全 文 ：表 4　羊耳菊叶对供试菌种的抑制作用
菌种
不同羊耳菊根浓度实验结果
500
mg· ml-1
250
mg· ml-1
125
mg· ml-1
62.50
mg·ml-1
31.25
mg· ml-1
15.60
mg· ml-1
7.80
mg· ml-1
3.90
mg·ml-1
大肠埃希氏杆菌 + ++ ++++++ +++ +++ +++ +++金黄色葡萄球菌 - - - - + ++ +++ +++
白色念珠菌 - - - + ++ ++ +++ +++
铜绿假单胞菌 - - - - + ++ ++ +++
普通变形杆菌 - + ++ ++ +++ +++ +++ +++
鼠伤寒沙门氏杆菌 - - - + ++ +++ +++ +++
鸡沙门氏杆菌 - - + ++ ++ +++ +++ +++
枯草芽孢杆菌 - - - + ++ +++ +++ +++粪肠杆菌 - - + ++ +++ +++ +++ +++
甲型副伤寒沙门氏菌 - + ++ ++ +++ +++ +++ +++
　　“ -”:无菌生长 , “ +”:少数几个菌落生长 , “ ++”:菌落生长稀疏 , “ +++”:
菌落生长致密
羊耳菊根对 10种供试菌种都有抑制作用 ,抑制范围最广;羊
耳菊茎对 9种供试菌种有抑制作用;羊耳菊叶只对 8种供试菌种
有抑制作用 , 抑制范围略窄。总体来看 , 羊耳菊的抑菌谱比较广 ,
而比较各器官的抑菌作用效果依次为为:根 >茎 >叶。
从 10种供试菌种来看 ,羊耳菊根、茎、叶提取物对铜绿假单胞
菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用最强 ,其次是鼠伤寒杆菌 、枯草芽
孢杆菌 、粪肠球菌和鸡沙门氏菌 , 羊耳菊根 、茎 、叶对铜绿假单胞菌
的 MIC值分别为:15.63, 31.25, 62.5mg/ml;羊耳菊根、茎 、叶对金
黄色葡萄球菌的 MIC值分别为:15.63, 62.5, 62.5 mg/ml。羊耳菊
的各器官水提取物对真菌白色念珠菌也有较强的抑制活性 ,但对
大埃希氏杆菌 、甲型副伤寒沙门氏杆菌的抑制作用较弱。
4　讨论
由于抗生素的滥用 ,耐药性细菌引起的传染性疾病越来越来
严重 , 寻找新的抗菌药物已成为药物研究的热点。从少数民族本
土传统中草药中筛选新的抗菌药物是药物研究与开发的有效途
径 , 并已取得了进展 [ 2] 。 本实验使用的羊耳菊是湖南侗族人民
常用药物 , 主要用于治疗痢疾 、泄泻 、肝炎 、痔疮和疥癣 , 但国内 、
外文献均未对其抑菌作用研究报道。通过实验研究 ,进一步证实
了其民间用羊耳菊治疗细菌性感染的科学依据 ,并为开发新的抗
菌药物奠定了科学基础。
由于水分子极性高 ,是糖类 、糖蛋白、花青素 、酚类化合物 、生物
碱等许多植物次生代谢物的良好溶剂, 这些化合物可能是抗微生物
的活性物质 [ 10] 。羊耳菊根 、茎、叶水提取物具有良好的抗微生物作
用 ,也说明民间使用羊耳菊煎煮汁治疗感染性疾病的科学性。
本项研究使用药敏纸片扩散法和试管二倍稀释法分别测定
了微生物抗菌活性 ,显示了两种试验结果相关性。药敏纸片扩散
法结果取决于抗菌有效成分的溶解性和在琼脂培养基内的扩散
性 , 是一种半定量的研究方法 , 是初步筛选抗菌植物有效途径。
试管二倍稀释法则是一种精确测定抗菌活性的方法。
本实验研究结果表明 , 羊耳菊对金黄色葡萄球菌 、铜绿假单
胞菌 、白色念珠菌的抑制效果较强 , 但对大肠杆菌 、变形杆菌 、沙
门氏杆菌的抑菌效果稍弱。这说明羊耳菊在治疗由金黄色葡萄
球菌引起的肠炎 、铜绿假单胞菌引起的肺炎和白色念珠菌引起的
皮肤病等方面有较好的应用价值 , 但对由大肠杆菌 、沙门氏菌引
起的腹泻和肠道疾病则不适宜。
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收稿日期:2008-12-15;　修订日期:2009-07-31
基金项目:云南省社会发展科技计划项目(No.2007C083M)
作者简介:王元忠(1981-),男(傈僳族),云南兰坪人,现为中国农业科学院研究生院在读硕士研究生 ,主要从事植物化学及资源真菌开发与利用研究工作.
