全 文 ：新疆紫草细胞大量培养的研究
叶和春 李国凤
(中国科学院植物研究所 ,北京 10 。。刁4 )
新疆紫草“ 州砧如 翻留加~ )为多年生草本植物 , 其根中含有多种蔡酿类化合物 (即紫草宁及其衍生物 ) , 为我国传统的中草药 ,监床用于抗菌 、 消炎 ,如治疗皮肤烧伤 、烫伤及演疡久
治不愈 、妇科炎症等 。 此外还具有抗促性腺激素及抗肿瘤活性 。 除药用外 ,紫草宁衍生物还
是理想的天然色素和染料 ,可用于食品 、化妆品的添加剂 .
我国具多种紫草资源 ,但临床药效以新疆紫草最好 。 鉴于新疆紫草资源贫乏 ,引种栽培
困难 ,被列为国家保护植物 , 故应用植物细胞大量培养技术以生产紫草衍生物无疑是解决资
源不足 ,克服化学合成困难等间题的重要途径 .
以新疆萦草幼苗的不同器官 (根 、 胚轴 、子叶 、真叶 )作外植体 ,采用 A G 一 7( 改良的 SL 培
养基 ) ,添加合适的激素配比 ,均可诱导形成愈伤组织并形成色素 。将愈伤组织转入生产培养
基 PA 一 5 (-M 9 培养基附加 KT 铁盐同 sL 培养基 ) ,即可大量合成紫草宁衍生物 . 在薄层层析
及扫描定性分析的基础上 ,进一步对细胞培养物分离纯化 ,其理化性质与光谱数据与标准品
对照分别鉴定为去氧紫草素 、氏卜二甲基丙烯酸紫草素 、 乙酞紫草素 , 2 , 各一二甲基丙烯酞紫草
素 ,卜经基戊烯酞紫草素 ,与天然植株根中的孝酿化合物相 比只缺少紫草素一种 。 ` 但其中有
抗菌和抗肿瘤活性约主要有效成分乙酞紫草素比天然根中含量要高 4 . 7 倍 .
不同理化因子对新疆紫草细胞生长及色素合成的影响的研究表明 ,最适温度为 25 ℃ .
培养基最适 p H 值的最适范围为 5 . 3一 5 . 8 最适合于新疆紫草细胞生长及次生产物的积累 。
白色光为强烈的抑制因子 ,紫草愈伤组织的鲜重与干重的增加分别只有黑暗条件下的 35 .
2 4%与 52 . 17 % ;而紫草宁衍生物的含量与产量分别只有黑暗条件下的 6 . 52 %与 3 . 6 % 。
L气A 与 K T 对细胞生长有促进作用 ,对合成无促进作用 , .巨随浓度的提高 , 而抑制效应愈加
明显 。 提高 cu 纤浓度对细胞生长和产物均有显著促进 ,尤其对后者作用更加显著 . N H才为细
胞生长所必儒 ,但明显抑制色素合成 .
在对影响细胞生长和色素形成的各种理化因子作了研究之后 ,我们进一步完善和确立
了二步培养系统 。 经过对培养基的筛选试验 ,获得 人 G 一 6 与 A G 一 7两种优良生长培养基 ,及
A P 一 5 与AP 一 1 两种最佳生产培养基 。研究了培养细胞的生长的色素合成的相关性 , 在固体培
养中细胞生长的动态曲线和次生产物合成的动态曲线几乎完全平行 , 只是合成稍落后于生
长 。无论是固体培养还是液体悬浮培养 ,从生长培养基转入生产培养基最佳转接时期为指数
生长的末期 。
建立了高产细胞系的二步筛选法 。 在愈伤组织水平的第一步筛选中 ,获得了高产系 人 -
1 ,将高产细胞系 -A 1愈伤组织经液体振荡分离 ,离心 ,收集单细胞 。 再应用单细胞克隆的方
法进行第二步筛选后 ,获得 A-c 7 、 cA 一 3峨 2 个高产细胞系 . 对获得的高产细胞系进行了悬浮
培养和发醉培养 。 悬浮培养合适的接种量为 2 . 59 . d w邝 ,最高月产率可达 2 . 她 . d w邝 ,色素
含量为培养物干重的 1 7 . 5纬。 10 升搅拌式反应器发酵成功 。
对种质的超低温保存获得初步成功 ,选择继代培养 10 天的愈伤组织 , 采用 7 . 5%二甲
亚矾 ( D州` 0 ) 十 5纬甘油 + 5环蔗糖配方的保护剂是合适的 。 对经超低温处理恢复生长的愈
伤组织与未处理的愈伤组织 ,进行了酷酶与过氧化物酶同工酶分析 ,从电泳扫描图谱可见 ,
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处理和对照的同工酶相比较未发生明显的变化 .
