全 文 ：收稿日期：２０１３－０１－１９
ＤＮＳ法测定红松松塔多糖含量的研究
冯雪，张曜武＊，曹炳星，王薇薇
（青岛科技大学化工学院，山东 青岛 ２６６０４２）
摘 要：为建立红松松塔多糖含量测定方法。应用ＤＮＳ法分别测定还原糖及水解后总糖的含量，
计算得出多糖含量。结果表明，以葡萄糖为对照品，此方法在２０～６７ｍｇ／Ｌ浓度范围内线性关系良
好，回归方程Ａ＝１８．７Ｃ－０．２２３２（Ｒ２＝０．９９９３），平均加样回收率９９．４７％，ＲＳＤ＝１．６８％。此法稳
定性、重现性、精密度等均在规定范围内，过程简单，操作简便，可快速得出结果。
关键词：红松；多糖；含量测定；ＤＮＳ法
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ Ｐｉｎｕｓ ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ Ｃｏｒｎｓ
ｗｉｔｈ ＤＮＳ Ｍｅｔｈｏｄ
Ｆｅｎｇ Ｘｕｅ，Ｚｈａｎｇ Ｙａｏｗｕ＊，Ｃａｏ Ｂｉｎｇｘｉｎｇ，Ｗａｎｇ Ｗｅｉｗｅｉ
（Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｑｉｎｇｄａｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｑｉｎｇｄａｏ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２６６０４２）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ Ｐｉｎｕｓ ｋｏ－
ｒａｉｅｎｓｉｓ ｃｏｒｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｓｕｇａｒ ｂｙ ＤＮＳ Ｍｅｔｈ－
ｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｎｔｒａｓｔ ｔｏ ｇｌｕｃｏｓｅ，ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｗａｓ ２０－６７ｍｇ／Ｌ（Ｒ２＝０．９９９ ３），ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅ－
ｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９９．４７％，ＲＳＤ＝１．６８％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｔｅａｄｙ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｒｅｐｅａｔ－
ａｂｉｌｉｔｙ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐｉｎｕｓ ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ；Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｓ；Ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ；３，５－ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｌ－
ｏｒｉｍｅｔｒｙ
红松（Ｐｉｎｕｓ ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ Ｓｉｅｂ．ｅｔ Ｚｕｃｃ）又名果