＊通讯作者简介:李　涛(1976-),男(汉族),云南罗平人 ,现任玉溪师范学院资源环境学院讲师 ,硕士学位 ,主要从事药用真菌教学与研究工作.
绒柄牛肝菌有效部位指纹图谱定性
和有效成分定量分析研究
王元忠1, 2 ,刘鸿高3 ,张金渝 1 ,李 涛4＊
(1.云南省农业科学院药用植物研究所 ,云南昆明　650223;　2.中国农业科学院研究生院 ,北京　100081;
3.云南农业大学 ,云南 昆明　650201;　4.玉溪师范学院资源环境学院 ,云南 玉溪　653100)
摘要:目的 建立绒柄牛肝菌的反相高效液相色谱定性和定量分析方法。方法 反相高效液相色谱(RP-HPLC)Planetsil
C18分析柱(150mm×4.6mm, 5 μm),流动相为甲醇 -水(15∶85),流速为 1.0ml· min-1 ,检测波长为 261nm, 柱温为室
温。对绒柄牛肝菌有效部位(甲醇提取部位)进行指纹图谱定性分析 , 对绒柄牛肝菌中的有效成分腺苷进行定量测定。
结果 在色谱条件下 , 11份不同绒柄牛肝菌中甲醇有效部位的 RP-HPLC指纹图谱中可检出 11个相对稳定的色谱峰 , 其
中确定出 9个共有峰作为定性鉴别的指标峰;绒柄牛肝菌中腺苷的含量为 0.146% ～ 0.493%。结论 绒柄牛肝菌有效部
位 RP-HPLC指纹图谱定性和有效成分定量分析方法具有较强的针对性和准确性 ,可用于绒柄牛肝菌及药用真菌的质
量控制。
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 12期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.12
关键词:绒柄牛肝菌;　腺苷;　指纹图谱;　反相高效液相色谱
中图分类号:R284.1　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2009)12-3074-03
　　绒柄牛肝菌 BoletustomentipesEarle, 又名大巴菌 、黑牛肝 、毛
脚牛肝菌 , 属于担子菌亚门(Basidiomyctina)、层菌纲(Hymenomy-
cetes)、伞菌目(Agaricase)、牛肝菌科(Boletaceae)中的一种 [ 1] 。
我国主要分布于云南 , 生于针阔叶林中地上 , 散生。 全世界已知
的牛肝菌属约有 1 024种或变种 ,我国已知的可食用的就有 199
种 [ 2] 。据文献记载 , 牛肝菌子实体富含蛋白质 、碳水化合物 、钙 、
磷 、铁 、核黄素等营养成分 , 含有人体必需的 8种氨基酸 , 还含有
腺嘌呤(adenine)、胆碱(choline)和腐胺(putrescine)等生物碱 ,可
治疗腰腿疼痛 、手足麻木 、四肢抽搐 , 还可治疗妇女白带症 [ 3] 。
牛肝菌子实体的水提物对小鼠肉瘤 S180的抑制率达 90%, 对艾氏
腹水癌的抑制率为 80%, 是中成药 “舒筋丸”的原料之一 [ 4] 。
众多研究表明 , 同一物种不同个体由于来源和产地不同 ,其
有效成分含量会有很大差异 [ 5 ～ 7] 。为了确保绒柄牛肝菌药理作
用 , 本研究建立了以绒柄牛肝菌有效部位为基础的 HPLC指纹图
谱定性分析和有效成分定量分析方法 , 并通过对 11个不同地区
的样品分析测定研究 ,确定了绒柄牛肝菌指纹图谱的共有峰和指
标峰以及腺苷的含量范围 ,为有效准确地定性和定量鉴别不同来
源的大型药用真菌提供一种分析方法。
1 　材料与方法
1.1 　仪器与试剂 ShimadzuLC-2010A高效液相色谱仪 , SPD
-M10Avp二极管阵列检测器 , CLASS-VP色谱工作站;色谱柱
为 Planetsil-C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm);色谱柱恒温装置。
超纯水器(Mil-QplusUSA);KQ2200E型超声波仪(舒美超声
仪);AE100S万分之一电子天平(梅特勒 -托利多)。
流动相甲醇为色谱纯(Fisher公司 美国);水为三重蒸馏水
(自制);对照品腺苷(中国药品生物制品检定所提供)。 其余所
用试剂均为分析纯。
1.2 　材料来源 见表 1。
表 1　实验材料
物种 编号 来源
D1 购买(玉溪大营街)
D2 购买(通海高达)
D3 购买(峨山化念)
D4 购买(楚雄姚安)
绒柄牛肝菌 D5 购买(楚雄南华)
D6 购买(元江青龙)
D7 购买(新平团结水库)
D8 购买(峨山玉林村)
D9 购买(新平水塘)
D10 购买(玉溪龙马山)
1.3　样品制备 腺苷标准溶液:精密称取经五氧化二磷减压干燥
