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香叶木苷的血浆蛋白结合率研究



全 文 :第 24卷 第 1期
2008年 2月   
哈 尔 滨 商 业 大 学 学 报(自然科学版)
JournalofHarbinUniversityofCommerce(NaturalSciencesEdition)  
Vol.24No.1
Feb.2008
收稿日期:2007-06-21.
基金项目:黑龙江省科技攻关项目(GC03C402-1).
作者简介:李艳凤(1979-),女 , 博士研究生 , 研究方向:中药药效物质基础研究;马英丽 ,女 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向:中药药理.
香叶木苷的血浆蛋白结合率研究
李艳凤 ,马 超 ,马英丽
(黑龙江中医药大学 药学院 , 哈尔滨 150040)
摘 要:研究香叶木苷的血浆蛋白结合率.以体外方式 , 用平衡透析法模拟香叶木苷在大鼠体内与血
浆蛋白结合的过程 , 并以高效液相色谱法测定香叶木苷在透析袋内血浆中的药物质量浓度与透析袋
外缓冲液中的质量浓度 , 计算血浆蛋白结合率.香叶木苷在血浆中药物质量浓度为 1 ~ 90 μg/mL范
围内 , 其与大鼠血浆蛋白的结合率范围为 29.83% ~ 32.56%, 波动较小 ,结果可靠.香叶木苷属于低
血浆蛋白结合率药物 , 大部分药物分子以游离形式发挥药效.
关键词:香叶木苷;平衡透析法;血浆蛋白结合率;高效液相色谱
中图分类号:R284.2     文献标识码:A     文章编号:1672-0946(2008)01-0007-05
Studyonplasmaproteinbindingrateofdiosmin
LIYan-feng, MAChao, MAYing-li
(SchoolofPharmacy, HeilongjiangUniversityofTraditionalChineseMedicine, Harbin150040, China)
Abstract:Tostudytheplasmaproteinbindingrateofdiosmin.Withexternalmanner, this
paperusesequilibriumdialysismethodtoimitatethebindingprocessbetweendiosminand
plasmaprotein, determinestheconcentrationofdiosmininandoutofthedialysismembrane
andthebindingrate.Theplasmaproteinbindingrateofdiosminis29.83% ~ 32.56% with
theconcentrationofdiosmininrat splasmarangingfrom1μg/mLto90μg/mL, thefluctu-
ationisrelativelysmalandtheresultisreliable.Diosminisakindoflowplasmaprotein
bindingratedrug, andmostofthedrugmoleculesactonbodywithfreetype.
Keywords:diosmin;dialysisequilibrium;plasmaproteinbindingrate;HPLC
  香叶木苷(Diosmin)即 3, 5, 7-三羟基 -4 , -
甲氧基黄酮 -7-芸香糖苷 ,是作者从中药篷子菜
中首次分离得到的黄酮苷类化合物 ,该药能全面作
用于静脉 ,微循环和淋巴 3个血管回输系统 ,具有
增加静脉张力 ,改善静脉通透性 ,改善微循环的作
用 [ 1 ~ 3] ,从而治疗肢体水肿及老年急性痔发作等微
循环疾病.在国内已有多篇文献临床报道[ 4, 5] ,疗
效肯定 ,应用前景广阔.本文在已完成其药代动力
学研究的基础上 ,用平衡透析法结合高效液相色谱
测定了其血浆蛋白结合率 ,证明香叶木苷属于低结
合率药物.测定方法简便易行 ,结果令人满意.为进
一步研究香叶木苷与人血浆蛋白结合率奠定了方
法学基础 ,对临床合理用药具有一定的参考价值.
1 实验材料
1.1 仪器
LC— 2010A液相色谱仪 (日本岛津公司),
SPD— 10A紫外检测器 , CLASS—VP工作站 , 800
型电动离心机 , XW— 80C涡旋混合器 , UV— 2201
紫外 -可见分光光度计(日本岛津公司), Visking
半透膜(德国).
1.2 试剂与药品
香叶木苷对照品及原料药(购自美国 SIGMA
公司 ,质量分数 ≥98.5%),苯甲酸(内标物 ,购自
哈尔滨生化试剂有限公司 ,质量分数 ≥99.5%),
甲醇(色谱纯), 水(娃哈哈纯净水), 醋酸 (分析
纯).磷酸二氢钠 ,磷酸氢二钠 ,氯化钠(分析纯).
1.3 动物
Wistar大鼠 , 180 ~ 220 g,雌雄并用 ,由黑龙江
中医药大学实验动物中心提供(合格证号:黑动字
第 P00101006).
