全 文 ：基金项目 沈阳农业大学青年教师科研基金资助。
作者简介 冯颖(1975-),女,辽宁朝阳人,在读博士,讲师,从事天然产
物与功能性食品研究。*通讯作者。
收稿日期 2006!02!17
无梗五加为五加科五加属植物,长期以来,在东北地区,
将无梗五加当作刺五加药用,未见不良反应报道。为扩大药
用资源,无梗五加已引起国内外学者的浓厚兴趣[1]。
黄酮类化合物是一类具有重要生理功能的化合物,它
具有消除自由基、扩张血管、改善微循环、降血脂、降胆固醇
及防治心脑血管疾病的作用。为了分离纯化黄酮类化合物,
有时需要采用柱层析、大孔树脂吸附分离、凝胶层析技术
等。其中大孔吸附树脂法是近些年发展起来的一种非常有
效的纯化方法,它具有物理化学稳定性高,吸附选择性好,
富集效果好,不受无机物存在的影响,再生简便,解吸条件
温和,使用周期长,宜于构成闭路循环,节省费用等优点。因
此近年来,树脂吸附法得到长足的发展,广泛用于天然产物
的分离纯化。
试验选用粉碎的无梗五加果实为原料,经回流提取后,
用大孔吸附树脂对其分离纯化,旨在为无梗五加果实资源
的开发利用及黄酮的工业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 无梗五加果;石油醚(沸程60～90℃);浓度95%
乙醇,无水乙醇,氢氧化钠,亚硝酸钠,硝酸铝,盐酸,正丁
醇,乙酸,双蒸水;大孔吸附树脂 AB!8、S!8、D4020、NKA!9
(天 津 南 开 化 工 厂 生 产);HPD100、HPD450、HPD600、
HPD700、HPD750(沧州宝恩化工厂生产)。
1.2 试验方法
1.2.1 树脂的预处理。HPD100、450、600、700、750:先水洗
去细小树脂及破碎树脂;然后用乙醇浸泡4h,去除浸液,至
洗涤液加水稀释不浑浊;再用蒸馏水洗涤至无醇味,用蒸馏
水浸泡备用。
AB!8、NKA!9、S!8、D4020:先用乙醇浸泡 24h,放出浸
液至洗涤液加水稀释不浑浊,水洗至无醇味,然后用浓度5%
HCl浸泡 3h后水洗至中性,再用浓度 2%NaOH浸泡 3h
后水洗至中性,用蒸馏水浸泡备用。
1.2.2 黄酮供试液的制备。无梗五加果实粉末,石油醚脱脂
后,用浓度50%乙醇在90℃下回流提取4h得到提取液,
浓缩后备用。
1.2.3 大孔吸附树脂纯化分离无梗五加果总黄酮工艺的确定。
1.2.3.1 大孔吸附树脂的筛选。分别称取 1.0g8种不同树
脂于8个三角瓶中,加入浓度为 0.5mg/ml黄酮溶液 20ml
在恒温振荡器中振荡24h充分吸附后,取吸附后的溶液测
定其吸光度,计算各种树脂的吸附率;然后将过滤后的树脂
加入 50ml体积分数 95%乙醇在同样条件下振荡 24h解
吸,测定解吸液吸光度,计算其解吸率。从中挑选吸附率和
解吸率都较高的树脂进行静态吸附动力学特性测定,进一
步筛选出最佳树脂。
1.2.3.2 大孔吸附树脂的静态吸附动力学特性测定。准确
称取大孔吸附树脂 1.0g装入三角瓶中,加入黄酮溶液 20
ml,置恒温水浴(25℃)振荡器上进行吸附,在 5h内,每小
时各取0.5ml,测其黄酮含量,绘制静态吸附动力学曲线。
1.2.3.3 大孔吸附树脂对黄酮的静态吸附与解吸试验。分
别称取1.0gHPD600树脂于5个三角瓶中,加入一定浓度、
一定pH值的黄酮供试液各20ml,恒温水浴振荡器上振荡
吸附,取吸附后的溶液测定吸光度,计算不同黄酮供试液浓
度、酸碱条件下树脂对黄酮的吸附率,以确定黄酮供试液的
最佳上柱浓度和 pH值。向吸附后的树脂中加入不同体积
分数的乙醇15ml进行解吸,测定解吸液吸光度,计算不同
体积分数乙醇对黄酮的解吸率,以确定最佳解吸液体积分数。
1.2.3.4 大孔吸附树脂对黄酮的动态吸附与解吸试验。称取
10gHPD600大孔吸附树脂装柱,上样,控制流速为1ml/min
进行吸附,对流出液进行收集(每 5ml收集 1管),测定其
吸光度,根据回归方程计算流出液黄酮浓度,绘制树脂对黄
酮的吸附透过曲线,确定黄酮上样液与树脂用量的最佳比
例。用体积分数70%的乙醇对吸附后的树脂进行解吸,对
流出液进行收集(每 8ml收集 1管),测定其吸光度,根据
回归方程计算流出液中黄酮的浓度,绘制解吸曲线,确定解
吸液的最佳用量。
1.3 测定方法
1.3.1 黄酮的测定。取黄酮溶液适量于10ml容量瓶中,加
入 0.3mlNaNO2摇匀后放置 6min,再加入 0.3mlAl(NO3)3
摇匀后放置6min,最后加4mlNaOH用浓度30%乙醇定容
大孔树脂纯化无梗五加果总黄酮工艺研究
冯颖 1,王建国 2,孟宪军 1*,钟彦 1 (1.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳110161;2.辽宁省农业科学院食品与加工所,辽宁沈阳110000)
摘要 对大孔吸附树脂纯化分离无梗五加果总黄酮的工艺进行了研究。试验表明:HPD600树脂对无梗五加果总黄酮具有较好的吸
