全 文 ：收稿日期:2003-09-25
应用均匀设计法优化喜树果乙醇渗漉工艺条件
黄瑞松1 ,胡秋萍2 ,陈燕军3 ,孔桂豪1
(1 中国中医研究院广西民族医药研究所 ,广西 南宁 530001;2 广西中医学院 ,广西南宁 530001;
3 中国中医研究院中药研究所;北京 100700)
摘要:目的:优化喜树果乙醇渗漉提取工艺条件。 方法:应用均匀设计法考察乙醇浓度(X1)、渗漉速度(X2)、漉液收集量
(X3)对喜树碱提取得率的影响。结果:喜树碱得率与乙醇浓度及漉液收集量成正比 , 与渗漉速度无关。 最佳工艺条件为:以
80%乙醇作溶剂 ,渗漉速度为 6ml·min-1·kg-1 ,收集漉液量为 8 倍药材量。结论:优化的最佳提取工艺条件是科学的 ,喜树碱得
率较高。
关键词:喜树果;喜树碱;均匀设计;最佳工艺条件
中图分类号:R283.6 文献标识码:B 文章编号:1005-9903(2004)02-0012-03
喜树果为蓝果树科(洪桐科)植物喜树 Campto-
theca acuminata Decne.的干燥成熟果实。本品有抗
癌 ,散结 ,破血化瘀之功 。喜树主要含生物碱 ,其中
喜树碱以果实含量最高[ 1] 。动物试验表明 ,喜树碱
具有显著的抗肿瘤活性[ 2] 。广西昌弘制药有限公司
根据广西民间用药经验 ,利用喜树果配伍其它中草
药 ,研制成中草药制剂复生康胶囊 ,用于治疗胃癌 、
肝癌有较好疗效。复生康胶囊制备工艺中 ,根据喜
树碱的特性 ,我们采用乙醇渗漉提取法提取喜树果
药材 ,并采用均匀设计法优化提取工艺条件 ,取得满
意效果。
1 仪器与材料
1.1 仪器 LC-8A高效液相色谱仪 , SPD-6AV可见
一紫外光检测器 ,C-R4A色谱处理机(均为日本岛津
公司)。
1.2 材料 喜树碱 ,中国科学院上海药物所提供
(含量>98%)。喜树果购于南宁市医药总公司 ,产
地广西 ,经鉴定符合广西中药材标准 1990年版“喜
树果”项下规定。高效液相流动相所用甲醇为优级
纯 ,水为重蒸水 ,其它化学试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 提取溶剂的选择 喜树果主要含喜树碱 、10-
羟基喜树碱 、11-羟基喜树碱 、10-甲氧基喜树碱 、11-
甲氧基喜树碱 、脱氧喜树碱 、喜树次碱等。其中喜树
碱可溶于乙醇 、氯仿 。用乙醇提取 , 对药材渗透力
强 ,溶剂回收方便 ,对人体比较安全 ,且喜树果的醇
提物有抗癌的药理作用[ 2] 。故喜树果采用乙醇作为
提取溶剂。
2.2 提取方法的确定 据文献资料报道 ,喜树碱遇
光易氧化 ,使毒性增大;遇热易破坏 ,使疗效降低[ 2] ,
提取时宜低温避光进行。有报道喜树果粉用80%乙
醇渗流提取[ 1] 。故本研究采用乙醇渗漉提取喜树
果 。
2.3 试验设计 喜树果用乙醇渗漉提取 ,影响喜树
碱得率的因素可能有乙醇浓度 ,漉速及漉液收集量 。
为此 ,我们采用均匀设计法对乙醇渗漉提取喜树果
工艺条件进行研究 ,条件设计为三因素三水平 。见
表 1。
表 1 乙醇渗滤提取喜树果的因素水平设计
因素 水平
乙醇浓度(X1) % 60 70 80
漉速(X2) ml·min-1·kg -1 2 4 6
漉液收集量(X3) 倍药材量 4 6 8
因喜树果的主要有效成分为喜树碱 ,故选择喜
树碱得率 Y(%,喜树碱/药材)作为考核指标。根据
拟水平法 ,选择均匀设计 U＊6 (64)表 1 、2.3列安排试
验[ 4] 。见表2。
2.4 提取方法 喜树果药材粉碎成最粗粉(过 10
