全 文 ：实验研究
土槿皮乙酸体外对前列腺癌 PC-3细胞增殖的抑制作用及机制
程文龙 1, 2 ,李晨光 1 ,马武男 2 ,张志龙 2 ,冉金生 2 ,苏书光 2
(1辽宁医学院附属第一医院 ,锦州 　121001;2北京市通州区老年病医院 ,通州　 101100)
　　摘　要　目的:研究土槿皮乙酸(PAB)对人雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)PC-3细胞系增殖的抑制作用及其可能机制。方
法:体外培养 AIPCPC-3细胞 , 以不同浓度 PAB进行处理一段时间后 , 再用 MTT法测定 PAB对 PC-3细胞的生长抑制情况;用台盼
蓝染色计数活细胞 , 用吉姆萨染色法检测凋亡细胞 , 进一步用 Hoechst33342染色进行凋亡确认;用 PI染色法检测 PAB对 PC-3细胞
周期的影响;用考马斯亮兰 G-250染色法检测 PAB对细胞质蛋白的影响;用荧光双染法检测细胞微管蛋白表达。结果:PAB明显抑
制体外培养的 PC-3细胞生长 ,其抑制率在一定浓度和时间范围内呈依赖关系 , 作用 36h的 IC50值为 6.20μM。 PAB可以通过诱导
PC-3细胞凋亡而抑制期增殖 ,凋亡细胞的数量随 PAB浓度的增加而增加。 PAB能明显增加 PC-3细胞时 G2期细胞的比例 , G1期和
S期细胞数减少 , 细胞周期的变化与 PAB浓度相关。 PAB可以减少 PC-3细胞胞质内蛋白含量 ,抑制微管蛋白形成。结论:PAB可
以抑制 AIPCPC-3细胞增殖 ,阻滞细胞于 G2/M期(M晚期),呈浓度依赖性;机制可能与 PAB降低胞质蛋白量 , 抑制微管蛋白形成
有关。
　　关键词　土槿皮乙酸;PC-3细胞;微管蛋白
　　前列腺癌占美国男性新增肿瘤例数的首位 , 达 25.00%,
2008年美国男性新增肿瘤死亡病例中位居第三位 [ 1] 。在 2009
年 2月的第 297号世界卫生组织实况报道中按全球死亡人数排
序 , 前列腺癌位居男性肿瘤的第六位。中国仍是前列腺癌的低
发国家 , 但近年来发病率却稳步升高 , 中国前列腺癌患者有逐
年增加的趋势 [ 2] 。前列腺癌发病隐匿 , 所以大部分前列腺癌检
出时已属中晚期。中晚期前列腺癌常发生前列腺周围侵犯或
远处转移 , 其临床治疗效果常常不能令人满意 , 进展至雄激素
非依赖性前列腺癌(AIPC)预后更差 [ 3] 。在目前一段时间内细
胞毒性药物仍是肿瘤药物治疗的主体 , PAB是从松科植物金钱
松根皮———土槿皮中分离得到的一种二萜酸化合物 , 具有抗真
菌 、抗生育 、抗肿瘤 、止血及胆囊自截等临床疗效 , 药理学研究及
体内外实验均证实 PAB具有广泛的抗肿瘤活性 ,能有选择的抑
制有活力的增生的肿瘤细胞 , 而对发育缓慢的正常细胞影响
小 [ 4] , 活体无明显毒性。 PAB作为细胞外信号分子 , 作用于细
胞后其受体和信号转导的过程 , 以及如何启动细胞凋亡基因表
达等值得进一步研究 。PAB对人泌尿系肿瘤的作用鲜有报道 ,
对 AIPCPC-3细胞的作用研究未见报道。我们以 AIPCPC-3细
胞株为靶细胞 , 观察不同浓度的 PAB在体外对该细胞增殖的影
响及细胞形态变化 , 并对该药物抗肿瘤作用机制进行初步研
究 , 为 AIPC的临床化疗提供实验依据。
1　材料与方法
1.1　试验药物　 土槿皮乙酸(PseudolaricacidB, PAB)批号:
110880-200502,纯度 > 98%,购于上海博蕴。
1.2　 细胞株　人雄激素非依赖性前列腺癌 PC-3细胞株(hu-
manAIPCPC-3), 中科院上海生命科学研究院细胞库。
1.3　 试剂　胎牛血清(FBS)购于杭州四季青;RPMI1640培