松，属于松科植物，主要分布在我国东北长白山到小
兴安岭一带。很早之前日本民间就流传用松塔煮水
治疗胃癌的偏方［１］。化学成分研究表明，红松松塔
中含有萜类、木质素、黄酮、挥发油、维生素类、棕榈
碱、矿物质、多糖、蛋白质，以及脂肪等多种成分［２］。
药理研究证实松塔多糖具有抗氧化、调节免疫机能、
抑制肿瘤、抗菌、抗病毒等功效，其中调节免疫机能
及抑制肿瘤等功效尤为突出。在日本已将松塔多糖
作为健康食品和医药品的原料，并已申请了专利［３］。
目前，植物多糖含量测定的常用方法有苯酚－硫
酸法和ＤＮＳ法（３，５－二硝基水杨酸比色法）等方法，
其中ＤＮＳ法过程简单，操作简便，且测定结果少受
杂质干扰［４］，尤其适用于含有杂质组分的多糖样品；
此外，不使用具有腐蚀作用的浓硫酸，亦为本法之突
出优点。本实验中尝试将ＤＮＳ法用于红松松塔多
糖成分的含量测定，进行了以下系列研究，该工作尚
未见有文献报道。
１ 材料
１．１ 材料
红松松塔多糖提取物（本实验室制备）；葡萄糖；
苯酚；ＮａＯＨ；Ｎａ２ＳＯ３；酒石酸钾钠；３，５－二硝基水杨
酸；盐酸（以上试剂均为分析纯）。
１．２ 仪器
ＦＡ１００４Ｎ型电子天平（上海精密科学仪器有限
公司）、ＳＨＺ－ＩＩＩ式循环水真空泵（上海亚荣生化仪
器厂）、８０－２Ｂ型台式低速离心机（上海菲恰尔分析
仪器有限公司）、ＲＥ－５２型旋转蒸发仪（上海亚荣生
化仪器厂）、Ｔ６新世纪紫外－可见分光光度计（北京
普析通用仪器有限公司）。
２ 实验方法
２．１ 相关溶液的制备
２３
第３期（总第１２４期） 中 国 林 副 特 产 Ｎｏ．３（ＧＳＮＯ．１２４）
２０１３年６月 Ｆｏｒｅｓｔ Ｂｙ－Ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ ｉｎ Ｃｈｉｎａ Ｊｕｎ．２０１３
DOI:10.13268/j.cnki.fbsic.2013.03.003
２．１．１ 对照品溶液的制备
取１０５℃恒重的葡萄糖对照品５０ｍｇ，精密称
定，加适量水溶解，转移至１００ｍＬ容量瓶中，稀释、
定容，即得葡萄糖对照品溶液。
２．１．２ 样品溶液的制备
取红松松塔多糖提取物样品４００ｍｇ，精密称
定，加适量纯水，沸水浴中加热振摇使溶解，趁热过
滤，热水冲洗滤渣，将洗液、滤液混合，转移至５０ｍＬ
容量瓶中，稀释、定容即得样品溶液。
２．１．３ 总糖溶液的制备
精密量取样品溶液２．５ｍＬ，加水２．５ｍＬ，加
６ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液１５ｍＬ，在沸水浴中加热４０ｍｉｎ，流
水冷却至室温，加酚酞指示液１滴，摇匀，用４０％氢
氧化钠溶液调节至微红色，转移至２５ｍＬ容量中，稀
释、定容即得。
２．１．４ 单糖溶液的制备
精密量取样品溶液５ｍＬ，置于１０ｍＬ容量瓶
中，加酚酞指示液１滴，摇匀，用１％氢氧化钠溶液
调节至微红色，稀释、定容即得。
２．１．５ ＤＮＳ显色液的制备
甲液：溶解２．３ｇ苯酚于５ｍＬ １０％ＮａＯＨ中并
稀释到２３ｍＬ，在此溶液中加入２．３ｇ Ｎａ２ＳＯ３，溶解
混匀即得；
乙液：称取８５ｇ酒石酸钾钠，将其加入１００ｍＬ
１０％的ＮａＯＨ中，再加入２９３ｍＬ １％的３，５－二硝基
水杨酸溶液，混匀即得；
将甲、乙溶液相混合，即得黄色溶液，贮存于棕
色试剂瓶，室温下阴暗处放置７～１０天后使用。
２．２ 实验条件的考察
２．２．１ 最大吸收波长的确定
精密量取对照品溶液０．８ｍＬ、总糖溶液和单糖
溶液各１ｍＬ，加水使成２ｍＬ，分别精密加入ＤＮＳ显
色液２．５ｍＬ混匀，在沸水浴中加热７ｍｉｎ后，立即用
流水冷却至室温，加水３ｍＬ摇匀，用相应的试剂做
