全 文 ：16 8 药物分析杂志 C hi n J Ph ~ A n al 20 5
,
25 ( 2)
喜树果中喜树碱和 10 一 轻基喜树碱的 H P L C 分析 ’
刘文哲 ’ ,秦海燕` , 索志荣“
( 1
. 西北大学生命科学学院 西安 l7 0() 6 9 ;2 . 西北大学分析科学研究所 西安 71 《X ) 69 )
摘要 目的 : 建立测定喜树果中喜树碱和 10 一 经基喜树碱的反相高效液相色谱法 ,并用该方法测定 9 个产地喜树果中喜树碱
和 or 一 轻基喜树碱的含量 。 方法 : 以 H y p e sr il 0 D (S 250 ~ x 4
.
0
~
,
5
.
0 林m )为色谱柱 ;流动相 A 为水 , B 为甲醇 ;梯度洗脱 :
在 0 m i n 到叨 m i n 内流动相由 A 一 B ( 60 : 40 )到 A 一 B ( 30 : 7 0 ) ;流速为 1 . 0 毗 · m i n 一 ’ ;检测波长为 254 n m ;柱温为 25 ℃ 。 结
果 :喜树碱在 .0 or 一 L o 林g 范围内线性关系良好 ,其低 、 中 、 高 3 个量的平均加样回收率分别为 9 . 6 % , 10 . 3% , 9 . 97 % ;
sR D 分别为 0 . 57 % , 0 . 25 % , 0 . 43 % 。 or 一经基喜树碱在 0 . 30 一 4 . 0 此 范围内线性关系良好 ,其低 、 中 、 高 3 个量的平均加样
回收率分别为 9 . 87 % , 9 . 98 % , 10 . 4% ; RS D 分别为 0 . 犯% , 0 . 19 % , 0 . 34 % 。 结论 :该方法是一种灵敏 、 准确的分析法 。
关键词 :喜树 ;喜树碱 ; 10 一 轻基喜树碱 ;果实 ;高效液相色谱法
H P L C A na ly
i n
5 15 o f C姗P t o ht e c in a n d 10 一 H y d r o x y c a m P t o ht e c in
F r ul t o f C a n 争ot ht e c a a e u m i n a at D e c n e .
1 [J w
e n 一 z h e ’ , QIN H a i 一 y a n ’
,
s u o z h i 一 or n g Z
( 1
.
C o l e g e of L i fe S e i en e e
,
N o祖 lwe s t U in v o ity , Xi ’ an 7 1X() 6 9 ; 2 . nI s it tu t e o f A n al yt i e al cS i e n e e , N o d hwe s t Un i v e sr iyt , X i ’ an 7 10 06 9 )
A b str
a c t O bj e ict
v e : oT
e s t ab il
s h a n HPL C m
e ht o d fo r d e t e mr i
n in g o f e am P ot ht
e e i n a n d 1 0 一 h y d or x y e a m p to th e e i n
i n t h e fur i t
o f aC 呷 ro t h e e a ac u m ina t a D e e n e . M e t h o d : RP 一 H P L C w as u s e d . hT e s e part i o n w a s p e for mr e d o n Hy -
p e sr i l O D S ( 2 5 0 m m
x 4
.
0 m m
,
5
.
0 林m ) e o l u m n w iht m o b i l e hP a s e of 笋d ie n t H 2 0 一 CH 3 O H ( 0 一碎0 m i n , 6 0 : 4 0
。 3 0 : 7 0 ) an d 山e n o w ar t e w a s 1 . 0 m L · m i n 一 ’ . 仆e d e t e丽 n at i o n w a s d o n e a t 2 5 4 n m an d 2 5 ℃ fo r C o l u m n . R e -
sul st
:
hT
e l i n e ar arn g
e fo r e a m p t o ht e e i n a n d 10 一 场d or x y e a m tP ot h e e i n w a s 0 . 1 0 一 1 . 0 0 林9 a n d 0 . 3 0 一 4 . 0 林9 r e -
s p e e ti v e l y
, a n d th e a v e ar g e er e o v e ir e s o f e a m P t o ht e e i n w e er 9 9
.
6 6%
,
l X()
.
3% an d 9 9
.
