全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (1): 85-8 , www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-12-12; 接受日期: 2007-05-21
基金项目: 中国科学院西部行动高新技术项目(No. KGCX2-SW-506)
* 通讯作者。E-mail: j fhanxing@126.com
.组织培养简讯.
新疆雪莲体细胞胚胎发生
贾莉芳1, 2*, 王晓军1, 赵民安1
1中国科学院新疆理化技术研究所, 乌鲁木齐 830011; 2中国科学院研究生院, 北京100049
摘要 通过体细胞胚胎发生途径实现了新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)的植株再生。选用新疆雪莲子叶为外
植体, 接种于MS+0.5 mg.L-1 2,4-D+0.05-1 mgL-1 BA的固体培养基上, 进行愈伤组织的诱导。从第1次继代培养的愈伤组
织中挑选出黄绿色、颗粒状、质地致密的胚性愈伤组织, 转移到含0.05-0.1 mg.L-1 2,4-D 的MS液体培养基中进行悬浮培养,
20天后可分化产生大量球形胚。继代过程中相继加入PEG和GA3 , 可以促进体细胞胚的分化和生长。体细胞胚在含有5 mg.
L-1 GA3 的MS固体培养基上, 可发育成完整的植株。
关键词 植株再生, 新疆雪莲, 体细胞胚胎发生, 组织培养
贾莉芳, 王晓军, 赵民安 (2008). 新疆雪莲体细胞胚胎发生. 植物学通报 25, 85-88.
新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.), 又
名雪莲花、天山总苞雪莲, 为菊科凤毛菊属一次开花结
实的草本药用植物, 在国内民族药行业中具有很高的知
名度。经分析检测证明: 雪莲全草含生物碱、黄酮、
挥发油、雪莲内酯、还原糖和16种氨基酸等多种药用
成分。近年来雪莲花在抗风湿、镇痛、强心、抗癌、
降压、平喘、终止妊娠、清除自由基及抗疲劳等方面
的研究取得了可喜进展。在治疗风湿疼痛症、防止心
血管疾病、延缓衰老、抗癌和计划生育等方面显示出
巨大应用潜力。除此之外, 雪莲还是一种具有独特香味
的野生香料。用雪莲香精配制的高级护肤霜, 具有增强
血液循环和抗皮肤衰老的作用(Guo et al., 2000)。但
是近年来在经济利益的驱动下, 人为大规模的掠夺式采
挖, 使得野生雪莲数量急剧下降。加上雪莲种子自然萌
发率低、生长环境恶劣及人工栽培困难, 故雪莲被列为
国家三级濒危物种而受到保护。
本实验以新疆雪莲为材料, 在诱导产生胚性愈伤组
织后, 通过体细胞胚途径实现了新疆雪莲的植株再生, 为
其大规模人工栽培奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料
新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar. et Kir.)种子取
自新疆和静地区。
1.2 愈伤组织的诱导
种子经75%的乙醇消毒50-60秒, 0.2%的HgCl2溶液
消毒10分钟, 无菌水浸泡和清洗后, 接种于附加3%蔗
糖、0.5%琼脂粉的MS培养基(Murashige and Skoog,
1962)上。取生长15天左右的无菌苗子叶作为外植体,
将其切成0.5-1 cm的小段, 接种于含有不同激素组合
的MS培养基上进行愈伤组织的诱导。培养室温度保持
在25°C左右, 人工辅助光照16小时/天, 光照强度为
2 500 mol.L-1.m-2.s-1。3周后观察各种激素组合下愈
伤组织的诱导频率及生长状况。
1.3 体细胞胚的分化及植株再生
诱导所得愈伤组织经继代培养20天后, 转入含有不同浓
86 植物学通报 25(1) 2008
度激素的MS液体培养基中, 诱导体细胞胚发生, 接种量
为3%(w/v), 每(7±2)天继代培养1次。 继代培养2-3次
后转入含有5-25 mg.L-1 PEG6000的体胚分化培养基
中。待体细胞胚发育成熟, 将其转入含有1-5 mg.L-1
GA3的MS固体培养基上, 促使体细胞胚的萌发。
1.4 细胞组织学观察
对培养材料定期取样, 固定于FAA固定液中, 常规石蜡
法切片, 苏木精染色, 切片8-10 mm, 在Leica DMIRB
型荧光倒置显微镜下观察, 用Canon EOS300D型数码
照相机拍照。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织的诱导
通过2组对比实验, 着重对植物生长调节剂(BA和2,4-
D)对愈伤组织诱导的影响进行分析。
随着BA浓度的不断增加, 愈伤组织诱导率呈现递
减的趋势(表1)。这表明过高浓度的BA会抑制2,4-D的
作用, 表现为5 mg.L-1的 BA对2,4-D的诱导效应产生
了抑制, 这与文献报道相一致 (Guo and Zhang, 2005)。
2,4-D浓度在0.05-1 mg.L-1范围内均可诱导出愈
伤组织(表2)。但诱导出的愈伤组织形态有所不同。大