养基 、胰蛋白酶 、二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、
Hoechst33342、碘化丙啶(PI)、RNA酶 、吉姆萨染料和埃文斯蓝
均为 Sigma公司产品;兔抗微管蛋白抗体 、FITC标记的山羊抗
兔抗体购于北京博奥森。
1.4　仪器　二氧化碳培养箱为美国 Forma公司 , 显微镜均为
日本 Olympus产品 ,流式细胞仪为美国 B.D.公司。
1.5　方法　PC-3细胞培养于 37℃、 5%CO2 饱和湿度培养箱
内 ,培养基系含有 1.5g/L碳酸氢钠 、 4.5g/L葡萄糖 、 10mM
HEPES、1.0mM丙酮酸钠 、 20mML-谷氨酰胺 、 10%胎牛血清 、
200u/ml庆大霉素 、1ml/LDMSO的 RPMI1640培养基 , 每 2天
更换培养液一次。细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分(约
70%)表面时 ,用 0.25%胰蛋白酶消化 , 1:2 ～ 1:5传代。
1.5.1　MTT法测定 PAB对 PC-3细胞生长的影响　取对数生
长期的 PC-3细胞制成细胞混悬液 , 计数 , 调整细胞浓度为 2 ～ 4
×105 /ml, 接种在 3块 96孔培养板内(每板取 6×6孔), 每孔
100μl。培养 24h细胞贴壁后。每板培养孔都随机分成 6组 , 分
别换成含不同浓度 PAB(0.0、0.1、0.4、 1.6、 6.4和 25.6μM)的
培养基 ,其中 PAB浓度 0.0μM组为对照组;另取未接种细胞的
6孔为空白组 , 只加培养基 ,继续培养。分别在 24h、36h及 48h
后 ,弃培养液 , 每孔加 0.5mg/mlMTT溶液(PBS配制)100μl,
37℃孵育 4h, 弃上清 ,每孔加入 DMSO150μl溶解甲月替颗粒 , 轻
振荡溶解。用酶标仪 ,参考波长 450nm, 检测波长 570nm条件下
测定光密度(OD)值。 用公式计算 PAB对细胞的抑制率(IR),
对抑制率参照浓度和时间进行双因素方差分析 , 并作抑制率曲
线图 ,抑制率 =(对照组平均 OD值 -实验组平均 OD值)/(对
照组平均 OD值 -空白组平均 OD值)×100%。根据 IR曲线
图 ,选择有 IR值达到 50%的时间段 ,缩小 PAB浓度梯度 ,进行
再次检测 ,并估算该时段的抑制率与浓度的曲线方程 ,计算半数
抑制率浓度(IC50)值。
1.5.2　台盼蓝 、吉姆萨和考马斯亮兰 G-250染色观测 PAB对
PC-3细胞生长及分裂的影响　取对数生长期的 PC-3细胞制成
细胞混悬液 ,计数 , 调整细胞浓度为 3 ～ 5×105 /ml, 接种于 4块
24孔培养板内 ,每孔 1ml。培养 24h后 , 每板中的培养孔均随机
分成 6组 , 分别换成不同浓度的 PAB(0.0、0.8、1.6、3.2、6.4和
9中药药理与临床 2011;27(1)DOI :10.13412/j.cnki.zyy l.2011.01.043
12.8μM)培养基 1ml,其中 PAB浓度 0.0μM组为对照组 , 继续
培养。分别在培养 24h、32h、 40h、 48h后 , 各随机取出一块培养
板 , 台盼蓝染色 ,显微镜下取细胞多 、中 、少 3个区域各 1区计数
拒染细胞数。台盼蓝拒染计数后 , 随机从 6组培养孔中各取 2
个培养孔 , PBS洗 3遍 , 每次 5min,甲醇 /冰乙酸(V:V, 3:1)固定
15min, 室温吉姆萨染色 30min冲净后 , 显微镜下选择细胞密度
多 、中 、少 3个区域各 1区 ,观察细胞分裂情况 , 照相 , 并计数凋
