全 文 ：五种牛肝菌酯酶和过氧化物酶的同工酶研究
李荣春　陈严平
(云南农业大学农学院　昆明　650201)
　　摘要　本文研究了滇产牛肝菌属 (Boletus)的 5个常
见种的酯酶 (EST)和过氧化物酶 (POD)的同工酶。结
果表明 , (1)不同种牛肝菌子实体的 EST 和 POD同工酶
谱之间既有某些共同的特征 , 又各自具有本物种的特有
特征;(2) 5种牛肝菌子实体的 EST和 POD同工酶谱比较
稳定 , 是一项稳定的分子水平的重要指标 , 完全可以作
为鉴定牛肝菌属种类的重要依据。
关键词　同工酶　酯酶　过氧化物酶　牛肝菌
收稿日期 1998—10—08
　　同工酶分析作为分子遗传标记技术之一 , 不仅
被广泛应用于动植物的遗传分析 , 生理生化研究 ,
而且被作为化学分类的重要指标引进到真菌的分类
鉴定研究中〔1〕。由于同工酶是由不同等位基因或不
同基因位点编码的 , 它所表达的信息是 DNA 分子
水平上的信息 , 它弥补了以菌落形态 、 颜色 、 孢子
形态 、 子实体形态等特征传统真菌分类的不足 , 逐
渐成为该领域常用而重要的工具。特别是在属内种
间以及品种之间的分类鉴定是非常有效的。 Kerrig-
an 等〔2〕应用同工酶技术有效地将 Agaricus中的各种
表 1 九个 香 菇 常 用 栽 培 品 种 间 酯 酶 同 工 酶 带 相 对 迁 移 率 (Rf)
谱 带 号
菌 株 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
856
Cr02
7925
45
087
465
7402
香 6
507
0.461
0.461
0.461
0.461
0.461
0.461
0.461
0.461
0.516
0.516
0.516
0.516
0.516
0.516
0.516
0.516
0.516
0.523
0.563
0.563
0.563
0.563
0.563
0.570
0.570
0.578
0.586
0.586
0.586
0.586
0.586
0.586
0.586
0.594
0.617
0.617
0.617
0.617
0.617
0.617
0.641
0.664
0.664
0.852
0.852
0.891
表 2 九 个 常 用 香 菇 栽 培 品 种 间 的 联 合 系 数 (S)
Cr02 7925 45 087 465 7402 香 6 507
856
Cr02
7925
45
087
465
7402
香 6
1.00 0.375
0.375
0.571
0.571
0.429
0.50
0.50
0.222
0.375
0.429
0.429
0.286
0.50
0.429
0.714
0.714
0.375
0.571
0.50
0.429
0.429
0.429
0.286
0.286
0.429
0.333
0.429
0.429
0.429
0.286
0.50
0.25
0.333
0.429
0.143
S= 两个菌株之间共同具有的酶带数两菌株所具酶带数之和减去共同具有的酶带数
九个香菇常用栽培品种间的联合系数见表 2 ,
联合系数 (S)在 0.143 ～ 1.00 之间 , 联合系数愈
小 , 说明两品种间的亲缘关系愈远。
酯酶同工酶电泳结果表明 , 九个香菇常用栽培
品种间的酶谱带数目和酶活性有较明显的差异 , 根
据电泳结果 , 基本酶带有两条 (其 Rf 分别为 0.461
和 0.516), 从联合系数 (S)的大小可知 , 香 6 和
507 的亲缘关系最远 (S =0.143);856 与 Cr02 两品
种酯酶同工酶谱带的类型 、 数目 、 位置及宽窄都完
全相同 , 亲缘关系最近 (S =1.00)两者有相同的
遗传基础;7402 与 856和 Cr02 亲缘关系也很近 (S
=0.714), 它们有五条共同的酶带 (Rf 分别为