9 7% w i t h e o er
s p o n d i n g
R SD o f 0
.
5 7%
,
0
.
2 5% a n d 0
.
4 3% ; ht e va e ar g e r e e o v e ir e s o f 10 一 h y d or x y e a m p t o th e e i n w e er 9 9
.
8 7%
,
9 9
.
9 8%
a n d 10
.
4% w iht e o er
s p o n d i雌 R SD o f 0 . 3 2% , 0 . 19% a n d 0 . 3 4% . C o cn lus i o n : A s e n s i t i v e a n d ac e uar t e m e ht -
o d fo r ht e d e te mr i
n a t i o n of e a m P t o ht e e i n a n d h y d or x y e a m P to ht e e i n w as fo u n d e d
.
K ey w o r d s
:
aC 筋少忿o t he e a a e u im an at D e e n e
.
; e a m p t o ht e e i n ; 10 一 h ydor
x y e am p
t o ht e e i n ; fur i t ; H PL C
喜树 ( C a 抓尹` o t he c a ac u械an at eD c ia sn e )属琪桐科 国 FDA 批准用于临床治疗癌症 ,另外尚有数种正在
(哑s ac e ae )多年生落叶乔木 ,是我国特有树种 〔` 〕 ,广 进行临床实验 [’] 。 因此 , 喜树作为一种抗癌药源植
泛分布于长江流域及其以南诸省区 。 喜树碱 ( c aln p一 物 ,具有相当重要的研究应用价值 。 文献报道测定喜
ot ht ec in c盯 )和 or 一 经基喜树碱 ( 10 一 h y dID x y c a l n p一 树中生物碱的方法有分光光度法和高效液相色谱
ot het ic
n
cH rP )是喜树中所含的叫噪类生物碱〔’ 〕 ,具 法 〔, 一 ’ 〕 ,但对于喜树中喜树碱和 or 一经基喜树碱的同
有显著的抗癌活性 ,且其抗癌机理独特 ,是迄今为止 时测定未见报道 ,本文采用 RP 一 HP LC 法对喜树果中
发现的唯一专门通过抑制拓扑异构酶 I发挥细胞毒性 喜树碱和 10 一经基喜树碱进行了同时测定 。 该方法
的天然植物活性成分 s[] 。 目前已有拓扑潜康 ( top et 一 可以为喜树碱类产品的开发 、生产以及喜树药材的质
c
an )和依诺潜康 ( ir n ot ec an )等喜树碱类药物获得美 量控制提供科学依据 。
* 国家 自然科学基金项目 ( 2 0 27 5 0 3 0) 、教育部科学技术研究重点项目 ( 0 2 87 ) 、 高等学校骨干教师资助计划项目 ( G 一 1 50 一 71 0 06 一 2 87 7)和陕西省教育厅产业化培育项目 ( 0 3 Jc 3 9)
DOI : 10. 16155 /j . 0254 -1793. 2005. 02. 006
药物分析杂志 Chi n J Ph arm A n al 2 00 5
,
25 ( 2 )
1 仪器 、试剂与样品
H P n o 高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司 ) ,
配有二极管阵列检测器 ; D L 一 150 型超声清洗器 (浙
江省象山县石浦天电子仪器厂 ) , iM il 一 QG 超纯水
制备仪 (美国 iM il op er 公司 ) , SH B 一 1 循环水式多
用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司 ) , SE N c o R 系
列旋转蒸发器 (上海申生科技有限公司 ) ,植物试样
粉碎机 (河北省振兴电器厂 ) 。
喜树碱 (纯度为 9 . 2% )和 10 一 经基喜树碱对
照品 (纯度为 9 . 5% )购 自 iS gtn a 公司 , 甲醇为色谱
纯 ( iF s h e r S e i e n t i if e U K L im i t e d 生产 ) ,水为超纯水 。
喜树果实采自湖南 、陕西 、 广西 、 江西 、贵州 、浙
江 、 四川 、 江苏和福建 9 个地区 ,并经西北大学任毅
教授鉴定 。
2 溶液制备
2
.