附和解吸效果,最佳纯化工艺条件为:上样液pH=5.06,浓度为0.5mg/ml,结果与树脂用量比为10∶1,控制流速为1ml/min,以64ml体
积分数为70%的乙醇解吸,最终得到的黄酮纯度可达86.79%。
关键词:无梗五加;黄酮;净化;大孔吸附树脂
中图分类号 O636.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2006)10-2169-03
StudyonthePurificationofFlavonoidsfromFruitofAcanthopanaxSessiliflorusSeemwithMacroporousAbsorbingResin
FENGYingetal(FoodColege,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang,Liaoning110161)
Abstract Inthisexperiment,themacroporousabsorbingresinisusedtopurifyandseparateflavonoids.Theexperimentalresultsshowed:
HPD600resinhadbeterabsorbingandconciliatingability.ThepHandtheconcentrationoftheoriginalsolutionwas5.06and0.5mg/ml;the
conciliatingeluentwas70%ethanolandthevelocityofflowwas1ml/min.Inthiscondition,thepurityofflavonoidswas86.79%。
Keywords AcanthopanaxSessiliflorusSeem;Flavonoids;Purification;Macroporousabsorbingresin
安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2006,34(10):2169-2171 责任编辑 曹淑华 责任校对 曹淑华
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2006.10.077
至刻度,摇匀,放置 10min使其充分显色后在 500nm下测
定吸光度。根据回归方程Y=1.185X+0.001(其中Y为吸光
度,X为黄酮含量)计算黄酮浓度。
1.3.2 吸附率和解吸率的测定 [2]。
2 结果与分析
2.1 大孔吸附树脂的筛选结果 (表1) 由表1可以看出:
AB!8、HPD600不仅具有较大的吸附率,而且具有较高的解
吸率。可通过吸附动力学的测定,对二者进行进一步筛选。
2.2 大孔吸附树脂的静态吸附动力学特性测定 AB!8、
HPD600静态吸附动力学曲线见图1。从图1可以看出,2种
树脂对无梗五加果黄酮的吸附均为快速平衡型,起始阶段
吸附量都较大在4h内基本接近达到平衡。但从总体上来
看,HPD600吸附率始终优于AB!8。因此,试验选择HPD600
进行大孔吸附树脂对黄酮的静态吸附与解吸试验,和大孔
吸附树脂对黄酮的动态吸附与解吸试验。
2.3 大孔吸附树脂对黄酮的静态吸附与解吸试验
2.3.1 黄酮上柱液浓度的确定。黄酮供试液浓度对树脂吸
附效果的影响见图 2。图 2表明:当黄酮上柱液浓度为
0.501mg/ml时,HPD600树脂对黄酮的吸附率最高,达到
78.84%,即浓度为0.5mg/ml附近时更有利于吸附。
2.3.2 黄酮上柱液pH值的确定。黄酮供试液酸碱度对树脂
吸附效果的影响见图3。由图3可以看出,pH值为5.06(原
液)时树脂对黄酮的吸附率较高,这是由于黄酮类化合物为
多羟基酚类,呈弱酸性。因而,要达到较好的吸附效果,必须
在弱酸或酸性条件下吸附。该试验中黄酮上柱液原液 pH
值即为5.06,上柱前不再需要调整。
2.3.3 解吸液体积分数的确定。解吸液体积分数对树脂解
吸效果的影响见图4。由图4可以看出,用体积分数为70%
的乙醇对吸附后的树脂进行解吸有较好的解吸效果。
2.4大孔吸附树脂对黄酮的动态吸附与解吸试验
2.4.1 树脂对黄酮的吸附透过曲线见图 5。由图 5可以看
出,随上样液体积增加,流出液中黄酮含量增加,即树脂对
黄酮的吸附效果随上样液体积的增加而下降,这是由于树
脂吸附接近平衡的缘故。该试验条件下,当上样液体积在
140ml以上,流出液中黄酮含量不再增加,即树脂的吸附达
到平衡。经试验测定,当上样液为100ml,即上样液与树脂
表1 大孔吸附树脂的筛选结果
树脂种类 吸附容量∥mg/g 吸附率∥% 解吸率∥%
S!8 9.56 83.83 9.43
HPD100 5.84 51.15 65.29
HPD600 6.33 55.36 70.63
HPD450 3.88 34.09 76.03
HPD700 4.28 37.61 65.24