至恒重的腺苷标准品 ,加甲醇制成每毫升含 20 μg的溶液 , 作为
对照品溶液。
取样品粉碎混匀 ,准确称取 0.500 0g试样(精确至 0.000 01
g)于心形瓶中 , 精密加 90%甲醇 10ml, 70℃水浴回流提取 30
min,放冷 , 再称定重量 , 用 90%甲醇补足减失的重量 , 摇匀 , 以
5 000 r/min离心 5 min。经 0.45 μm滤膜过滤后供液相色谱分
析用。
2　结果
2.1 　色谱条件 色谱柱为 Planetsil-C18色谱柱(4.6 mm×250mm, 5 μm)及其 C18保护柱。流动相 A为甲醇 、流动相 B为水;梯
度洗脱;流速 1 ml/min;检测波长 261 nm;柱温 30 ℃;进样量
10 μl。
2.2 　分析方法学考察结果
2.2.1　系统适应性实验 吸取对照品溶液 5 μl注入色谱仪 , 记
录色谱图 ,理论塔板数按腺苷计算在 5 000以上。在此条件下对
腺苷对照品溶液 ,供试品溶液进行测定 , 供试品溶液色谱图中与
对照品溶液色谱图相同位置具有吸收峰 ,且对照品测定无干扰。
2.2.2　线性关系考察 精密吸取 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16μl腺苷
对照品溶液 ,按上述条件分别进样 , 以腺苷浓度(mg/ml)为横坐
标 , 峰面积为纵坐标 , 得回归方程:Y=1.46 ×106 X-1.22 ×105 ,
r2 =0.999 69, (n= 7),表明腺苷在 1.2 ～ 96 μg/ml范围呈良好
的线性关系。
2.2.3　 仪器精密度和对照品溶液稳定性实验 精密吸取腺苷对
照品溶液 ,在上述条件分别进样 6次 , 计算腺苷的峰面积 , RSD=
0.678%, 表明仪器精密度良好。
精密吸取腺苷对照品溶液 ,于配制后的 0, 2, 4, 8, 14, 26, 48 h
测定 , 其峰面积 RSD=1.04%, 表明腺苷对照品溶液在 48 h内
稳定。
2.2.4　样品溶液的稳定性实验 取同一批号的样品 , 分别在 0,
2, 4, 8, 14, 26, 48 h检测指纹图谱 ,各色谱峰的相对保留时间无明
显变化 ,单峰面积占总峰面积 5%以上的色谱峰与参照峰的峰面
积比值也无显著变化。 RSD=1.454%,表明样品溶液在 48 h内
稳定;仪器精密度可靠 , 符合指纹图谱要求(国家药监局 , 2000)。
2.3 　指纹图谱的建立 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液
各 10μl,注入液相色谱仪中 , 记录 60 min色谱图即得。比较 11
批供试品的 HPLC图谱发现 , 其中有 6个色谱峰是 11批供试品
所共有的。计算图谱中各共有峰色谱峰相对于腺苷色谱峰(3号
峰)的相对保留时间(a=ti/t8)和相对峰面积值(AR=Ai/A总 ×
100%)。结果见表 2 ～ 3。
表 2　不同地区绒柄牛肝菌HPLC图谱主要峰相对保留时间比较
样品编号 主要峰相对保留时间 t/a峰 1 峰 2 峰 3 峰 4 峰 5 峰 6 峰 7 峰 8 峰 9 峰 10 峰 11
1 0.108 0.135 0.291 0.365 0.568 0.667 0.711 1 1.160 1.473 2.181
2 0.108 0.135 0.292 0.365 0.568 0.667 0.711 1 1.158 1.476 2.180
3 0.109 0 0.292 0.365 0.568 0.667 0.710 1 1.156 1.466 2.177
4 0.109 0 0.292 0 0.567 0.667 0.710 1 1.152 1.468 2.173
5 0.109 0.136 0.292 0 0.567 0.668 0.708 1 1.150 1.461 2.174
6 0.109 0 0.292 0.366 0.568 0.667 0.710 1 1.154 1.472 2.180
7 0.108 0.135 0.292 0 0.567 0.666 0.712 1 1.157 1.475 2.181
8 0.109 0.135 0.292 0 0.568 0.667 0.709 1 1.153 1.465 2.175
9 0.109 0.135 0.292 0.363 0.567 0.666 0.710 1 1.152 1.460 2.176
10 0.104 0 0.289 0 0.568 0.667 0.707 1 1.163 1.481 2.194