亡细胞数。取上述第 48h的未经吉姆萨染色的培养孔 , PBS洗
3遍 ,每次 5min, 每孔加含 4%多聚甲醛 、 2%戊二醛的固定液
1ml,固定 15min。蒸馏水漂洗 15min, 冲洗 2次 , 于培养孔内加
考马斯亮兰 G-250染液染色 60min。再冲洗 2次后 , 每孔加甲
醇:冰乙酸:蒸馏水(V:V:V, 46.5:7:46.5)2ml, 于倒置显微镜
下观察 , 见细胞质内微丝 (蓝色)渐明显 , 背地清亮时(约
15min)终止显色 ,蒸馏水漂洗后 , 于镜下观察照相。计算:活细
胞数 =拒染细胞数-凋亡细胞数。对细胞数参照浓度和作用时
间进行双因素方差分析 , 再以时间或浓度为为横坐标 , 活细胞
数 、凋亡细胞数或细胞总数为纵坐标作图。
1.5.3　流式细胞术检测 PAB对 PC-3细胞周期的影响　取对
数生长期的 PC-3细胞制成细胞混悬液 , 计数 、调整细胞浓度为
3 ～ 5×105 /ml,接种于 3个培养瓶内 , 每瓶 4ml。培养 24h后 , 实
验组分别加入含 PAB(3.1μM和 6.2μM)培养基 ,对照组加不含
PAB的培养基 ,各 4ml,继续培养。 36h后 ,收集细胞并吹打成细
胞悬液 , 1000rpm离心 10min, 弃上清 , PBS洗涤 3次 , 每管加
70%乙醇 1ml固定 , 并吹散 , 37℃过夜。 次日 , 500rpm离心
15min弃上清 ,用含 RNA酶(50μg/ml)和 PI(50μg/ml)染液 ,于
室温避光染 15min, 上机检测。用 Modfit软件分析各时期的细
胞数 , 进行样本率比较的 检验
1.5.4　荧光双染检测 PAB对 PC-3细胞微管和细胞核的影响
　取对数生长期的 PC-3细胞制成细胞混悬液。计数 、调整细胞
浓度为 2 ～ 3×105 /ml,接种于 6孔培养板内 ,孔内预先放置盖玻
片(PBS洗), 每孔 2ml。培养 24h后 , 将培养孔随机分成 3组 ,
分别换成含 PAB(0.0μM、6.2μM和 12.4μM)培养基 ,各 2ml, 继
续培养 ,其中 PAB浓度为 0.0μM的组为对照组。继续培养 36h
后 ,培养状态下加入 10μg/ml的 Hoechst33342溶液 0.2ml, 室温
下避光染 10m后 , 弃培养液 , PBS洗;用含 4%甲醛 、 2%戊二醛
的固定液 ,室温下固定 30min, PBS洗;加 0.3% TritonX-100, 室
温 10min, PBS洗;每孔加入 5%BSA封闭液 1.5ml, 室温 30min
后 ,甩去多余液体 , 不洗。在细胞爬片上滴加 1:250已稀释的兔
抗 tubulin-α单克隆抗体 ,湿盒内置 4℃冰箱过夜;次日 , PBS洗 ,
滴加适当稀释的荧光素标记羊抗兔二抗(用 0.01%伊文氏蓝溶
液稀释), 在湿盒中 , 37℃保温 30 ～ 60min, PBS振洗 , 用 50%缓
冲甘油封片 ,立即在荧光显微镜下观察并照相。
2　结果
2.1　 PAB对 PC-3细胞的生长的抑制　抑制率呈浓度依赖性 ,
IC
50
为 6.20μM(表 1)。 PAB对 PC-3的抑制率与浓度(F(5,
10)=88.97, P=0.000)和时间(F(2, 10)=8.85, P=0.006)呈
依赖关系(图 1), 经 Bonferonni校正法进行组内 t检验 , 除 0.
1μM和 0.4μM组间的差异不具有统计学意义外 , 其它 , 各浓度
组内差异均具有显著或极显著性统计学意义;而时间组内的差
异主要来源于 48h组。 在药物作用时间为 36h时 , 拟合抑制率
(IR)与药物剂量(x)间的曲线方程 [ 5]为:IR=1-(1 +18153.