0.461 , 0.516 , 0.563 , 0.586 和 0.617)。
15第 18 卷　第 3期　　　　　　　中国食用菌　EDIBLE FUNGI OF CHINA
DOI :10.13629/j.cnki.53-1054.1999.03.009
分开 , 褚西宁等〔3〕、 陈伟群等〔4〕和马国忠也应用同
工酶技术分别对 Rhizopus 、 Alternaria 和腐霉属进行
种级分类。潘迎捷等对 41 个香菇 (Lentinus edodes)
菌株的同工酶进行了研究 , 认为在标准规范的条件
下 , 采用同工酶的协同分析可对菌株进行准确鉴
定。因此 , 作者在进行美味牛肝菌 (Boletus edulis)
的驯化基础研究时 , 对美味牛肝菌与另外四种常见
的牛肝菌的酯酶 (EST)和过氧化物酶 (POD)的
同工酶进行了比较研究 , 现将研究结果报告如下。
1　材料与方法
1.1　材料　在昆明市场上购得新鲜的五种牛肝菌 ,
分别编号如附表:
附表 材 料的 种类 和 编号
编　号 材　　料
A1
A2
B1
B2
C1
C2
D1
D2
E1
E2
紫褐牛肝菌 (B.violaceo-fascus)的帽
紫褐牛肝菌 (B.violaceo-fascus)的柄
铜色牛肝菌 (B.aereus)的帽
铜色牛肝菌 (B.aereus)的柄
血红牛肝菌 (B.rubellus)的帽
血红牛肝菌 (B.rubellus)的柄
美味牛肝菌 (B.edulis)的帽
美味牛肝菌 (B.edulis)的柄
华美牛肝菌 (B.speciosus)的帽
华美牛肝菌 (B.speciosus)的柄
1.2　酶液提取　将上述各编号的材料洗净 , 蒸馏
水冲洗后分别称取 1g , 放入预冷的小乳钵中 , 加
入 2mL含 50%蔗糖的抽提液 , 冰浴研磨成糊状后
于 4 000g离心 20min , 取上清液立即使用。
1.3　电泳和染色　采用聚丙烯酰胺垂直平板法
(PAGE)电泳 , 分离胶浓度 7.7%, 交联度 2.6%,
pH8.9;浓缩胶浓度 4.4%, 交联度 14%, pH6.7;
电极缓冲液为 Tris—甘氨酸系统 , 每孔加样 50uL ,
以溴酚兰为指示剂。首先调节每样槽电流 1mA 共
20 槽 20mA , 当溴酚兰达到分离胶时 , 加大电流到
每槽 2mA 共 40mA , 在 4℃冰箱中电泳约 5h。
电泳后的胶板分别进行酯酶 (EST)和过氧化
物酶 (POD)的染色。酯酶染色用坚固蓝法 (底物
为乙酸—α—萘酯和乙酸—β—萘酯);过氧化物酶
染色用联苯胺法 (底物为 H2O2);胶板染色后制成
干板保存。
1.4　酶谱相似度的计算　为便于比较酶谱的变化
与物种间的关系 , 分别计算了各物种之间的酶谱相
似度 (S)。相似度愈大 , 说明物种间的酶谱差异愈
小 , 物种间关系密切 , 反之则说明差异愈大 , 物种
间关系疏松。 酶谱相似度 (S)计算公式为 S =
nX1..n/ (X1+X2+……+Xn);式中 X , X以及 X
为第 1 , 第 2 , 第 n个物种各自的酶带数 , X1..n 为
n个物种所共有的酶带数 , n 为所研究的物种数。
当所比样品 (物种)的酶带数相同且全部为共有时
S=1 , 当所比样品 (物种)之间没有一条共有酶带
时 S=0。
2　结果与分析
2.1　五种牛肝菌的酯酶 (EST)同工酶谱　从图1
可以看出 , 五种牛肝菌的酯酶 (EST)同工酶谱各
不相同 , 充分显示了不同种牛肝菌在酯酶上的差
异。但是深入观察 , 我们可以看出供试的五种牛肝
菌在迁移率 Rf=0.2 时有一条共有酶带 , 此条酶带
是美味牛肝菌的酯酶同工酶的唯一酶带 , 是华美牛
肝菌的强带 , 所以颜色较深 , 但它只是铜色牛肝
菌 、 血红牛肝菌和紫褐牛肝菌的一条弱带 , 所以颜
色较浅。实验表明该迁移率的此酶带是牛肝菌属
(Boletus)酯酶的特征酶带。 除美味牛肝菌外的其