11 0.108 0.134 0.291 0.364 0.569 0.667 0.712 1 1.162 1.476 2.185
年 0.108 0.135 0.291 0.365 0.568 0.667 0.710 1 1.156 1.470 2.180
RSD(%) 1.36 0.43 0.38 0.28 0.093 0.086 0.195 0 0.359 0.460 0.2720
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.12 时珍国医国药 2009年第 20卷第 12期
表 3　不同地区绒柄牛肝菌HPLC图谱主要峰相对保留时间比较
样品
编号
主要峰相对保留时间t/a
峰 1 峰 2 峰 3 峰 4 峰 5 峰 6 峰 7 峰 8 峰 9 峰 10 峰 11
主要峰总面积 A总
(对偏差%)
1 5 634 991 4 216 1 672 13 305 8 990 5 451 31 983 22 226 25 872 73 956 193 206(2.92) (0.51) (2.18) (0.87) (6.37) (4.65) (2.82) (16.55) (11.50) (13.14) (38.28) (92.71)
2 23 697 4 017 4 708 2 717 15 257 10 621 3 102 30 589 14 030 11 900 49 698 170 336
(13.91) (2.36) (2.76) (1.60) (8.96) (6.24) (1.82) (17.96) (8.24) (6.99) (29.18) (69.90)
3 6 422 0 697 355 2 957 1 974 747 6 385 4 556 6 272 19 749 50 114
(12.91) (0) (1.39) (0.71) (5.90) (3.94) (1.49) (12.74) (9.09) (12.52) (39.41) (-50.01)
4 10 728 0 552 0 1 978 2 531 996 5 083 4 314 5 068 15 870 47 120
(22.77) (0) (1.17) (0) (4.20) (5.37) (2.11) (10.79) (9.16) (10.76) (33.68) (-53.00)
5 12 424 2 845 710 0 3 143 2 542 1 456 6 639 5 849 5 315 21 886 62 809
(19.78) (4.53) (1.13) (0) (5.00) (4.05) (2.32) (10.57) (9.31) (8.46) (34.85) (-37.35)
6 10 238 0 1 359 567 4 291 3 433 1 726 10 834 8 599 9 683 29 772 80 538
(12.71) (0) (1.73) (0.70) (5.33) (4.26) (2.14) (13.45) (10.68) (12.02) (36.97) (-19.67)
7 11 880 2 934 570 0 2 167 2 143 723 6 696 4 334 6 750 22 014 60 211
(19.73) (4.87) (0.95) (0) (3.60) (3.56) (1.20) (11.02) (7.20) (11.21) (36.56) (-39.94)
8 13 924 3 134 1 686 0 6 184 3 626 713 17 207 3 766 5 325 60 508 116 073
(12.00) (2.70) (1.45) (0) (5.33) (3.12) (0.61) (14.82) (3.24) (4.59) (52.13) (15.78)
9 30 929 2 302 1 914 767 9 905 7 788 2 138 31 716 10 896 11 596 41 710 151 661
(20.39) (1.52) (1.26) (0.51) (6.53) (5.14) (1.41) (20.91) (7.18) (7.65) (27.50) (51.27)
10 6 844 0 753 0 1 246 1 209 1 435 4 806 1 515 11 857 22 295 51 960(13.17) (0) (1.45) (0) (2.40) (2.33) (2.76) (9.25) (2.92) (7.65) (42.91) (-48.17)
11 20 244 396 52 510 691 5 203 5 946 2 548 13 023 6 902 20 748 37 021 118 801