57)/(1+18153.57×exp(0.1119531×x));统计得 PAB作用时
间为 36h的半数抑制率浓度(IC50)为 6.20μM(图 2)。
　　表 1　PAB对PC-3细胞生长的抑制率(%)
时间
(h)
浓度(μM)
0　　 0.1 0.4 1.6 6.4 25.6
24 0±21.48 13.02±28.49 19.8±10.72 37.58± 6.17 48.89±16.13 58.23±17.08
36 0±4.13 7.28± 6.69 14.74±11.72 36.1± 9.16 55.32± 11.8 63.27± 2.82
48 0±20.84 19.46±16.79 35.53±27.63 51.12±16.12 56.9± 4.75 71.37± 5.09
2.2 　PAB抑制 PC-3细胞的增殖呈浓度依赖　同对照组相比
较 , 不同浓度 PAB处理后的 PC-3细胞数目明显减少 , 同时伴有
细胞体积相差增大 、变形 、变圆 ,细胞折光度减弱 , 细胞周围光晕
减弱 ,以及胞膜有泡状突起 , 台朌蓝染色未使这些细胞着色变蓝
(图 3)。经吉姆萨染色后 , 可见该类细胞的核染色质出现浓缩
及分割成块状的现象 ,胞浆较少 , 可见到双核细胞(图 4)。 考马
斯亮兰染色后 ,可见 , 随 PAB浓度的增加 , 细胞变稀疏 , 胞质密
度低 、细胞周围似浅海滩样 , 有明显的淡染区 , 胞膜表面有较多
的泡状突起(图 5)。计数未被台盼蓝着色(拒染)、折光性差 、缺
乏光晕 ,并且胞膜不光滑的细胞为凋亡细胞 , 其它拒染细胞为活
细胞。作细胞数与浓度和时间相关的统计图(图 6)。统计学分
析结果显示:PAB浓度对细胞增殖总数(F(5, 15)=42.34)、活
细胞数(F(5, 15)=76.53)及凋亡细胞数(F(5, 15)=29.41)
的影响的差异均具有极显著统计学意义(P=0.000, F0.01(5,
15)=4.56)。在浓度组内水平比较的结果中 , 与对照组相比
较 , 除 0.8μM组对凋亡细胞数的影响(P=1.000)不具有统计
学意义外 ,其余各浓度组对细胞总数 、活细胞数 、凋亡细胞数的
10 中药药理与临床 2011;27(1)
影响的差异均有极显著统计学意义;对凋亡细胞数影响的差异
主要来自 12.8μM和 6.4μM组。作用时间对细胞增殖总数目
的影响的差异具有显著统计意义(F(3, 15)=4.19, P =0.
02), 其差异主要来源于 48h组和 24h组(Boferonni校正法 , P =
0.047);作用时间对活细胞数和凋亡细胞数的影响的差异均不
具有统计学意义。
图 3　台盼蓝染色观测 PAB对 PC-3细胞生长及分裂的影响(培养 40h,
200倍)　　A:对照组;B:0.8μM。
2.3　 PAB处理的 PC-3细胞系　G2期细胞增多 , G1和 S期细
胞减少 流式细胞仪检测的细胞周期分布情况见图 7和表 2。实
验组 PC-3细胞的 G1期细胞数明显低于对照组 , 而 G2峰正好
相反。经统计学分析 , 不同浓度组的细胞周期分布的差异具有
显著的统计学意义(=1100, P=0.000), 3.1μM组与对照组(
=896.19, P=0.000)及 6.2μM组与对照组(=823.94, P=0.