AB!8 4.98 43.76 70.28
NKA!9 2.88 25.31 83.33
D4020 5.18 45.52 59.85
安徽农业科学 2006年2170
(上接第2168页)
容量瓶中,配制成含芦丁0.2460mg/ml和含槲皮素0.0864
mg/ml的对照品混合溶液,用0.45μm滤膜过滤。
1.3.2 杜仲叶供试液。杜仲叶干燥后粉碎,过40目筛,准确
称取约5g,置具塞三角烧瓶中,加浓度 70%乙醇超声提取
2h,提取液过滤,滤渣洗涤 2次,合并滤液于 50ml容量瓶
中,乙醇定容至刻度,0.45μm滤膜过滤,得样品溶液。
2 结果与分析
2.1 线性关系 分别准确吸取对照品混合溶液 1.0、5.0、
10.0、15.0、20.0μl进样分析,按“ 1.2”所述色谱条件测定峰
面积,以对照品的进样量为横坐标,以峰面积为纵坐标,进
行线性拟合,芦丁和槲皮素的回归方程分别为:Y芦丁=2.01×
105x-1.92×104(r=0.99993),Y槲皮素=2.32×105x-1.10×104(r=
0.99989)。表明当芦丁进样量在0.246～4.92μg,槲皮素进样
量在0.0846～1.692μg范围内线性关系良好。
2.2 精密度测定
2.2.1 对照品测量的精密度。取对照品混合溶液重复进样
5次,进样量10μl,以峰面积积分值计算,芦丁、槲皮素峰面
积RSD分别为0.3%和0.6%。
2.2.2 样品测量的精密度。取杜仲叶供试样品重复进样 5
次,进样量 10μl,以峰面积积分值计算,芦丁、槲皮素峰面
积RSD分别为0.5%和0.7%。
2.2.3 样品测量的稳定性。取杜仲叶供试样品放置2、4、6、
8h后,进样分析,测得芦丁、槲皮素峰面积为 1.1%和 0.5
%,样品在测定时间内稳定。
2.3 检测波长的选择 取芦丁和槲皮素对照品混合溶液
进样,使用 PAD检测器进行三维扫描,提取 190～600nm波
长范围内 2组分的紫外光谱(图 2),流动相中芦丁最大吸
收波长分别为 204.5、256.3和 357.4nm,槲皮素最大吸收波
长分别为203.4、255.2和3367.9nm。提取各波长下色谱进
行比较,选择356nm作为检测波长基线平稳,峰形好。
2.4 回收率测定 精密称定已知芦丁和槲皮素含量的杜
仲叶5份,每份约5g,加入适量对照品混合溶液,按“ 1.3.2”
所述方法制备样品溶液,测定加样样品中两组分含量,芦丁
和槲皮素的平均加样回收率分别为99.8%、102.1%。
2.5 样品测定 用上述方法测定了 3批不同时间采收的
杜仲叶中芦丁和槲皮素含量,测定结果见表 1。表 1表明,
不同样品中芦丁和槲皮素含量不同。
3 讨论和小结
(1)采用超声提取,以不同浓度的乙醇为提取剂,考察
了2种黄酮类成分的提取效果。结果表明,用浓度 70%乙
醇提取时芦丁和槲皮素得率最高;样品溶液过滤后可直接
进样分析,对色谱柱未产生损害。
(2)采用高效液相色谱法同时测定杜仲叶中芦丁和槲皮
素的含量,方法简便、准确、可靠,为杜仲叶质量控制提供了
一定的依据。
参考文献
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表1 不同样品中芦丁和槲皮素含量测定结果
芦丁∥mg/g 峰面积∥% 槲皮素∥mg/g 峰面积∥%
040812 2.699 0.9 0.219 1.5
040913 2.963 1.1 0.228 0.6
041012 3.127 0.3 0.233 1.2
用量为 10∶1时,树脂对黄酮的吸附率为 93.04%。因此,试
验确定二者用量比例为10∶1。
2.4.2 树脂对黄酮的解吸曲线(图6)。由图6可以看出,采
用体积分数 70%乙醇进行解吸,洗脱峰集中,没有明显的
拖尾现象。64ml的体积分数为 70%的乙醇基本上可以将
黄酮完全洗脱下来,经计算解吸率达90.24%。
3 结论
(1)在进行筛选的 8种树脂中,HPD600对黄酮的吸附
量大,吸附率较高,易解吸,是一种理想的黄酮吸附剂,适宜
于对黄酮的提取分离。
(2)HPD600对无梗五加果黄酮的最佳纯化工艺条件
为:上样液pH=5.06,浓度为 0.5mg/ml,与树脂用量为 10∶1,
控制流速为 1ml/min,以 64ml体积分数为 70%的乙醇解
吸。此条件下,HPD600对黄酮的吸附率可达93.04%,解吸
率90.24%,经树脂纯化后,黄酮纯度为86.79%。
参考文献
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究进展[J].中国药业2002,11(12):73-74.
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冯 颖等 大孔树脂纯化无梗五加果总黄酮工艺研究34卷10期

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