
条件进行 3次重复验证试验 ,结果表明该最佳提取
工艺具有良好的重现性。
参考文献:
[ 1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2000 年版一
部)[ M] .北京:化学工业出版社 , 2000:280.
[ 2] 林江 , 韩福刚 ,王开正.软紫草素对肿瘤细胞生长抑制作
用的研究[ J] .泸州医学院学报 , 2003 , 26(2):102-106.
[ 3] Qun Lu , Weijun Liu , Jian Ding , et al.Shikonin De riv a-
tives:Synthe sis and Inhibition o f H uman Telomera se
[ J] .Bioor g.Med.Chem.Let t., 2002 , 12:1375-1378
[ 4] 王文杰 ,白金叶 , 刘大培 ,等.紫草素抗炎对白三烯 B4 生
物合成的抑制作用 [ J] .药学学报 , 1994 , 29(3):161-
165.
[ 5] Jie Han , Xinchu Weng , Kaishun Bi.Antio xidants fr om a
Chinese medicinal herb-Lithospe rmum e ry thr orhizon
[ J] .Food Chemistry , 2007 , 106:2-10.
[ 6] 刘燕.软紫草提取物对小鼠实验性肝损伤的保护作用
[ D] .新疆医科大学硕士学位论文 , 2006.
[ 7] 王阳 , 朱燕霞 , 孙殿甲 , 等.均匀设计研究紫草的提取工
艺.西北药学杂志 , 2003 , 18(4):157.
[ 8] 李晓瑾 , 谭秀芳 , 马媛 , 等.软紫草质量稳定性研究[ J] .
新疆医科大学学报 , 2006 , 29(11):1045-1046.
[ 9] 陈敏 , 覃仁安 ,王培民.用均匀设计法优选紫草素的提取
工艺[ J] .中国医院药学杂志 , 2001 , 21(4):251.
[ 10] B.Bozan , K.H.C.Baser , S.Kara.Quantita tive determi-
nation of naphthaquinones of A rnebia densflor a(Nor-
dm.)Ledeb.By an improved high-perfo rmance liquid
chromtog raphic method [ J] .Chromatog r.A , 1997
(782):133-136
70 石河子大学学报(自然科学版) 第 29 卷