000)的差异 ,均具有极显著统计学意义。 但两个实验组之间(
=2.75, P=0.253)的差异不具备统计学意义。不同细胞周期
类别之间(P=0.000)的差异均具有统计学意义。
图 7　不同浓度PAB处理 PC-3细胞 36h后的细胞周期分布图　　A:对照组;B:3.1μM;C:6.2μM。
11中药药理与临床 2011;27(1)
　　表 2　PAB对PC-3细胞的细胞周期影响的分类计数表(X2 =1100,
P=0.000)
组别 细胞周期(细胞数)G1 S G2 合计
对照 2558 1950 1133 5641
3.1μM 1267 1466 2340 5073
6.2μM 1340 1568 2333 5241
合计 5165 4624 5806 15595
2.4　 PAB抑制 PC-3细胞微管蛋白的合成　诱导 PC-3细胞凋
亡 图 8为经荧光双染的结果 ,其中的对照组细胞(A1, B1)生长
密集 、梭形 、三角形或不规则形 ,有伪足;胞核圆形或椭圆形 、核
膜完整 、界线清晰 , 可以见到分裂期细胞;胞质密度高 、不透明 ,
胞膜连续 、无突起。 而实验组(A2, B2, A3, B3)细胞稀疏 , 形态
不规则 ,体积小 , 胞核有的固缩 、有的聚集成团 、或成块状 , 胞质
少 、密度低 ,微管蛋白(绿色荧光)聚集在胞核周 , 而细胞周的微
管蛋白表达明显少(荧光淡)、透明度高 , 胞膜有小的突起。 可
以见到染色质高度盘绕 ,或被分割成块状而形成的凋亡小体 。
图 8　荧光双染检测 PAB对 PC-3细胞微管和细胞核的影响(培养 36h)
A:Hoechst33342染色;A1:对照组 400倍;A2:12.4μM 400倍;A3:6.2μM 800倍。
B:抗微管蛋白抗体荧光染色;B1:对照组 400倍;B2:12.4μM 400倍;B3:6.2μM 600倍。
3　讨论
3.1　 PAB抑制 PC-3细胞的增殖 ,诱导细胞凋亡 　本实验首先
通过随机区组实验设计 ,用 MTT法证明 PAB对 PC-3细胞具有
生长抑制作用。然后 , 通过统计学分析得出 PAB对 PC-3细胞
的生长抑制率和浓度呈依赖性的结论;由于经 PAB作用 36h
时 , 抑制率与浓度之间的线性关系较好 , 并达到了半数抑制率 ,
因此 , 进一步缩小 PAB处理时间为 36h时的浓度的梯度 , 增加
样本含量 , 拟合出 PAB处理 36h时的浓度与抑制率的曲线方
程 , 统计出该时段的 IC50为 6.20μM, 下一步的药理机制实验围
绕此浓度进行。
　　本实验设计和利用了台盼蓝的这一特性 ,首先 , 排除了 PAB
对 PC-3细胞生长抑制是因为导致了 PC-3细胞死亡 , 再进一步
通过吉姆萨染色观察细胞核的形态学改变 ,确定 PAB诱导 PC-3
细胞凋亡。镜下可见 , PAB处理过的 PC-3细胞的数目明显减
少 , 同时伴有细胞体积改变 、变形 、变圆 , 细胞折光度差 , 细胞周
围的光晕减弱 , 胞膜有泡状突起 , 染色质浓缩 、聚集及分割成块
状的等细胞凋亡现象。经 Hoechst33342染色结果与吉姆萨染
色结果相似 , 但细胞核的形态更清晰 , 进一步确认 PAB可能具
有诱导 PC-3细胞的凋亡的作用。镜下计数一定视野内的活细
胞和凋亡细胞数 , 再计算两者的和作为总细胞数(无死细胞)。
以 PAB的作用时间和浓度为处理因素作方差分析。统计学结
果显示:PAB浓度对细胞增殖总数 、活细胞数及凋亡细胞数的影
响的差异均具有极显著统计学意义 , 浓度组内比较时差异的统
计学意义十分明显;而作用时间只对细胞增殖总数的影响的差
异具有显著统计意义 ,其差异主要来源于 48h组和对照组之间;
作用时间对活细胞数和凋亡细胞数的影响的差异均不具有统计
学意义。以上结果的原因可能是时间组的范围较小。
3.2　 PAB的 G2/M晚期阻滞和微管蛋白抑制作用　参与细胞
周期调控的核心分子主要涉及 3组蛋白质 ,即周期素(cyclin),
周期素依赖蛋白激酶(CDK)和 CDK抑制物(CKI)。 M期的驱
动器为有丝分裂促进因子(MPF), MPF在细胞周期过程中的活
性主要受 cyclinB的波动而改变。 cyclinB1的持续性合成导致
其蛋白水平自 S期渐渐线性升起 ,并通过 G2期 , 在分裂早期达
到高峰。G2期检查点负责检查 DNA复制是否完成 , 如果完成
DNA复制 , 则 MPF获得活性 , 而进入 M期 ,到分裂结束时 cyclin