目筛),称取 100g ,加入一定浓度乙醇 160ml ,拌匀 ,密
闭 1h ,移至渗漉筒内 ,压紧 ,上面放一张滤纸 ,上压
玻珠数粒 ,缓缓加入乙醇至高于药面 2cm ,浸渍 24h ,
以一定漉速渗漉 ,收集一定体积漉液 ,即得 。
2.5 喜树碱含量测定
2.5.1 供试品溶液的制备 分别精密吸取上述 2.4
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第 10卷第 2 期
2004年 4 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol.10 , No.2
Apr., 2004
DOI :10.13422/j.cnki.syf jx.2004.02.006
的渗漉液 1ml置 10ml量瓶中 ,各加相应浓度乙醇至
刻度 ,摇匀 ,即得 。
2.5.2 对照品溶液的制备 精密称取喜树碱对照
品12.94mg ,置 200ml 容量瓶内 ,加甲醇至刻度 ,摇
匀 ,分别精密吸取 0.5 、1.0 、1.5 、2.0 、2.5ml ,置 25ml
容量瓶中 ,加甲醇至刻度 ,摇匀 ,即得。
2.5.3 色谱条件 色谱柱:shim-pach CLS-ODS 柱
(6.0×150mm);流动相:甲醇-水(53∶47),流速:0.8ml
·min-1;检测波长:254nm;柱温:室温。
2.5.4 线性关系 精密吸取上述对照品溶液各
10μl分别进样测定 ,以进样量为 X 轴 ,峰面积为 Y
轴 ,绘制标准曲线。回归方程为:Y =214413.592X -
1699.8669 , r=0.9999。喜树碱在 0.0605 ～ 0.3020μg
之间与峰面积呈良好线性关系 。
2.5.5 样品测定 精密吸取对照品溶液(3.882μg/
ml)与供试品溶液各 10μl ,分别进样测定。结果见表
2。
表 2 乙醇渗漉提取喜树果均匀设计及试验结果
No X1 % X2 ml·min-1·kg -1 X3 倍 Y %
1 60 2 6 0.0548
2 60 4 8 0.0768
3 70 6 4 0.0659
4 70 2 8 0.1091
5 80 4 4 0.0872
6 80 6 6 0.0959
2.6 回归与优化分析 将表 2的数据输入微机 ,进
行多元逐步回归处理 ,得到回归方程:Y′(Y′为理论
值 ,Y 为实测值)=-7.515675×10-2 +1.425393×
10
-3
X 1 +1.378933 ×10-4 X1 X3 , R =0.9512 , S =
7.9290×10-3 ,F =14.2458>F 2, 3(0.05)=9.55 ,表明
回归方程可信。
回归方程表明 ,在本试验条件下喜树碱得率
(Y′)与漉速(X2)无关 ,与乙醇浓度(X1)及漉液收集
量(X3)成正比 。
应用网络法[ 5] 进行优化处理 ,令 Y′>0.07 ,G=
5时 ,可得到 18组优化结果 ,详见表 3。
由表 3可知 ,同一漉液收集量 ,乙醇浓度不同 ,
喜树碱得率差别较大 ,80%的乙醇得率最高;同一乙
醇浓度 ,漉液收集量不同 ,喜树碱得率差别亦较大 ,
收集 8倍药材量的漉液得率最高:因喜树碱得率 Y
与流速X 2无关 ,选择较快的漉速 ,可缩短渗漉时间 ,
提高生产效率。综上所述 ,最佳生产条件应为:以
80%乙醇作溶剂 ,渗漉速度为 6ml·min-1·kg-1 ,收集
漉液量为 8倍药材量。
表 3 乙醇渗漉提取喜树果工艺条件优化结果