致分为3种: (1)淡黄色, 颗粒状, 质地松散; (2)透明, 水
渍状, 质地黏稠; (3)黄绿色, 块状, 质地密实。第1种
为胚性愈伤, 后2种均为非胚性愈伤。
2,4-D作为一种常用的生长素, 应用于多数植物体胚
发生(朱长甫等, 1997; 崔凯荣等, 1998), 但它也具有较
强的畸化作用。因此, 本实验尝试用与其作用相当的
IBA与其它细胞分裂素配比来诱导愈伤。但后期实验结
果表明: 在IBA与BA实验组合中, 诱导所得愈伤组织表
面发白, 质地坚硬, 为非胚性愈伤。
2.2 体胚分化及植株再生
挑选黄绿色、颗粒状、质地紧实的胚性愈伤(图1A)转
接到内含50 mL液态体胚分化培养基(MS+0.1 mgL-1
2,4-D)的250 mL摇瓶中, 进行悬浮培养。(10±2)天继代
1次。30天后, 胚性愈伤表面产生大量颗粒状的白色突
起, 此为体细胞胚发育的球形胚(图1B, E )阶段。
此时从继代培养基中除去2,4-D, 加入25 mg.L-1
PEG6000。培养过程中白色突起继续延伸, 此时为体
胚发育的鱼雷形胚(图1B)阶段。随后加入1 mg.L-1
表1 不同浓度BA对愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effect of BA on callus induction
Plant growthNo. of inoculatedCallus Morphological
regulator (mg.L-1) explants induction rate character of callus
2,4-D B A (%)
0.5 0.05 40 100 Yellowish-green or dark-green, loose
0.5 0.5 38 97.4 Yellowish-green, dense
0.5 1 39 79.5 Light-green, dense, partly-browned calli
0.5 5 41 9.8 A little calli produced, explant browned severely
表2 不同浓度2,4-D对愈伤组织诱导的影响
Table 2 Effect of 2,4-D on callus induction
Plant growthNo. of inoculatedCallus Morphological
regulator (mg.L-1) explants induction ratecharacter of callus
2,4-D B A (%)
0.05 0.5 38 97.4 Yellowish-green, loose and dense
0.1 0.5 40 100 Yellowish-green, loose, granular
0.5 0.5 39 94.9 Light-green, dense, bulk
1 0.5 42 97.6 Dark-green, dense, bulk
8 7贾莉芳等: 新疆雪莲体细胞胚胎发生
在本研究中, 由于悬浮培养的愈伤组织水渍化程度
高, 分化能力弱, 因而在悬浮培养后期加入了不同浓度的
PEG, 以促进体胚发育。与不添加PEG的空白组对比
发现: 愈伤组织水渍化程度降低, 胚状体发生增多, 推测
是PEG导致细胞含水量下降、贮藏物质积累增多, 细
胞胚性增强所致。
GA3含量较高的培养基可促进较大的胚状体在短期
内生长, 呈喇叭形, 子叶型胚增多。本实验在体胚发育
后期加入GA3, 以促进体胚成熟。但实验中我们也发
现, 加入GA3后体胚易于褐化, 且产生的畸形胚较多, 早
期夭亡的也多, 影响成苗率。如何平衡其利弊还有待于
进一步研究。
2.3 细胞组织学观察
新疆雪莲属菊科, 双子叶植物, 因而拥有类似被子植物合
子胚发生的阶段性典型结构。从体胚发生的石蜡切片
来看, 内部细胞首先形成多细胞的原胚(图1D), 这些细
胞表现为细胞核大, 有些细胞甚至有多个核, 且细胞质浓
厚(染色深)。随后原胚逐渐突出于表皮之外, 形成具有
独立结构的球形胚(图1E)。在球形胚进一步发育中, 分
化细胞不断向两端集中。经过心形、鱼雷形胚, 最终
形成子叶型胚(图1F)。
3 讨论
Sharp等(1980)把体胚发生方式概括为2种: 一是体胚
间接发生途径, 即由外植体先诱导愈伤组织再产生胚状
体; 二是体胚直接发生途径, 即由外植体直接产生体细
胞胚。
本实验选用新疆雪莲无菌苗的子叶为外植体, 因而
主要通过间接发生途径获得体细胞胚, 对于从直接发生
途径获得雪莲体细胞胚, 本实验也进行了初步的尝试, 但
未获得成功。推测子叶作为植物的营养器官, 它已包含
了一些分化型的非胚胎发生型的细胞, 因此必须经过脱
分化形成愈伤组织后才能产生体细胞胚。
体细胞胚胎发生和植株再生体系在植物品种改良、
图 1 新疆雪莲体细胞胚胎发生的不同阶段
(A)胚性愈伤组织; (B)球形胚与鱼雷形胚; (C)具备根和芽的完整
植株; (D)多核细胞; (E)球形胚; (F)子叶型胚
bar=0.1 mm
Figure 1 Stages of somatic embryogenesis of Saussur a in-
volucrate K r. et Kir.