2 试液配制
2.1 缓冲液的配制
将浓度为 0.067 mol/L的磷酸氢二钠溶液和
浓度为 0.067 mol/L磷酸二氢钠溶液按 4∶1体积
混合.加适量氯化钠 ,使氯化钠浓度为 0.15mol/L,
并用磷酸调 pH值为 7.4,得磷酸盐缓冲液.
2.2 香叶木苷标准储备液的配制
取香叶木苷对照品适量 ,精密称定 ,加二甲亚
砜溶解并稀释至刻度 ,配成香叶木苷含量为 1 mg/
mL的标准储备液 ,经倍数稀释配成 1.5、5、25、75、
125、250、500、800、1 000 μg/mL共 9个质量浓度的
香叶木苷对照品溶液.
2.3 苯甲酸标准储备液的配制
取苯甲酸 15 mg至 250mL容量瓶加二甲亚砜
溶解并稀释至刻度 ,得 60 μg/mL苯甲酸标准储备
液.
3 透析内液(血浆)中香叶木苷含量
测定
3.1 色谱条件
ODSC18柱(日本岛津公司)流动相为甲醇 -
水 -醋酸 (47∶53∶5),检测波长 275 nm,流速 0.8
mL/min,灵敏度为 0.2AUFS.
3.2 透析内液(血浆)中样品的处理与测定
取大鼠血浆 500μL,加入 60 μg/mL的苯甲酸
150μL, 加甲醇 2 mL沉淀血浆蛋白 , 涡旋混合
30s,以 4 000r/min离心 10 min,吸取上清液过微
孔滤膜(0.45μm),取 20 μL进样进行高效液相分
析.
3.3 色谱系统适应性试验
在上述色谱条件下 ,香叶木苷与苯甲酸分离效
果较好 ,分离度 R=2.76,二者保留时间分别为 6.74
min和 8.57min,且与血浆中内源性物质不干扰 ,拖
尾因子 T=1.03,理论塔板数不小于 4 000,见图 1.
图 1 透析内液(血浆)色谱系统适应性试验
3.4 线性范围和灵敏度
在 500μL空白血浆中加入 50 μL一系列质量
浓度的对照品溶液 ,使相应的血浆中所含香叶木苷
的质量浓度为 0.15、0.5、2.5、7.5、 12.5、 25、50、
80、100 μg/mL,按 “透析内液样品处理 ”项下操作 ,
以对照品和内标物峰面积比为纵坐标(Y),香叶木
·8· 哈 尔 滨 商 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )           第 24卷
苷血药质量浓度为横坐标(C),作回归计算 ,得到
方程 Y=3.07 ×10-3C+5.33×10-3 , (权重系数
为 1 /C2 , R=0.993 5),样品在 0.15 ~ 100 μg/mL
范围内线性关系良好.最低检测限为 0.1 μg/mL
(S/N=3).
3.5 方法回收率
取空白血浆 500 μL,分别加入低 ,中 ,高 3个
质量浓度的对照品溶液 50 μL,使相应的血浆质量
浓度为 0.5、12.5、80 μg/mL,每个质量浓度平行作
6份 ,按 “透析内液样品处理 ”项下操作 [ 6] ,进行高
效液相分析 ,以当日的标准曲线计算香叶木苷实测
值 ,回收率 =C实测 /C理论 ×100%.结果低 、中 、高 3
个质量浓度的方法回收率分别为 103.83%、
104.91%、97.03%,其 RSD值分别为 7.23%、 8.
45%、7.59%.
3.6 精密度
日内精密度 取空白血浆 500 μL,按血浆药物
质量浓度配成 0.5 、12.5 、80 μg/mL3种血浆样
品 ,每个质量浓度平行作 6份 ,按 “透析内液样品
处理”项下操作 ,每个样品进样 3次 ,在一天内用
同台仪器和当日的标准曲线测定并计算日内精密
度结果低 、中 、高 3种质量浓度的 RSD值分别为
6.32%, 8.45%, 6.58%.
日间精密度 同上法制备血浆样品 ,每种质量
浓度 6份 ,每份进样 3次 ,连续 3 d用同台仪器及
当日标准曲线进行测定并求算日间精密度 ,结果
低 、中 、高 3种质量浓度的 RSD值分别为 9.65%、
7.56%、7.96% .