B1分解速度突然加快 ,此后细胞进入有丝分裂后期和胞质分裂
期。流式细胞仪检测 PAB处理对 PC-3细胞周期分布情况的影
响发现 ,实验组的 G1期细胞数明显低于对照组 , 而 G2期细胞
较多 ,可以认为 PAB具有细胞周期阻滞的药理活性 , 使 PC-3细
胞阻滞在 G2/M期。 2007年 YuJH等 [ 5]证实 PAB可以增加周
期蛋白 B1(CyclinB1)的表达 , 提高 CyclinB1从胞浆向核内转
运 , 并阻止核内的 CyclinB1降解 , CyclinB1是作为分裂阻滞诱
导的标志被上调。由此可以推出 , PAB诱导细胞周期阻滞主要
不是在 M期的早期阶段。
　　实验结果显示:随 PAB浓度的增加 PC-3细胞的胞浆染色
变淡 ,在细胞周围形成类似浅海滩样的淡蓝染区 , 表明 PAB处
理的 PC3细胞胞浆内蛋白含量可能降低。其首要意义是放大了
WesternBlot检测的蛋白含量在单细胞中的变化强度;另外 , 由
于胞浆内蛋白显色 ,使胞膜表面的泡状突起更加明显 , 进一步验
证了 PC-3细胞凋亡;重要的是这表明了 PAB可能具有抑制 PC-
3细胞胞浆内蛋白合成或促进胞浆内蛋白降解的作用。
12 中药药理与临床 2011;27(1)
　　微管 、微丝是胞质内重要的蛋白成份。 为了进一步分析
PAB的药理机制 ,实验通过抗微管蛋白抗体免荧光法进行染色
观察 PAB对微管蛋白的影响。实验结果显示:PAB处理后的
PC-3细胞变大变圆 , 胞质少 、密度低 , 绿色荧光淡 、主要聚集在
细胞中部 , 细胞周边透明度增高 。说明经过 PAB的处理 , 细胞
内微管蛋白含量明显减少 , 并出现了微管聚集。胞质分裂发生
在细胞分裂后期姐妹染色单体分离之后 , 是细胞分裂的晚期阶
段 , 负责染色体组分向 2个子细胞中平均分配 , 也负责胞质组
分和细胞器向 2个子细胞中分配以及 2个子细胞的分离 , 微管
骨架在分裂沟的定位和起始过程中起重要作用 , 而微丝骨架在
分裂沟起始和内缩过程中将起重要作用 , 只有在二者的协调作
用下 , 胞质分裂才能正常完成 [ 6] 。 吉姆萨染色后 , 可见 PAB作
用后的 PC-3细胞出现了较多的双核 、甚至多核细胞 , 而其细胞
总数却比对照组少 , 说明这不是分裂增生活跃的表现 , 而是细胞
分裂受到抑制。有的 PC-3细胞的胞核在 PAB处理后有所增
大 , 这可能与胞质分裂期阻滞 , 胞核未分配或未平均分配有关;
而细胞大小差异的增大 ,也可能是由于胞质分裂期细胞核以外
的其它成份分配不均所致。由此可以推出:导致 PAB处理后的
PC-3细胞阻滞于 G2/M期的原因可能是 PAB抑制了细胞骨架
(微管 、微丝)蛋白 ,进而导致了 M的晚期(胞质分裂期)阻滞。
　　2005年 WongVK等 [ 4]发现 PAB可以使细胞的微管网络分
裂并且抑制有丝分裂纺锤体的形成 ,或者直接与微管蛋白作用 、
打断有丝分裂纺锤体和微管而导致微管失稳。 2006年 TongYG
等 [ 7]发现 PAB显著打断 HMEC的细胞骨架 , 产生微管网络的弥
散并增加肌动蛋白张力丝 , 有丝分裂和间期的微管都在 10μM
的 PAB处理 24h后消失 , 并形成细胞间的裂隙和细胞膜起泡 ,
导致细胞形态球形化 。本次实验结果与之一致。
　　目前 , PAB与微管蛋白的结合位点尚不确切 , WongVK
等 [ 4]认为:PAB可以通过作用于秋水仙素位点而与微管蛋白相
互作用 , 但也不除外微管蛋白存在其它的 PAB结合位点。以上
分析结果表明:PAB是一种以微管蛋白为分子作用靶点的细胞
周期抑制剂 ,可能抑制细胞的胞质分裂期。对 PAB与微管蛋白
作用的机制还有待于深入研究 , 这对于发掘 PAB抗肿瘤作用 ,
寻找前列腺癌化疗新药具有十分重要的意义。
　　PAB的具有广泛的抗肿瘤活性 , 可以促进 HIF-1α的降解 ,
抑制与肿瘤血管生成相关的关键途径 ,促进肿瘤细胞凋亡 、抑制
细胞骨架和 G2/M期阻滞 , 因此 ,可以避免单一抗癌机制药物的
不足 。PAB作为一种对活体无明显毒性的天然产物 ,对其药理
机制进行深入研究 ,有望促进 PAB成为新型的抗肿瘤药物 [ 8] 。
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InhibitionsofpseudolaricacidBonprostatecarcinomaPC-3 celsanditsmechanism