超低温处理的愈伤组织与对照生长速率的比较表明 ,其 s 型生长曲线大体趋势是一致
的 ,只是处理生长较对照缓慢 ,但经继代培养后细胞生长速率可逐步恢复正常 。
人参水提物对硬紫草愈伤组织生长及色素形成的影响
朱汝幸 黄武军
(南京大学生物系 ,南京 2 10 0 0 3)
将不同浓度的人参愈伤组织水提物 ,加入不同培养阶段的硬紫草愈伤组织中 , 结果发
现 : 在场 . 阶段加入人参愈伤组织水提物对生长的促进作用是明显的。 以 1OP pM 最适 ,约比
对照增加 19 . 3% ,而且伴随浓度增加而减弱 ,当浓度超过 峨o p p M 时就表现出明显的抑制作
用 . L p肠阶段加入人参愈伤组织水提物 , 只有在高浓度时才能表现出促进作用 .
将各种不同浓度人参愈伤组织总水提物以及低聚糖制备液 ,加入 L G 培养基中 ,经过暗
中培养 25 天以后发现 : 两者对硬紫草愈伤组织色素形成均有明显的抑制作用 。 浓度愈高抑
制率愈强 。
将生长在 GL 培养基并附加各种不同浓度的人参愈伤组织总水提物的硬紫草愈伤组
织 ,转移到冲 培养基中 ,经过 25 天的暗培养以后 ,结果发现 : 硬紫草愈伤组织的紫草色素明
显得到提高 。 提高幅度以 20 p pM 预培养为最佳 . 然而 ,生长量却没有明显的增加 .
人参低聚糖制备液对紫草色素形成的后效应以浓度 4OP p M 最佳 ,提高幅度为 们 . 9% 。
甘草毛状根系统的建立及其次生化合物的初步分析
向德军一 丁家宜
(中国药科大学中药所生物工程室 ,南京 21 0 38 )
本文报道了发根农杆菌 R 1 0 O0 和 R 1 O0 0( p~ , )遗传转化药用植物甘草并建立快速生长的甘草毛状根系统及其有效成分的初步分析的试验结果 。 将活化的农杆菌感染束源于甘
草实生苗的外植体后 ,在沁 培养基上共培养 , 2 天后移到 Y Z翻` + 50 0再 lnI 哇琳头抱菌素钠
的培养基上 , 6一 10 天后外植体上长出毛状根 ,经多次筛选获得若干生长迅速的毛状根株
系 。 通过高压纸电泳检测毛状根中的农杆碱 (人 , 叩加 e) 结果显示甘草毛状根 9 01 03 、 9 1 x 、 毛
状根 9 0 1 0 3诱导的愈伤组织中均含有 A S r o p in e ,证明转化是成功的 。
毛状根从固体培养基转到液体培养基上偏要一段时间的适应期 ,然后方能迅速生长 ,从
液体转到固体上同样需适应期 ,试验证明毛状根的生长比普通根培养快数十倍 .
次生化合物分析表明 : 毛状根及普通根培养物中不能合成甘草酸 。 推铡甘草酸的生物合
成可能在地上部分完成 ,然后运翰到地下部分贮藏 。 毛状根中能合成甘草黄酮类化合物 ,且
其含量随培养天数的延长而增加 .
L口 :生长场界基
廿 .色家形成培荃
现工作单位 :探圳市海滨制药有限公司 ,深圳 5 1 8 0 90”一94