3.7 稳定性
1)短期稳定性
取空白血浆 500 μL,按血浆药物质量浓度配
成 0.5 、12.5 、80 μg/mL3种血浆样品 ,每个质量
浓度作 1份 ,样品于室温下保存 ,分别于 0、4、8、
12、16、20、24 h按 “透析内液样品处理 ”项下操作 ,
取 20 μL进样行 HPLC分析.以当日标准曲线计
算 ,得 3个质量浓度的 RSD值分别为 5.88%、
8.56%、7.45%,表明该生物样品在室温下 24 h内
稳定.
2)长期稳定性
同上法制备低 、中 、高 3个质量浓度的血浆样
品 ,每个质量浓度作 1份 ,样品于 -20℃保存 ,分别
于 0、1、2、3、4、5 d取出解冻 ,按 “透析内液样品处
理 ”项下操作 ,取 20 μL进行高效液相分析.以当
日标准曲线计算 ,得 3个质量浓度的 RSD值分别
为 9.32%, 10.36%, 8.45%, 表明该生物样品在
-20 ℃冷藏稳定.
3.8 提取回收率
取空白血浆 500 μL,按血浆药物质量浓度配
成 0.5 、12.5 、80μg/mL3种血浆样品 ,按 “透析内
液样品处理 ”项下操作 ,取 20 μL进样行 HPLC分
析.记录 R测 =A药 /A内 , 另取空白血浆 500μL,不加
香叶木苷药物 , 按 “透析内液样品处理 ”项下操作 ,
吸取全部离心所得上清液分别加入 5、 125、 800
μg/mL3个质量浓度的香叶木苷溶液各 50 μL,混
合均匀 ,进样 20 μL行 HPLC分析 ,记录 R真 =A药′/
A内′,计算提取回收率 =R测 /R真.结果低 、中 、高 3个
质量浓度血浆样品的提取回收率分别为 64.25%、
72.13%、71.56%.
4 透析外液(缓冲液)中样品的处理
与测定
4.1 色谱条件
同 3.1项.
4.2 透析外液(缓冲液)中样品的处理与测定
取透析外液 1 mL加入 60 μg/mL苯甲酸溶液
150 μL, 涡旋混合 30 s, 于 60℃水浴挥干 , 用
200μL甲醇溶解样品 , 20μL进行高效液相分析.
4.3 色谱系统适应性试验
在上述色谱条件下 ,香叶木苷与苯甲酸效果较
好 ,分离度 R=2.76, 二者保留时间分别为
6.63 min和 8.46 min,且与血浆中内源性物质不干
扰 ,拖尾因子 T香叶木苷 =1.03, T苯甲酸 =1.04,理论塔
板数不小于 4 000,见图 2.
4.4 线性范围和灵敏度
取透析外液 1 mL,加入香叶木苷系列溶液
100μL,使相应的透析外液香叶木苷的质量浓度为
0.15、0.5、2.5、7.5、12.5、25、50、80、100μg/mL,按
“4.2透析外液(缓冲液)中样品的处理与测定 ”项
下处理 , 以对照品和内标物峰面积比为纵坐标
(Y),香叶木苷血药质量浓度为横坐标 (C),作回
归计算 ,得到方程 Y=3.26×10-3C+9.21×10-3 ,
(权重系数为 1 /C2 , R=0.999 1),样品在 0.15 ~
100 μg/mL范围内线性关系良好.最低检测限为
0.1 μg/mL(S/N=3).
4.5 方法回收率
取透析外液 1mL, 分别加入低 ,中 ,高 3个质量
浓度的对照品溶液 100 μL, 使相应的透析外液香叶
木苷的质量浓度为 0.5、12.5、80 μg/mL,每个质量
浓度平行作 6份 ,按 “4.2透析外液(缓冲液)中样品
的处理与测定”项下处理 , 进样行 HPLC分析 ,以当
·9·第 1期             李艳凤 ,等:香叶木苷的血浆蛋白结合率研究
日的标准曲线计算香叶木苷实测值 ,回收率 =C实测 /
C理论 ×100%[ 6] .结果低 、中 、高 3个质量浓度的方法
回收率分别为 99.63%、104.53%、105.23%,其 RSD
值分别为 2.15%、3.56%、7.59%.
图 2 透析外液(缓冲液)色谱系统适应性试验
4.6 精密度
日内精密度 取透析外液 1 mL, 加入低 ,中 ,
高 3个质量浓度的对照品溶液 100 μL, 使相应的
透析外液香叶木苷的质量浓度为 0.5、 12.5、
80 μg/mL,每个质量浓度平行作 6份 ,按 “ 4.2透析
外液(缓冲液)中样品的处理与测定 ”项下处理 ,
进样行高效液相分析 ,每个样品进样 3次 ,在一天
内用同台仪器和当日的标准曲线测定并计算日内
精密度.结果低 、中 、高 3种质量浓度的 RSD值分
别为3.84%、6.25%、5.24%.