空白，照分光光度法在４００～６００ｎｍ范围内进行扫
描，吸光度变化曲线如图１。
图１ ４００～６００ｎｍ范围内各溶液吸收曲线图
由图１可知，对照品溶液、总糖溶液和单糖溶液
的最大吸收波长 （λｍａｘ）均为 ４９０ｍｎ，所以选择
４９０ｎｍ作为含量测定波长。
２．２．２ 水解条件的考察
（１）酸用量的确定。精密量取样品溶液４份，每
份２．５ｍＬ，各加水２．５ｍＬ，分别加６ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液
５、１０、１５、２０ｍＬ，在沸水浴中加热３０ｍｉｎ，用流水冷
却后加酚酞指示液１滴，用４０％氢氧化钠溶液调节
至微红色，分别转移至２５ｍＬ容量中，定容。每份取
２ｍＬ，分别精密加入ＤＮＳ显色液２．５ｍＬ混匀，在沸
水浴中加热７ｍｉｎ后，立即用流水冷却至室温，加水
３ｍＬ摇匀，用相应的试剂做空白，在４９０ｎｍ测吸收
度Ａ。酸用量对吸光度的影响如图２。
图２ 酸用量对吸光度的影响
由图２可知，本实验中，酸用量为１５ｍＬ时，吸
光度为最大值，即使酸用量再增大，吸光度也不再增
加。因此选择１５ｍＬ为适宜酸用量。
（２）水解时间的确定。精密量取样品溶液５份，
每份２．５ｍＬ，各加水２．５ｍＬ、６ｍｏｌ／Ｌ 盐酸溶液
１５ｍＬ，分别在沸水浴中加热１０、２０、３０、４０、５０ｍｉｎ
后，流水冷却至室温，加酚酞指示液１滴，用４０％氢
氧化钠溶液调节至微红色，转移至２５ｍＬ容量中，定
容。依照（１）酸用量测定中的相同方法，自“每份取
２ｍＬ”起，依法测定。水解时间对吸光度的影响如图
３。
图３ 水解时间对吸光度的影响
由图３可知，４０ｍｉｎ时吸光度为最大值，即水解
时间为４０ｍｉｎ时，多糖水解完全。所以选择４０ｍｉｎ
为适宜水解时间。
２．２．３ 显色条件的考察
（１）ＤＮＳ显色液用量的确定。精密量取０．８ｍＬ
葡萄糖对照溶液，平行６份，加水使成２ｍＬ，分别精
３３
２０１３年 冯雪等：ＤＮＳ法测定红松松塔多糖含量的研究 第３期
密加入 ＤＮＳ显色液０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０
ｍＬ，混匀，依法测定。ＤＮＳ显色液用量对吸光度的
影响如图４。
图４ ＤＮＳ显色液用量对吸光度的影响
由图４可知，ＤＮＳ显色液用量为２．５ｍＬ时吸
光度最大，说明ＤＮＳ显色液用量为２．５ｍＬ时反应
完全，故ＤＮＳ显色液最佳用量为２．５ｍＬ。
（２）显色时间的确定。精密量取０．８ｍＬ葡萄糖
对照溶液，平行４份，加水使成２ｍＬ，分别精密加入
ＤＮＳ显色液２．５ｍＬ，混匀，分别沸水浴３、５、７、
１０ｍｉｎ，取出，依法测定。显色时间对吸光度的影响
见图５。
图５ 显色时间对吸光度的影响
由图５可知显色时间７ｍｉｎ时吸光度最大，所以
选择最佳显色时间为７ｍｉｎ。
２．３ ＤＮＳ法方法学考察
２．３．１ 线性关系的考察
精密量取０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、
１．０、１．１ｍＬ的葡萄糖对照品溶液，加水使成２ｍＬ，
依法测定。以葡萄糖浓度（ｍｇ／ｍＬ）为横坐标，以吸
光度为纵坐标绘制４９０ｎｍ 标准曲线、得出回归方
程，见图６。
图６ ＤＮＳ法标准曲线
由图６可知标准曲线为ｙ＝１８．７ｘ－０．２２３２
（Ｒ２＝０．９９９３），在２０～６７ｍｇ／Ｌ浓度范围内线性关
系良好。
２．３．２ 精密度实验
精密量取总糖样品溶液、单糖样品溶液各６份，
每份２ｍＬ，依法测定，相关数据记录见表１。结果表
明该法精密度良好。
表１ 精密度实验结果
吸光度
１ ２ ３ ４ ５ ６
ＲＳＤ
总糖溶液０．５９３６ ０．６０２０ ０．５９７４ ０．６０３１ ０．６０９４ ０．６００３ ０．８９％