1 供试品溶液 将样品置于 60 ℃恒温干燥箱中
干燥至恒重 ,用研钵研成粉末 , 过 60 目筛 , 准确称取
其粉末 10 0 m g ,置于 2 5 m L 具塞试管中 ,加人 10 m L
甲醇超声提取 30 m in , 滤过 , 同法再提取 2 次 ,合并
提取液 ,减压浓缩后 ,用 甲醇定容至 1 m 1) 。 用 0 . 45
林m 微孔滤膜滤过 , 即得 。
2
.
2 对照 品溶液 准确称取对照 品喜树碱 20 . 8
m g 和 or 一 经基喜树碱 2 . 20 m g ,分别置于 10 m L 量
瓶中 ,加人甲醇适量超声溶解 ,用甲醇稀释至刻度 ,
振荡均匀 ,用 0 . 45 林m 微孔滤膜滤过 , 即得喜树碱
和 10 一 经基喜树碱浓度分别为 2 . 08 m g · m L 一 ’ 和
o
,
2 m g
·
fnL
一 `的对照品溶液 。
3 色谱条件
色谱柱 : H即 e rs i l O D S ( 2 5 0 m m x 4 . 0 m m , 5 . 0
林m )分析柱 ;流动相 : A 相为水 , B 相为甲醇 ;梯度洗
脱程序为 : 在 0 m in 到 4 0 m in 内流动相由 A 一 B ( 6 0
: 4 0 )到 A 一 B ( 3 0 : 7 0 ) ;流速 : 1 . 0 m L · m i n 一 ` ;检测
波长为 254 n m ;柱温 : 25 ℃ ;进样量 : or 林L , 色谱图
见图 1。
J匕L~ r已`一 」) i
图 1 对照品和样品 HP CL 色谱图
F ig 1 H p CL
e肠 m a ot gr 别 m s of r e fe 理 n e e sub s atn e e s an d sam pl es
A
.
or 一 经基喜树碱 ( 10 一 场d r o x y c 田 n p t o ht ec i n) B . 喜树碱 ( c anZ pot ht ec in) C . 福建产喜树果实 (加 ist for m Fiuj an ) D . 湖南产喜树果实
( fur i t
s
for m Hun an )
1
.
10 一 经基喜树碱 ( 10 一 hy dr o x y c即 l p t o ht ec i n ) 2 . 喜树碱 ( e an 甲 thot e e in )
4 线性关系考察
分别精密移取 ,’2 . 2” 项所配的喜树碱和 10 一 经
基喜树碱对照品溶液各 10 , 20 , 30 , 4 0 , 50 林L ,
混合后 , 定容到 1 m L ,得喜树碱和 10 一 经基喜树碱
浓度分别为 0 · 2 1 , 0 . 4 2 , 0 . 6 2 , 0 . 8 3 , 1 . 04 m g · m L 一 `
和 0 . 0 2 , 0 . 0 4 , 0 . 0 7 , 0 . 0 9 , 0 . 1 1 m g · m L 一 `的混合对
照品溶液 。 将上述混合对照品溶液分别平行测定 3
次 (均进样 or . 0 林)L , 用平均峰面积 Y对进样量 C
( 林g )进行线性回归 , 喜树碱和 10 一 经基喜树碱的
回归方程和相关系数分别为 :
Y = 1
.
4 7 x 10
5
C 一 7 9
.
4 r = 0
.
9 9 9 3
Y = 2
.
3 8 x 10 5 C + 4 7
.
3 r = 0
.
9 9 94
5 精密度实验
精密量取四川产喜树果的供试品溶液 10 林 L ,
重复进样 5 次 ,喜树碱和 10 一经基喜树碱峰面积积
分值的 R SD 分别为 0 . 7% 和 O, 5% 。
6 稳定性实验
将四川产喜树果的供试品溶液 , 分别静置 0 , 2 ,
4
,
8
,
16 h 后进行测定 , 结果喜树碱和 10 一 经基喜树
碱峰面积积分值的 R SD 分别为 1 . 1% 和 0 . 8% 。
7 重复性实验
取四川产喜树果的供试品 6 份 , 按 “ 2 . 1 ” 项操
作制备供试品溶液 ,按测定条件进样测定 ,结果喜树
碱和 10 一 经基喜树碱含量的 RS D 分别为 1 . 8% 和
1
.