No.X1(%) X3(倍) Y′(%) No.X1(%) X3(倍) Y′(%)
1 60 8 0.0766 10 75 5 0.0835
2 65 6 0.0713 11 75 6 0.0938
3 65 7 0.0802 12 75 7 0.1041
4 65 8 0.0892 13 75 8 0.1145
5 70 5 0.0729 14 80 4 0.0830
6 70 6 0.0825 15 80 5 0.0940
7 70 7 0.0922 16 80 6 0.1051
8 70 8 0.1018 17 80 7 0.1161
9 75 4 0.0731 18 80 8 0.1271
2.7 验证试验 称取喜树果最粗粉 5000g ,加 80%
乙醇8000ml拌匀 ,密闭 1h ,装入渗漉筒中 ,加入 80%
乙醇浸过药面数 cm , 浸渍 24h , 开始渗漉 , 准速为
30ml·min-1 ,收集源液量为 40000ml。参考上述方法
制备供试品溶液 ,并进行测定。结果喜树碱得率 Y
=0.1195%,实测值 Y 与理论Y′接近 ,说明优化条件
符合实际生产情况。
2.8 喜树果药材含量测定 取喜树果粗粉(过 40
目筛)约 0.1g ,精密称定 ,置 50ml 锥形瓶中 ,加 80%
乙醇置 50℃水浴温浸 2次(25 ,25ml),每次 30min ,不
时轻轻振摇 ,滤过 ,滤液转移置 50ml量瓶中 ,加 80%
乙醇至刻度 ,摇匀。精密吸取 10μl进样 ,参照上述
2.5.3条件测定 。结果喜树果药材中喜树碱含量为
0.1384%。
3 讨论
喜树果体积较小(一般长 2 ～ 2.5cm , 宽 0.5 ～
0.7cm),粉碎时不宜过细 ,以免堵塞孔隙 ,妨碍溶剂
通过。我们曾将完整的喜树果及粉碎成最粗粉的药
材分别用相同的条件进行渗漉 ,得到的渗漉液进行
喜树碱含量测定 ,结果完整果实得率为 0.0833%,最
粗粉得率为 0.1195%,后者明显高于前者。故试验
中投料药材粉碎为最粗粉 。
试验结果表明 ,在本试验条件范围内喜树果最
粗粉用乙醇渗漉提取 ,喜树碱的提取得率与乙醇的
浓度及漉液的收集量成正比 ,与渗漉速度无关 。经
回归方程进行区间优化 ,得到 18组优化结果。乙醇
浓度与漉液收集量对喜树碱的得率均影响较大 ,喜
树碱以的 80%乙醇渗漉 、收集漉液为 8倍药材量得
率最高;喜树碱的得率虽然与漉速无关 ,但从缩短渗
漉时间 、提高生产效率出发 ,应选择较快的漉速进行
渗漉 。故以 80%乙醇作为提取溶剂 、渗漉速度为
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2004年 4 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol.10 , No.2
Apr., 2004
6ml·min-1·kg-1 、收集漉液为 8倍药材量作为最佳提
取条件。以此条件进行验证 ,结果证实喜树碱提率
的实测值 Y 与理论值Y′接近 ,说明优化条件符合实
际生产情况。
经测定 ,试验所用的喜树果药材喜树碱含量为
0.1384%,验证试验最佳提取条件渗漉提取液的得
率为 0.1195%,喜树碱含量从药材到提取液转移率
为86.34%,说明本提取工艺能提取得到喜树果中的
大部分喜树碱成分 ,提取工艺是科学合理的。
参考文献:
[ 1] 徐任生 , 赵志远 ,林隆泽 ,等.抗癌植物喜树化学成分的
研究 , Ⅱ .喜树果中的化学成分[ J] .化学学报 , 1977 , 35
(3 , 4):193.