单糖溶液０．３９３４ ０．４０４３ ０．３９９３ ０．３９７７ ０．３９２６ ０．４０１８ １．１６％
２．３．３ 重现性实验
取同一批号样品５份，依法制备、测定，相关数
据见表２。由表可知该方法重现性良好。
表２ 重现性实验结果
吸光度
１ ２ ３ ４ ５
ＲＳＤ
总糖溶液 ０．５２７５ ０．５２６４ ０．５２０２ ０．５２８１ ０．５２２９ ０．６４％
单糖溶液 ０．４９０６ ０．４８９２ ０．４９１３ ０．４９２１ ０．４８８４ ０．２８％
２．３．４ 稳定性实验
精密量取水、单糖溶液、总糖溶液各２ｍＬ，依法
测定。每隔３０ｍｉｎ测定１次，共测２ｈ，相关数据见
表３。结果表明该方法２ｈ内稳定性良好。
表３ 稳定性实验结果
时间／ｈ
０ ０．５ １．０ １．５ ２．０
ＲＳＤ
单糖溶液 ０．４７２７ ０．４７０９ ０．４６９２ ０．４７１７ ０．４６６８ ０．４９％
总糖溶液 ０．３７９９ ０．３８２０ ０．３８０３ ０．３７６２ ０．３８４３ ０．７８％
２．３．５ 加样回收率实验
取多糖粗品５份，每份约２０ｍｇ，精密称定，精密
加入葡萄糖对照品５ｍｇ，依法制备、测定。结果如
表４所示，表明样品回收率理想，此方法可行。
表４ 加样回收率实验结果
样品量
／ｍｇ
总糖量
／ｍｇ
加入量
／ｍｇ
测得量
／ｍｇ
回收率
／％
平均回收率
／％
ＲＳＤ
１ ２０．０２ ４．３７ ５．０３ ９．６１ １０２．１９
２ ２０．１４ ４．４０ ５．０９ ９．３３ ９８．６４
３ １９．９７ ４．３７ ５．１６ ９．５２ ９９．８９
４ ２０．２６ ４．４３ ５．２２ ９．４５ ９７．９２
５ ２０．３５ ４．４５ ５．３４ ９．６６ ９８．７０
９９．４７ １．６８％
２．４ 样品多糖含量测定
依法对三批样品进行制备、测定，结果如表５。
表５ 样品含量测定
批号 ２０１１０９２０ ２０１２０５０７ ２０１２０５１１
总糖含量 ３６．３２％ ４１．２２％ ３８．４０％
单糖含量 １４．２４％ １０．３２％ １１．５２％
多糖含量 ２２．０８％ ３０．９０％ ２６．８８％
３ 结论
本实验中发现，实验条件对结果的影响颇为明
显，经实验考察后选择４９０ｎｍ作为测定波长，最佳
４３
２０１３年 中 国 林 副 特 产 第３期
蕨菜中亚硝酸盐含量的测定分析
刘长乐１，孙冲２
（１．黑龙江省林业科学院，哈尔滨 １５００８１；２．沈阳市林业局果树技术推广站）
摘 要：以分别来自牡丹江地区产的人工栽培和野生鲜蕨菜样品，定期取样，检测不同蕨菜在不同
的储藏条件和时间下，其亚硝酸盐含量的动态变化规律，并对其进行比较。结果表明，鲜蕨菜中的
亚硝酸盐的含量随储存时间的延长，含量不断上升，在第９日后菜中的亚硝酸盐含量有一个明显的
增加过程。长期保鲜的蕨菜要比新鲜蕨菜中所含亚硝酸盐量高。人工栽培菜和野生菜的亚硝酸盐
增加趋势大体相同，但人工栽培菜中亚硝酸盐含量的增幅要略大于野生菜的增幅。
关键词：蕨菜；亚硝酸盐；贮藏
蔬菜长期贮存尤其是室温贮存时，硝酸盐可大
量转变为亚硝酸盐，而腌渍时菜中的硝酸盐可被细
菌还原成亚硝酸盐，喂养动物后使动物的血红蛋白
变成高铁血红蛋白而中毒。同时微生物和酶对蔬
菜、肉类等食物中蛋白质、多肽和氨基酸的降解作
用，致使这些食物中存在一定量的胺类物质如二级
胺和三级胺，这些胺类物质与亚硝酸盐在一定条件
下合成 Ｎ－亚硝基化合物，简称亚硝胺。１９５６年
Ｍａｇｅｅ将含有５０ｍｇ／Ｌ的二甲基硝胺的饲料喂养大
鼠一年，几乎全部发生肝癌，揭示了亚硝胺类物质的
致癌性。亚硝胺是强致癌物，国内外流行病学调查
资料表明，亚硝胺可能与人类的食管癌、鼻咽癌、胃