3%
。
8 加样回收率实验
准确称取已测得含量的喜树果样品 (四川产 )
5 0 m g g 份 ,分别置于 10 m L 试管中 ,平均分为 3 组 ,
每组分别精确加人 “ 2 . 2 ” 项所配的喜树碱和 10 一 经
基喜树碱对照品溶液各 10 , 25 0 , 5 0 泌 , 混合后 ,
药物分析杂志 Chi n J Ph ~ A n al 20 5
,
25 ( 2)
按 “ 2 . 1” 项下操作制备溶液 ,将所制得的溶液按 “ 色
谱条件 ” 项下进行测定 ,每份溶液进样 3 次 ,计算喜
树碱和 10 一 经基喜树碱的平均加样 回收率 ,结果
为 :喜树碱在低 、 中 、高 3 个量的平均加样回收率分
别 为 9 9 . 6 6% , l X() . 3% , 9 9 . 9 7% : R SD 分 别 为
0
.
57 %
,
0
.
25 %
,
0
.
43 %
。
10 一 经基喜树碱在低 、 中 、
高 3 个量 的平均 加样 回收率 分别 为 9 . 87 % ,
99
.
9 8%
,
1X()
.
4% ; RSD 分 别 为 0 . 3 2% , 0 . 19 % ,
0
.
3 4%
。
9 样品含量测定
按 “ 2 . 1 ” 项下操作制备供试品溶液 ,进样 10 林L
(共 3 次 )进行测定 ,用回归方程计算 ,结果见表 1 。
表 1 样品测定结果 ( % )
T a b I R。赴 lst of sanI
P le de et 比曲an 目o n 《% )
产地
( 6七 i t so 二 e )
喜树碱
c 田 n P to ht e c in
10 一经基喜树碱
( 10 一 h y d
r o x y e a D】p ot 山 ec in )
10
.
3 喜树果中喜树碱含量的地区差异 喜树分布
于我国长江以南及西南各省 , 由于各地所处自然环
境的差异 ,果实中的喜树碱和 10 一经基喜树碱的含
量也存在差异 。 福建所产的喜树果实中喜树碱的含
量最高 , 达 0 . 169 % 。 广西和贵州所产的喜树果实
中喜树碱的含量较低 , 为 0 . 075 % 。 而其他地区所
产的喜树果 实 中喜树碱 的含量 位 于 o . or % -
0
.
13 % 之间。 这一结果与文献报道 〔8〕略有不同 。 然
而 ,各地所产喜树果实中 10 一 经基喜树碱的分布规
律有别于喜树碱 , 以湖南所产的喜树果实中 10 一 经
基喜树碱含量最高 。 而广西产的 10 一 经基喜树碱
含量最低 。 如果综合喜树碱和 or 一 经基喜树碱 2
个因素 , 以产于湖南的喜树果实中喜树碱和 10 一 经
基喜树碱的含量均达到 0 . 13 % 以上 ,可 以作为选择
优良种源的参考 。 这一结果可为喜树碱的提取和选
择 、培育喜树碱含量高的优势种源提供依据 。
湖南 ( H~ )
陕西 ( 51, a n x i )
广西 ( C u an gx i )
江西 ( iJ an , )
贵州 ( C u曰犯 u )
浙江 ( Zh ej lan g )
四川 ( S i e h u an )
江苏 ( Jian 罗 u )
福建 ( F U jia 。 )
0
.
135
0
.
12 6
1 0 讨论
1 0
.
1 喜树样品提取方法 考察了不同提取溶剂
(无水乙醇 、 70 % 乙醇 、 甲醇 、 70 % 甲醇 ) 、 不同提取
时间 ( 10 , 3 0 , 6 0 , 12 0 m i n )和不同提取方法 ( 回流 、超
声 )对提取效率的影响 ,实验结果表明 : 用甲醇作提
取溶剂的提取率明显高于其他溶剂 , 故提取溶剂选
用甲醇 ;相对于回流而言 , 连续超声提取 3 次 , 每次
30 im
n ,可获得较高的提取效率 。
10
.