它的四种牛肝菌中 , 我们还看到迁移率 Rf=0.62
的另一条共有酶带 , 它分别是紫褐牛肝菌和血红牛
肝菌的强带 , 以及铜色牛肝菌的两条强带之一 , 但
它是华美牛肝菌的一条弱带。除了这些共有带外 ,
紫褐牛肝菌还有两条弱带 , 铜色牛肝菌还有一条强
带和一条弱带 , 血红牛肝菌和华美牛肝菌各还有两
条弱带 , 见图 1。
图 1　五种牛肝菌的酯酶 (EST)同工酶谱
从图 1 我们还可以看出 , 不同种牛肝菌的酯酶
的活性强度和酶谱具有较大的差异 , 但同种牛肝菌
的菌帽和菌柄之间的酯酶同工酶无论是带型还是活
性强度都没有差异。美味牛肝菌只有该属的一条特
征酶带 , 而其它四种都有三条以上的酶带 。
综上所述 , EST同工酶既显示了牛肝菌属各种
之间的联系 , 也显示了它们之间的区别。实验表明
EST同工酶这项生理生化指标对牛肝菌属来说具有
一定的稳定性 , 五种牛肝菌都表现出帽和柄的酶谱
的一致性 , 不因取材部位的不同而不同;我们重复
实验的结果也完全一致。
16 中国食用菌　EDIBLE FUNGI OF CHINA　　　　　　　Vol.18 , No.3
2.2　五种牛肝菌的过氧化物酶 (POD)同工酶谱
　从图2可以看出 , 五种牛肝菌的过氧化物酶
(POD)同工酶的酶谱也各不相同 , 各有自己的特
征酶谱。但紫褐牛肝菌 , 铜色牛肝菌 , 美味牛肝菌
和华美牛肝菌在 Rf=0.26 处有共有酶带 , 其中紫
褐牛肝菌 , 铜色牛肝菌和华美牛肝菌三种的此酶带
就是它们的 POD 强带 , 美味牛肝菌的此带是它的
一条弱带。虽然血红牛肝菌无此酶带 , 但在此迁移
率附近有它的一条强带 (Rf=0.17)。此外紫褐牛
肝菌和铜色牛肝菌在 Rf=0.57 处有一条共同的弱
带;美味牛肝菌和华美牛肝菌在 Rf=0.72 处也有
一条共同的弱带。从图 2可以看出紫褐牛肝菌 , 华
美牛肝菌和血红牛肝菌都只有两条酶带 , 铜色牛肝
菌有四条 , 而美味牛肝菌则有五条酶带;血红牛肝
菌 , 美味牛肝菌和华美牛肝菌的过氧化物酶活性大
大强于紫褐牛肝菌 , 铜色牛肝菌的活性。
图 2　五种牛肝菌的过氧化物酶同工酶谱
从POD同工酶的酶谱同样可以看出 , 这五种
牛肝菌各自都有自己特征的酶谱 , 充分显示了它们
的特异;同时子实体菌帽和菌柄之间的 POD酶谱
也表现出了高度一致性。这与马国忠 、 陈宛如等对
腐霉属 、 黑柄炭角菌的研究结果相似 , 而与程升东
等对美味侧耳的研究结果稍有差异。
2.3　不同种牛肝菌与 EST 和 POD 同工酶酶谱相似
度的关系　不同种牛肝菌间的酯酶 (EST)同工酶
的酶谱相似度的差异主要表现在美味牛肝菌与其它
种的差异较大 , 其 S 值仅为 0.4 , 华美牛肝菌和紫
褐牛肝菌的差异较小 S 值达到 0.75 , 而其它种之间
的S 值都为 0.5。这表明这五种牛肝菌的酯酶分子
结构的相似度是非常大的 , 五种牛肝菌之间的亲缘
关系是比较密切的。
五种牛肝菌的过氧化物酶 (POD)的同工酶酶
谱相似度 S 值如下:S AB=0.8 , S DE=0.57 , S AE
=0.5 , S BE =0.4 , S AD=0.28 , S BD=0.25 , S
AC (S BC , S CD , S CE) =0 , S ABE =0.43 , S
ADE=0.03 , S ABD和 S BDE=0.3 , S ABDE=0.33 ,
S ABCDE=0。
可以看出在这五种牛肝菌的 POD酶谱中血红
牛肝菌与其它四种的差异最大 , 而紫褐牛肝菌和铜
色牛肝菌差异最小 , S=0.8 , 可能是亲缘关系较
近;同时美味牛肝菌和华美牛肝菌的 POD酶谱相
似度也很高 (S=0.57)。如果我们以 POD同工酶的
酶谱相似度这一指标来讨论它们的亲缘关系 , 那么
我们就可以得出如下结论:铜色牛肝菌和紫褐牛肝
菌的关系最近 , 美味牛肝菌和华美牛肝菌的关系也
较近 , 而紫褐牛肝菌和华美牛肝菌具有联系 , 但血