间精密度 同上法制备透析外液样品 , 进行
高效液相分析 ,每个样品进样 3次 ,在一天内用同
台仪器和当日的标准曲线测定并计算日内精密度.
结果 ,低 、中 、高 3种质量浓度的 RSD值分别为
6.21%、6.24%、5.32%.
4.7 稳定性
1)短期稳定性 取透析外液 1 mL, 加入低 ,
中 ,高三个质量浓度的对照品溶液 100μL, 使相应
的透析外液香叶木苷的质量浓度为 0.5、12.5、
80 μg/mL,每个质量浓度作 1份 ,样品于室温下保
存 ,分别于 0、4、8、12、16、20、24h按 “ 4.2透析外液
(缓冲液)中样品处理 ”项下操作 ,取 20 μL进样进
行高效液相分析.以当日标准曲线计算 ,得 3个质
量浓度的 RSD值分别为 7.68%、8.56%、6.23%,
表明该样品在室温下 24 h内稳定.
2)长期稳定性 同上法制备低 、中 、高 3个质
量浓度的透析外液样品 , 每个质量浓度 1份 ,样品
于 -20 ℃,分别于 0、1、2、3、 4、5天取出解冻 ,按
“透析内液样品处理 ”项下操作 ,取 20 μL进行高
效液相分析.以当日标准曲线计算 ,得 3个质量浓
度的 RSD值分别为 9.32%、10.36%、8.45%,表明
该样品在 -20 ℃冷藏稳定.
4.8 提取回收率
取透析外液 1 mL, 加入低 、中 、高 3个质量浓
度的对照品溶液 100 μL, 使相应的透析外液香叶
木苷的质量浓度为 0.5、12.5、 80 μg/mL,按 “ 4.2
透析外液 (缓冲液 )中样品处理 ”项下操作 , 取
20μL进样进行高效液相分析.记录 R测 =A药 /A内 ,
另取透析外液 1 mL, 不加香叶木苷药物 , 按 “ 4.2
透析外液(缓冲液)中样品处理”项下操作 ,水浴蒸
干后的样品加入 5、125、800 μg/mL的香叶木苷溶
液100 μL,继续水浴蒸干后 ,加入 200 μL甲醇溶解
样品 , 20 μL进行高效液相分析.记录 R真 =A药′/
A内′,计算提取回收率 =R测 /R真.结果低 、中 、高 3个
质量浓度血浆样品的提取回收率分别为 78.23%、
75.63%、81.46%.
5 血浆蛋白结合率的实验与评价
5.1 实验方法
采用平衡透析法.将处理后的透析袋一端折叠
·10· 哈 尔 滨 商 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )           第 24卷
用线结扎 ,将 1mL空白血浆加入上述透析袋 ,放一
粒玻璃珠以保证透析袋在透析液中保持垂直 ,透析
袋内留一小空气泡 ,将透析袋另一端扎紧 ,使其悬
浮于盛有 10mL透析外液的试管中 ,透析外液的质
量浓度分别为 0.5、12.5、80μg/mL,调节透析袋内
外液面 ,使其保持同一水平 ,并应避免透析袋靠试
管壁.盖严玻璃塞 ,将该试管置于 37℃恒温箱直到
药物扩散达到平衡.透析结束后 ,用 10%的高氯酸
溶液检查透析外液是否有蛋白漏出 ,有漏出者该样
品作废.分别测定透析袋内药物质量浓度 A(总质
量浓度)和透析外液药物质量浓度 B(游离药物质
量浓度),根据公式 F=A-B/A计算血浆蛋白结合
率 ,结果低 、中 、高 3个质量浓度的血浆蛋白结合率
分别为 29.83%、31.62%、32.56%.经 t检验三者
无显著性差异.
5.2 平衡时间的考察
在透析袋内以磷酸缓冲液代替血浆 ,透析外液
的质量浓度分别为 0.5、12.5、80 μg/mL,按 “5.1”及
“4.2”项下方法测定透析袋内外香叶木苷质量浓度 ,
以当日标准曲线计算透析袋内外香叶木苷质量浓
度 ,以二者质量浓度比值确定平衡时间 ,见表 1.