(A) embryonic callus; (B) g obular embryoid; (C) plantlet; (D)
multinucleate cell; (E) globu ar embryoid; (F) cotyledon embry-
oid
bar=0.1 mm
GA3, 培养10天后, 可见这些白色的小突起已分化为子
叶状。
将成熟体胚转接到琼脂固化培养基MS＋5 mg.L-1
GA3(琼脂0.7%)上。培养20天后, 体胚顶端产生萌发
芽, 底部生根(图1C), 直接获得完整植株。
88 植物学通报 25(1) 2008
人工种子制作和苗木繁殖等方面有重要应用价值(Attree
and Fowke, 1993)。但是, 在体细胞胚发生系统中, 萌
发成苗难或成苗率低, 是一个经常遇到的问题, 萌发成苗
常成为体胚应用的“瓶颈”环节。究其原因, 一般认为
是体胚的不正常发育造成的, 有的也可能是体胚休眠所
引起的(Tao, 2001)。新疆雪莲作为一种多年生植物, 其
合子胚具有休眠特性, 推测与其发生途径类似的体细胞
胚也具有休眠的特性。此外, 在培养环境中加入大量的
生长调节剂也可能会造成体胚的暂时休眠。
因此, 在本实验中, 尝试用打破种子休眠的方法, 如
对成熟体细胞胚进行冷冻处理或者加入生长调节剂赤霉
素(GA)以打破其休眠。此外, 合子胚在发育后期, 随着
水分的丧失而进入停止生长期, 这是为将来的萌发所做
的必要准备, 体细胞胚在成熟后, 一般也需经历一个类
似脱水的过程才能萌发成正常的小植株。为此本实验
在体胚发育后期采用干化法对其进行处理, 也有效地提
高了体胚的质量。然而如何进一步提高新疆雪莲成熟
体胚的质量, 减少畸形胚的发生率, 将体胚再生苗大规模
人工种植, 还有待于进一步研究。
参考文献
崔凯荣, 任红旭, 邢更妹 (1998). 枸杞组织培养中抗氧化酶活性与
体细胞胚发生相关性研究. 兰州大学学报 (自然科学版) 34, 93-
99.
朱长甫, 镰田博, 何奕昆 (1997). 胡萝卜胚性细胞蛋白分离的研究.
实验生物学报 30, 13-19．
Attree SM, Fowke LC (1993). Embryogeny of gymnosperms:
advances in synthetic seed technology of conifers. Plant Cell
Tissue Organ Cult 35, 1-35.
Guo WC, Yang ST, Wang JX (2000). Alpine rare drug—
Saussurea involucrate. Special Econ Anita Plant4, 37-38.
Guo YH, Zhang ZX (2005). Establishment and plant regeneration
of somatic embryogenic cell suspension cultures of the
Zingiber officinale Ros . Sci Hortic 107, 90-96.
Murashige T, Skoog F (1962). A revised medium for rapid
growth and biossays with tobacco tissue culture. Physiol
Plantarum 15, 473-497.
Sharp WR, Sondahl MR, Caldas LS (1980). The physiology of
in vitro asexual embryogenesis. Hort R v 2, 268-310.
Tao M (2001). Studies on the abnormal embryoid and hypeahydric
shoot in tissue culture．Acta Bo Boreal Occident Sin 21,
1048-1058.
Somatic Embryogenesis of Saussurea involucrata Kar. et Kir.
Lifang Jia1,2*, Xiaojun Wang1, Minan Zhao1
1 Xinjiang Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011, China
2 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract We used somatic embryogenesis to regenerate snow lotus (Saussurea involucrata Kar.et Kir.). For induction of calli,
cotyledons were cultured on solid MS medium with 0.5 mg.L-1 2,4-D and 0.05-1 mg.L-1 BA. Globe-shaped yellowish-green calli
were chosen from the first subculturing for suspension culture in liquid MS medium containing 0.05-0.1 mg.L-1 2,4-D. After 20 days
of culture, many globular embryoids were produced. Polyethylene glycol and gibberellic acid (GA) were added during subculture
for differentiation and growth of somatic embryos. Plantlets were regenerated when somatic embryos were transferred to MS
medium with 5 mg.L-1 GA3.
Key words plant regeneration, Saussurea involucrata Kar. et Kir., somatic embryogenesis, tissue culture
Jia LF, Wang XJ, Zhao MA (2008). Somatic embryogenesis of Saussurea involucrata Kar. et Kir. Chin Bull Bot 25, 85-88.
(责任编辑: 白羽红)
* Author for correspondence. E-mail: jlfhanxing@126.com