2 色谱条件的优化 对供试品溶液进行 HPL C
一 U V 三维图谱扫描并结合文献「8」, 选定 230 urn 、
25 4
n m
、
26 0
n m 3 种吸收波长进行试验 , 结果表明 :
喜树碱和 10 一 经基喜树碱在波长为 23 O ln 和 26 0
n m 处的吸收均不如在 254 n m 处的强 , 故选用 2 54
n m 作为检测波长 。 同时 ,考察了不同的等度洗脱和
梯度洗脱条件 ,结果表明 : 采用等度洗脱时 ,在短时
间内 , 10 一 经基喜树碱与其他成分无法有效分离 ,而
采用 “ 3 ” 项中的色谱条件 ,喜树碱 、 10 一经基喜树碱
及其他成分在 30 而 n 可得到完全分离 。
参考文献
1 D e l e e巨s I 1o r a e R e iuP b il e a e OP P ul iar s Sin i e ae A g e n d ae A e ad e面 ae
is 城cae (中国科学院中国植物编辑委员会 ) . 1 , 10 ar eR ip u b阮 ae
I玩 ,记面 s s i n i e ae (中国植物志 ) . 52 ( 2 ) . B e ij in g (北京 ) : cS i e n e e
P陀阳 (科学出版社 ) , 19 83 . 14
2 W al M E
,
W朋 i M C , Co k C E , et 以 . P lan t an it ut m o r ag e n st . hT e i -
so la t i o n an d sutr
c t l er of c 肚 n p t o t h e c in , a on vel al kal o id a l leu k~
叨d
n皿。 r in坛 b iotr 加m aC mp ot 盆he e a ac “ 而an 绍 . J Am C he m se 火 , , 19 6 6 ,
8 8 ( 16 )
: 3 88 8
3 H s i a n g Y H
,
H e ir zb en g R
,
H ce h t S
, et a l
.
C别田 p ot ht ec in in d u e e s p m -
et in 一 1 1nk e d D N A b er ak 。 via m am m al ian D N A otP io so
~
1
.
J
B汉 C触m , 19 8 5 , 2 6 0 : 14 8 7 3
4 M il an OP tm
e s il
,
H e ht ert P i
n e do
.
C a m p t o t h e e in s : N ew nA t i
e
an
e e r A
-
g即切 . Boc a R a t o n : C R C p此 5 5 , 2 0X() . 6 7
5 Z HNA G Qin g
一 而 n (张清民 ) , WNA G I、 n g (王鹏 ) , G U Xu e 一 q iu
(顾学裘 ) . , , h r e e 一 w vae l e n ght sP e e饰户 o t o m e盯 d et enr
at i o n o f
c a n 甲 t o t he e认 i n e an l p ot ht e e i n 脚 ly p has e 11脚 so m e (三波长分光光度
法测定喜树碱多相脂质体中喜树碱 的含量 ) . J s h e砚阻 ng col l
尸人“。 (沈阳药学院学报 ) , 199 1 , 8 ( l ) : 4 8
6 Y A 0 p e i 一 h u an g (姚培演 ) . D e temu
n at i o n o f c a l l甲 t o het
e in b y H PL C
m e ht od ( HP LC 测定喜树碱的含量 ) . hC ina J hC in 入肠etr M ed ( 中
国药学杂志 ) , 19 9 4 , 2 9 ( 3 ) : 16 5
7 YNA 兀 u 一 fe ng (阎秀峰 ) , W A N G Y an g (王洋 ) 八 U T aO (于涛 ) ,以
a l
.
D e t
enur
n
iat
o n Of e a l l l p t o ht e e in i n l e va e s Of aC 呷ot `h e ca
acm ina
at
D ec ne
.
b y l Ip L (C 喜树叶中喜树碱含量的高效液相色谱分析 ) · J
加加m 月 n a l (分析测试学报 ) , 2 0 0 2 , 2 1 ( 2 ) : 1 5
8 Z l l A N G Y u 一 ho ng (张玉红 ) : r h e g e o孚即h i e公 v面 a t i o n 即 d se aso -n
al 。 h an 罗 s 。 f c o p t o ht e e i n in fur i t s of ca 呷ot 名he c a ac unz ~ 协 (喜树
果实中喜树碱含量的产地差异及季节变化 ) . J No 月he 山 t oF 砚`尽
nU州东北林业大学学报 ) , 2X() 2 , 30 ( 6 ) : 4
(本文于 2 0( H 年 l 月 7 日收到 )