表 1 平衡时间考察
质量浓度(透析外液)
/(μg· mL-1)
透析袋 内外质 量浓度 比
8h 12h 16h 8 h 20h 24h 28 h 32h 36 h
0.5 0.65 0.71 0.73 0.85 0.89 0.97 0.99 0.99 1.02
12.5 0.56 0.74 0.86 0.91 0.95 0.99 0.99 0.99 0.99
80 0.46 0.72 0.89 0.93 0.95 0.96 0.97 0.98 0.98
5.3 药物在透析膜上吸附的考察
在透析袋内加入 1 mL(设体积为 V2)空白磷酸
盐缓冲液 ,在透析袋外加入已知质量浓度 CA(分别
为 0.5、12.5、80 μg/mL)的磷酸缓冲液 10 mL(设体
积为 V1),透析平衡 36h,测定透析袋外(或袋内)的
药物质量浓度 CE,透析膜对药物的吸附率 X由下式
计算 , X=CA×V1 -CE×(V1 +V2)/ CA×V1 ,由表 2
可见透析袋对药物吸附为微量 ,可忽略不计.
表 2 透析膜对药物吸附的考察
CA
/(μg· mL-1)
V1
/mL
CE
/(μg· mL-1)
(V1 +V2)
/mL
吸附率
/%
0.5 10 0.435 11 4.33
12.5 10 10.83 11 4.72
80 10 69.09 11 5.01
6 讨 论
1)截留分子质量是选择透析袋的主要依据 ,
血浆中主要有 3种蛋白质:白蛋白 (分子质量
65 000),酸性糖蛋白 (分子质量 44 000),脂蛋白
(分子质量 200 000 ~ 3 400 000),本实验开始选择
截留分子质量为 5 000的半透膜 ,但血浆中内源性
物质大量进入透析外液 ,造成色谱图基线不平;另
一方面这种现象又表明透析内液血浆成分将出现
较大变化 ,可能会影响到蛋白结合过程 ,故本实验
最后选择截留分子质量为 8 000 ~ 10 000的 Visk-
ing透析膜 ,效果较好.
2)吸附药物是透析膜的普遍存在的现象 ,若
吸附量过大时应考虑选择其他型号的透析膜.本实
验透析膜吸附率范围为 4.33% ~ 5.01%,吸附量
极小 ,所造成的药物质量浓度变化仍在标准曲线测
定范围内 ,另外 ,实验已证明蛋白结合率随药物质
量浓度变化基本保持稳定 ,故透析膜对药物的吸附
可忽略不计.
3)本实验设定温度为 37 ℃意在模拟体温 ,但
由于平衡时间 36 h较长 ,加之血浆中蛋白质成分
丰富 ,使染菌概率增加.本实验进行前先将透析袋
与试管用 0.1%尼泊金溶液浸泡 ,以防血浆与缓冲
液细菌繁殖.
4)实验结果 ,香叶木苷血浆蛋白的结合率范
围为 29.83% ~ 32.56%,属于低结合率药物 ,即从
结合型向游离型转化不需太长时间 ,而只有游离型
药物才能经肾小球滤过 ,排泄出体外.根据文献
[ 6]报道 ,香叶木苷在体内低 、中 、高 3种血药质量
浓度的半衰期分别为(74.29±2.81)min, (78.46
±2.52)min, (76.91 ±17.8)min,属快处置型药
物 ,推测与其低血浆蛋白结合率有直接关系.
5)文献 [ 6]报道 ,香叶木苷在低 、中 、高 3种给
药剂量下代谢过程呈线性 ,即 AUC值与剂量呈正
比关系.本实验证明香叶木苷在低 、中 、高 3种血药
质量浓度的血浆蛋白结合率呈现非质量浓度依赖
性 ,即药物在治疗质量浓度范围内未出现蛋白结合
的饱和现象.若药物代谢呈非线性 ,可能与以下几
方面有关:可饱和血浆蛋白结合过程;可饱和的酶
代谢过程;可饱和的载体转运过程及代谢产物抑
制.本实验根据蛋白结合过程佐证了文献报道可靠
性 ,其他方面尚有待研究.
6)一般认为药物的药理效应主要与药物的游
离型有关 [ 7] ,高结合率的药物只有少部分游离药
物发挥药效 ,而一旦由于病理或其他因素使结合率
发生变化 ,将造成游离型药物比例的大幅增加 ,甚
至产生不良反应.本实验证明香叶木苷属于低结合
率药物 ,大部分药物以游离形式存在发挥药效 ,并
提示其为一种治疗窗较宽的药物 ,这一点从临床用
药情况[ 6]可得到证明.
(下转第 15页)
·11·第 1期             李艳凤 ,等:香叶木苷的血浆蛋白结合率研究
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·15·第 1期           李文兰 ,等:HPLC法测定金匮肾气丸中马钱苷 、芍药苷的含量