ChengWenlong1 , 2 , LiChenguang1 , MaWunan2 , ZhangZhilong2 , RanJinsheng2 , SuShuguang2
(1 ThefirstAffiliatedHospitalofLiaoningMedicalUniversity, Jinzhou　 121001;2 TongzhouGeriatricHospital, Tongzhou　101100)
　　Objective:ToinvestigatetheinhibitoryeffectofpseudolaricacidB(PAB)ontheandrogen-independenthumanprostatecarcinoma
(humanAIPC)PC-3cellsandthepossiblemechanismoftheaction.Methods:AIPCPC-3 Cellswereculturedinvitro, andweretreated
withvariousconcentrationsofpseudolaricacidBforsomehours.GrowthinhibitionbypseudolaricacidBwasanalyzedbyMTTassay.Typan
bluestainingwasusedtocountthenumberofnecroticcels.TheapoptoticcelsweredetectedusingGiemsastaining, andensuredbyHo-
echst33342 staining.DNAstainingwithPropidiumIodideforcelcycleanalysiswasdetectedbyflowcytometry.Theexpressionsofthepro-
teininthecytoplasmwereassessedbyCoomassiebrilliantblueG-250stainingandtheexpressionsoftubulinweredeterminedbyImmunofluo-
rescencestaining.Results:PABcansignificantlyinhibitthegrowthofPC-3 cellsincubatedinvitro, andtheinhibitionrateofPC-3celswas
showninaconcentrationandtimedependentmanneratsomeextent(P<0.01).Thehalfmaximalinhibitoryconcentration(IC50)for36
hoursisabout6.20μM.TheefectsofPABinhibittheproliferationofPC-3 cellsmaybebyinducingapoptosis, andthenumbersofapoptotic
celswereincreasedwhiletheconcentrationsadded(P<0.01).PABcanstrikinglyincreasethepercentageofthecellsinG2 phase, andde-
creasethecelsinG1andSphase(P<0.01).ThechangingofthecellcycleofPC-3celshasarelationshipwiththeconcentrationofPAB.
PABcanreducethequantityoftheproteininthecytoplasm, andinhibitthemicrotubulinespecialy.Conclusion:PABcaninhibittheprolif-
erationofPC-3cells, inducetheapoptosisofthemandblocktheytransitfromG2phaseintomitosisinaconcentrationdependentmannerat
someextent.ThereasonsoftheG2/Mblockmaybeinvolvereducingthequantityoftheproteininthecytoplasmandinhibitingthemicrotubu-
lin.
Keywords　 pseudolaricacidB(PAB);PC-3 cels;tubulin
13中药药理与临床 2011;27(1)