(17.04) (3.34) (2.11) (0.58) (4.38) (5.01) (2.14) (10.96) (5.81) (17.46) (31.16) (18.50)
a总 100 257.2
　　相对峰面积 , AR=Ai/A总 ×100%,主要峰总面积 A总 =΢Ai, a总为 11个样品的平均总面积;相对偏差(%)=(A总 -a总)/a总 ×100%
2.4 　共有峰确定 在 11份绒柄牛肝菌供试样品的 HPLC图谱
中 , 由色谱峰相对保留时间(a)的稳定性(相对偏差小于 3%),可
以确定的共有峰有 9个 , 其相对保留时间从 0.108 ～ 2.180;同时
分别计算 11个样本主要峰的总面积(A总 )、平均总面积(a总 )以
及总面积的相对偏差 ,舍去总面积相对偏差小于 -40%的(样品
编号为 3, 4, 10), 最后其余样本确定绒布牛肝菌共有峰 1, 3, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11号峰 ,作为绒柄牛肝菌指纹图谱定性分析的指标峰。
用此定性指标鉴定 11样本 ,结果所有样本均为绒柄牛肝菌 。
2.5　绒柄牛肝菌中腺苷含量测定 按 “ 1.3”方法处理 , 进样 5 μl
分析 , 测得峰面积积分值 , 计算绒柄牛肝菌中腺苷含量。 结果见
表 4。
3 　讨论
RP-HPLC法虽然是一种有效的分离分析方法 ,但由于绒柄
牛肝菌成分复杂 , 性质各异 ,即使使用梯度洗脱也很难获得理想
的分离结果。使用梯度洗脱增加了实验操作和重现性难度 ,而且
难以突出地反映药用真菌与主要药理作用相关的有效成分群 ,从
而在质量控制方面无法有效地做到 “纲举目张” 。本实验应用反
相高效液相色谱技术 , 建立了以绒柄牛肝菌指纹图谱定性和有效
成分定量的分析方法 。这种方法是在物质基础上 ,以绒柄牛肝菌
为质控对象 , 并利用现代仪器分析技术同时进行定性和定量分
析 , 增强了方法的有效性和针对性。实验中采用等度洗脱方式 ,
色谱条件容易控制 , 可保证分析结果的重复性。
表 4　不同地区绒柄牛肝菌中腺苷含量测定结果 %
样品编号 腺 苷
1 0.493
2 0.327
3 0.146
4 0.158
5 0.167
6 0.211
7 0.233
8 0.416
9 0.295
10 0.154
11 0.257
在色谱条件下 , 绒柄牛肝菌的 HPLC图谱中可以检出 11个
色谱峰。通过对 11份绒柄牛肝菌供试样品的 HPLC图谱中主要
峰相对保留时间(a)分析 , 其相对误差(RSD)均小于 3%, 表明主
要色谱峰在 HPLC图谱中的相对位置是稳定的 , 可以作为定性鉴
别的指标参数;同时 ,测定各样本主要峰的总面积(A总),以反映
在不同样本中的绝对含量 ,而各总面积的相对偏差则可以比较在
不同样本中的相对含量 , 舍去相对含量较小的样本 , 由其余样本
确定了绒柄牛肝菌定性鉴别的指标峰有 9个 ,相对保留时间分别
为 0.108, 0.291, 0.568, 0.667, 0.710, 1, 1.156, 1.470, 2.180, 将其
用于对 11个样本的定性鉴别。结果表明 , 虽然 11个样本中腺苷
在含量上差别很大 ,但均含有 9个指标峰 , 故认为它们是绒柄牛
肝菌 。
本研究选用腺苷作为标准品 , 据文献资料报道 , 腺苷在大型
真菌中的相对含量较为适中;腺苷为辅酶类药物 , 它能参与体内
能量代谢及蛋白质的合成 , 具有提高各种酶(特别是辅酶 A)的
活性及改善机体代谢作用 , 因此是生物体生长代谢所必须 、普遍
存在的物质 ,以其作为标准品具有可比性。
在本实验中 ,我们将 11个样本在相同实验条件下 , 以腺苷为
对照品 ,通过 HPLC检测出的腺苷成分含量在 0.146% ～ 0.493%
之间 。表明不同生长环境和贮藏时间对有效成分含量影响很大 ,
绒柄牛肝菌质量须严格控制。在有效成分不完全明确的前提下 ,
制定药用真菌的指纹图谱 , 对于有效地控制其质量 , 具有重要
意义 。
由于大型药用真菌所含化学成分多而复杂 , 其来源品种 、产
地 、生长过程 、采收时间 、储藏条件等诸多因素对质量都有一定影
响。大型药用真菌质量的传统评价方法已经不能满足质量评价
的需要 , 因此采用现代的科学技术建立大型药用真菌定性定量标
准已经非常必要和迫切。
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 12期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.12