红牛肝菌与其它四种菌的关系则较远。
3　讨论
3.1　不同种牛肝菌的 EST 或 POD同工酶酶谱之间
既具有某些相同点 , 又各自具有自身的特征 , 反映
出牛肝菌属间的相互联系与区别 。实验证明 EST和
POD同工酶指标在牛肝菌属中是具有物种特征的 ,
它们在分类鉴定中具有重要的价值。
3.2　同种牛肝菌子实体的菌帽和菌柄的 EST 和
POD同工酶的酶谱都完全一致 , 同时我们重复实验
的结果也完全一致 , 这充分显示了同种牛肝菌子实
体的这两种酶的同工酶一致性和稳定性。而不同种
之间的差异又是非常明显。因此这两个指标在牛肝
菌的分类鉴定 、 遗传标记 、 生理生化等研究中都具
有较大的价值。
3.3　实验表明 EST酶谱和 POD酶谱的物种间的相似
度是不一致的, 因此我们认为单纯利用一两种同工酶
酶谱的相似度来判断物种的亲缘关系是不全面的。
参　考　文　献
1　王卫国等.过氧化物酶同工酶在真菌分类上的研究.
食用菌 , 1992 , 14 (2):13
2　何志勇, 赵晓燕 , 王镨.分子生物学技术在真菌种性
检测中的应用.中国食用菌 , 1995 , 14 (2):封 2 , 插
页 , 封 3
3　褚西宁, 白玉明 , 袁静明.九株根霉可溶性蛋白和三
种酶的电泳图谱比较研究.真菌学报 , 1994 , 13 (2):
121～ 126
4　陈伟群 , 张天宇.十字花科上链孢霉属真菌同工酶凝
胶电泳分析.真菌学报 , 1994 , 13(4):295～ 302
STUDY ON EST AND POD ISOZYMES OF 5 SPECIESES OF BOLETUS
Li Rongchun , Chen Yanping
(Yunnan Agricultural University , Kunming 650201)
(下转第 19页)
17第 18 卷　第 3期　　　　　　　中国食用菌　EDIBLE FUNGI OF CHINA
　表 2　野生蛹虫草子座与人工培育蛹虫草菌丝体氨基酸
含量比较
氨基酸
样品 (mg/ 100g)干物质含量
1#样品 3#样品 5#样品
天冬氨酸
苏氨酸
丝氨酸
谷氨酸
甘氨酸
丙氨酸
胱氨酸
缬氨酸
蛋氨酸
异亮氨酸
亮氨酸
酪氨酸
苯丙氨酸
赖氨酸
氨
组氨酸
精氨酸
脯氨酸
ASP
THR
SER
GLU
GLY
ALA
CYS
VAL
MET
ILE
LEU
TYR
PHE
LYS
NH3
HIS
ARG
PRO
2412
1677
1624
3863
1375
2322
211
1228
1014
1181
1568
1048
976
1734
256
355
1913
1281
2079
1040
1047
2464
1035
1478
128
971
88
748
1231
482
746
758
87
180
799
806
559
282
397
1131
370
564
/
491
104
267
465
280
353
272
71
94
396
298
3.2　讨论
3.2.1　从表 1、 表 2 测试的数据对照结果表明:与
野生蛹虫草所具有的十七种氨基酸相比 , 2 ～ 6 号
人工培育蛹虫草中除 5 号样品未测出胱氨酸之外 ,
其它几种人工培育蛹虫草样品中均含有与野生蛹虫
草相同的氨基酸。
　表 3　样品中氨基酸总量与人体八种必需氨基酸总量比较
样品 1# 2# 3# 4# 5# 6#
氨基酸总量 25782 16872 16080 19958 6232 27714
必需氨基酸
总量 9378 5515 5582 5694 2234 10531
3.2.2　从表 3 对六个试样的人体必需氨基酸比较
显示:蚕蛹天然培养基上生长的蛹虫草中其氨基酸
总量及人体必需八种氨基酸的总量居首位 , 蛹虫草
子座中氨基酸含量均高于菌丝体中氨基酸的含量。
3.2.3　在大米固体培养基上生长的蛹花 , 其氨基
酸的含量仅次于野生蛹虫草和蚕蛹虫草。由于野生