癌、膀胱癌发病有关，努力降低食品中的致癌性亚硝
酸盐，是预防人类肿瘤疾病及保护人类健康的有效
途径之一。因此，将其列为被测指标。
通过对在不同存贮条件下蔬菜中亚硝酸盐含量
测定，评价蕨菜中亚硝酸盐含量的指标情况。通过
对这些指标变化趋势的研究，以保证人们安全科学
的食用蕨菜，杜绝亚硝酸盐中毒现象的发生。
１ 材料和方法
１．１ 材料
１．１．１ 原料。蕨菜：牡丹江地区产人工栽培鲜蕨
菜、野生鲜蕨菜。
１．１．２ 实验试剂
（１）０．４％对氨基苯磺酸溶液：称取０．４ｇ对氨
基苯磺酸溶于１００ｍＬ ２０％盐酸中，避光保存。
（２）０．２％盐酸萘乙二胺溶液：称取０．２ｇ盐酸
萘乙二胺，以水定容１００ｍＬ，避光保存。
（３）氢 氧 化 铝 乳 液：溶 解 １２５ｇ 硫 酸 铝 于
１０００ｍＬ重蒸馏水中，使氢氧化铝全部沉淀（液呈微
碱性），用蒸馏水反复洗涤，真空抽滤，直至洗液分别
用氯化钡，硝酸银检验不发生混浊为止。取下沉淀
物，加适量重蒸馏水使呈稀浆糊状，捣匀备用。
（４）果蔬提取剂：５０ｇ氯化镉与５０ｇ氯化钡溶于
１０００ｍＬ重蒸馏水中，用浓盐酸（２ｍＬ左右）调整ｐＨ
值为１
櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐
。
水解条件为酸用量１５ｍＬ、水解时间４０ｍｉｎ，最佳显
色条件为显色剂用量２．５ｍＬ、显色时间７ｍｉｎ。方法
学考察结果显示：稳定性、重现性、精密度等均在规
定范 围 内，平 均 加 样 回 收 率 ９９．４７％，ＲＳＤ＝
１．６８％。该方法操作简便，测定结果准确，重复性
好，可用于红松松塔多糖含量测定。
参 考 文 献
［１］ Ｓａｋａｇａｍｉ Ｈ，Ｔａｋｅｄａ Ｋ，ＭａｋｉｎｏＹ，ｅｔ ａｌ．Ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉ－
ｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ（ｓ）
ｆｒｏｍ ｈｏｔ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐｉｎｅ ｃｏｎｅ［Ｊ］．Ｊｅｐ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９８６，７７（１）：５９－６１．
［２］ 王智航，张永红，于婉婷，等．红松松塔、松子壳研究进
展及在畜牧业中应用可行性分析［Ｊ］．国外畜牧学———
猪与禽，２００９，２９（４）：８８－８９．
［３］ 刘光明，吕永俊，周萍，等．松属植物的松塔、松子壳药
用开发［Ｊ］．大理学院学报，２００７，６（１２）：７８－８０．
［４］ 李卫彬，阳文辉，黄锁义，等．当归总糖还原糖和多糖的
含量测定方法探讨［Ｊ］．微量元素与健康研究，２００８，２５
（３）：４６－４７．
作者简介：冯雪（１９８７－），女，山东人，在读硕士研究生，
研究方向为中药制剂现代化，Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｅｎｇｘｕｅ．ｄｅ＠１６３．ｃｏｍ；
＊通讯作者：张曜武（１９５５－），男，山东人，副教授，硕士研究
生导师，研究方向为中药制剂现代化，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｗ９８３３＠１６３．
ｃｏｍ。
５３
第３期（总第１２４期） 中 国 林 副 特 产 Ｎｏ．３（ＧＳＮＯ．１２４）
２０１３年６月 Ｆｏｒｅｓｔ Ｂｙ－Ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ ｉｎ Ｃｈｉｎａ Ｊｕｎ．２０１３