[ 2] 国家医药管理局中草药情报中心站.植物药有效成分
手册[ M] .北京:人民卫生出版社 , 1986.166.
[ 3] 唐明珠.光和热对喜树碱含量测定的影响[ J] .药学通
报 , 1983 , 18(1):8.
[ 4] 方开泰.均匀设计与均匀设计表[ M] .北京:科学出版
社 , 1994.69.
[ 5] 夏念凌.最优化问题的计算机实用算法[ M] .北京:水利
电力出版社 , 1990.11.
收稿日期:2003-05-28
从人参果肉中提取人参皂苷-Re工艺的研究
刘继华 ,卢 丹 ,刘金平 ,李平亚
(吉林大学再生医学研究所 ,吉林 长春 130021)
摘要:目的:建立从人参果肉中分离人参皂苷-Re 的方法。方法:利用 D4020 大孔吸附树脂吸附人参果总皂苷 , 分别以水 、
2%NaOH和 90%乙醇洗脱 ,收集乙醇洗脱液 , 回收乙醇 ,静置沉淀 , 得到人参皂苷-Re。结果:所得产品的含量达到 50%以上。
结论:以本法提取分离人参皂苷-Re ,方法简便易行 , 为进一步将人参皂苷-Re 开发为新药奠定了基础。
关键词:人参皂苷-Re;大孔吸附树脂;高效液相色谱法
中图分类号:R283.6 文献标识码:B 文章编号:1005-9903(2004)02-0014-03
人参果为五加科植物人参 Panax ginseng C.A.
Mey.的果实 ,秋季采收 ,除去果核 ,晒干 ,即得人参果
肉。人参果肉中含有大量的人参果总皂苷 ,人参皂
苷-Re 为其中的活性成分。据报道 ,给 37例高血糖
患者服用人参果总皂苷 ,2个月为 1疗程 ,治疗组空
腹血糖下降率为 62.1%,采用双盲法服用安慰剂的
对照组治疗前后的血糖值无明显差异[ 1 ～ 2] 。本课题
组研究证明 ,人参果中的人参皂苷-Re 具有降低高血
糖模型大鼠血糖的作用 ,为了进一步将人参果肉开
发为治疗糖尿病的新药 ,本文探讨了从人参果肉中
提取分离人参皂苷-Re 的工艺[ 3～ 4] 。
1 仪器与试药
Waters 600E 高效液相色谱仪;岛津 UV-1601PC
分光光度计;D101 、D4020 、AB-8大孔吸附树脂(天津
南开大学化工厂);人参皂苷-Re对照品(中国生物制
品检定所);人参果肉(吉林省靖宇第一参厂);试剂
均为分析纯 。
2 方法与结果
2.1 含量测定方法学实验 本文以高效液相色谱
法测定人参皂苷-Re 的含量。检测条件:ODS色谱柱
(4.6m×250mm),流动相为乙腈-磷酸(0.05%)(100∶
400)[ 5] , 流速为 1.0ml/min , 检测波长 203nm , 柱温
40℃。进样量为 10μl。
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷-Re
对照品 13mg ,置 50ml量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至
刻度 ,摇匀 ,即得(每 1ml含人参皂苷-Re 0.26mg)。
2.1.2 测定波长的选择 经岛津 UV-160 IPC 分光
光度计扫描 ,人参皂苷-Re 甲醇溶液在波长 203.8nm
波长处有最大吸收 ,故选定测定波长为 203nm。
2.1.3 线性关系考察 精密量取人参皂苷 Re 对照
品溶液(0.26mg/ml)2 、4 、6 、8 、10 、12 、14μl进样 ,以对
照品峰面积为纵坐标 ,对照品的量为横坐标 ,绘制标
准曲线 , 回归方程为 Y =767791.6X +8238.7 , r =
0.99992。结果表明 ,在 0.52 ～ 3.64μg 范围内二者呈
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2004年 4 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol.10 , No.2
Apr., 2004