资源减少和蚕蛹虫草的培养成本高 , 而蛹花在人工
培育中产量高 , 易于生产所以利用蛹花生产开发氨
基酸大有前途。
3.2.4　发酵液菌丝体的氨基酸含量与资料所显示的天
然冬虫夏草氨基酸的含量相当。由于发酵液菌丝体培
养周期短, 生长快, 易于大规模工业生产, 因此利用
发酵液菌丝体生产氨基酸具有很好的前景。
参　考　文　献
1　冯冰如等.蚕蛹虫草与冬虫夏草化学成份的比较.中
国食用菌 , 1994 , (1):34～ 37
2　徐锦堂.中国药用真菌学.北京医科大学中国协和医
科大学联合出版社 , 1997
Determination and Analysis of Amion Acid Components
Between Cultivation of Cordyceps militaris and Wild Cordyceps militaris
Liu Jianhua, Shun Yue , Bu Ning
(Biology Department , Fushun Teacher s College , Fushun 113006)
Abstract　Determination and analysis of amino acid components between cultivation of Cordyceps militaris and wild
Cordyceps militaris are discussed in this paper.The results show that there are 17 kinds of amino acid in wild Cordyceps
militaris and almost in cultivated Cordyceps militaris.Total amino acid in Cordyceps militaris which is cultivated by natural
Bombyx mori medium and man need 8 kinds of amino acid contents are higher than those of wild Cordyceps militaris and the
other cultivated Cordyceps militaris.
Key words　Amino acid , Cordyceps militaris
(上接第 17页)
Abstract　The Esterase(EST) and Peroxidase (POD) isozymes of 5 specieses common Boletus in Yunnan were
studied.The results show:(1) the different specieses of Boletus not only have some common characters of EST or POD
isozymes , but each one has its unique characters of EST or POD isozymes.(2) the EST and POD isozymes of the body of
5 specieses Boletus are very stable.The EST isozymes or POD isozymes is an important stable indicator in molecular level ,
and can be used as an important indicator of classiffication of Boletus.
Key words　Isozymes , Esterase , Peroxidase , Boletus sp.
19第 18 卷　第 3期　　　　　　　中国食用菌　EDIBLE FUNGI OF CHINA