全 文 ：基金项目:广西教育厅科研基金资助项目 (200809MS124;
200911MS195)
作者单位:1.玉林师范学院化学与生物系 ,广西 玉林 537000;2.玉
林师范学院体育系 , 537000;3.郑州大学公共卫生学院 , 450001
作者简介:王晓平(1968—),女 ,副教授 ,主要从事药理学和生理学
研究
文章编号:1000-6486(2010)05-0379-04 【调查与研究】
用单细胞凝胶电泳技术评价五指毛桃对
辐射小鼠 DNA损伤修复作用
王晓平 1 , 　黄翔 2 , 　陆奇丰 1 , 　段丽菊 3 , 　岑业文 1
　　摘要:目的　探讨五指毛桃对辐射小鼠组织细胞 DNA损伤的修复作用。方法　6 Gy60Coγ射线全身一次性照射
建立辐射损伤模型 , 3个低 、中 、高给药 +辐射组分别灌胃给予相当于生药 5、10、 20 g· kg-1· d-1五指毛桃水提液 , 每天
1次 ,连续 7 d,阴性对照组 、单纯辐射组给予生理氯化钠溶液 ,用单细胞凝胶电泳技术检测小鼠组织细胞 DNA损伤和修
复情况。结果　各辐射 +给药组小鼠组织细胞 DNA的尾部 DNA百分率(TailDNA%)和尾矩(Tailmoment)均低于单纯
辐射组(P<0.01),且随着给药剂量的增加 , TailDNA%和 Tailmoment越低。结论　五指毛桃对辐射小鼠各组织细胞
DNA的损伤有修复作用 , 具有一定的抗辐射作用。
关键词:五指毛桃;DNA损伤;DNA修复;单细胞凝胶电泳;抗辐射作用
　　中图分类号:X591　　　　　　文献标识码:A
EvaluationofDNAdamagerepairinducedbyRadixFiciHirtaeinirradiatedmicewithsinglecelgelelectrophoresis
WANGXiao-ping, HUANGXiang, LUQi-feng, DUANLi-ju, CENYe-wen
(DepartmentofChemicalandbiology, YulinNormalColege, Yulin537000, China)
　　Abstract:Objective　ToexploretheefectofDNAdamagerepairinducedbyRadixFiciHirtaeinirradiatedmice.Meth-
ods　Themicemodelofradiationdamagewasestablishedbysinglewholebodyirradiationatthedoseof6 Gywith60Coγ-rays.
Groupsatlow, mediumandhighdosesplusradiationwererespectivelygivenaqueousextractsofRadixFiciHirtaeat5, 10and20
g· kg-1· d-1 for7 consecutivedays.Thecontrolgroupandradiationmodelgroupweregivennormalsaline.DNAdamageand
repairweredetectedbysinglecellgelelectrophoresis.Results　TailDNA%andtailmomentoftissuecellsoftheradiationplus
dosegroupswerelowerthanthoseoftheradiationmodelgroup(P<0.01).Withthedosesincreased, tailDNA% andtailmo-
mentwerereduced.Conclusions　RadixFiciHirtaecanrepairDNAdamageinducedbyradiationinmiceandhassomeanti-ra-
diationefects.
　　Keywords:RadixFiciHirtae;DNAdamage;DNArepair;Singlecelgelelectrophoresis;Anti-radiationefect
　　辐射可直接作用于机体通过产生自由基造成
DNA等生物大分子的损伤 ,从而导致各种急慢性放射
病 、遗传物质损伤甚至致癌[ 1] 。机体对辐射损伤的自
然修复是一个漫长而有限的过程 ,寻找行之有效的辐
射防护剂引起人们的普遍关注。目前 ,辐射防护剂多
为毒性较大的巯基类化合物 ,因此 ,从天然产物中寻
求和探索具有抗辐射作用的活性物质成为重要的研
究课题 。五指毛桃(RadixFiciHirtae)是华南地区广
泛使用的一种中药 ,为桑科植物粗叶榕 (Ficushirta
Vah1)的干燥根 [ 2] ,含有丰富的多糖 、生物碱 、补骨脂
素等生物活性物质[ 3] ,具有抗细菌 、抗病毒 、抑制肿
瘤 、增强免疫力等功效[ 4] 。近年来的研究还表明 ,五
指毛桃能够抑制细胞内的自由基反应 ,具有抗脂质过
氧化作用 [ 5] 。本课题以60Coγ射线照射小鼠建立辐射
损伤模型 ,运用单细胞凝胶电泳技术(SCGE),评价五
指毛桃对辐射引起的小鼠组织细胞 DNA损伤的修复
作用 ,为开发和利用五指毛桃这种天然植物 ,研究新
型抗辐射药物提供科学依据。
1　材料和方法
1.1　主要试剂和仪器　
正常熔点琼脂糖(NMA)、低熔点琼脂糖(LMA,美
国 Sigma公司);TritonX-100、十二烷基肌氨酸钠 、溴化
乙锭(EB,美国 Premega公司);淋巴细胞分离液(上海
试剂二厂);二甲基亚砜(DMSO)、乙二胺四乙酸二钠
(Na2EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)和氢氧化
钠(NaOH),均为国产分析纯。60Coγ治疗机(上海医
·379·中国职业医学　2010年 10月第 37卷第 5期　ChinOccupMed, October, 2010, Vol.37, No.5
用核子仪器厂);DYY-Ⅲ型电泳槽 、DYY-11B型三恒
电泳仪(北京市六一仪器厂);正置荧光相差生物显微
镜(日本 Olympus公司);150万相素 CCD(日本 Nikon
公司);L420台式低速自动平衡离心机(长沙湘仪离
心机仪器有限公司)。
1.2　五指毛桃水提液的制备　
五指毛桃购自玉林市中药材公司 。五指毛桃水
提液的制备参照周添浓等 [ 6]的方法略加改进:取五指
毛桃干燥药材 ,用 10倍体积的蒸馏水浸泡 1 h,加热煮
沸 3 h,趁热滤取药液;再加 8倍量体积蒸馏水 ,煮
沸 30min,合并 2次滤液 ,浓缩至相当于生药 2 kg/L。
4 ℃冰箱保存 ,用时稀释至所需浓度 。
1.3　照射条件　
用 60Coγ射线一次性全身均匀照射 ,照射量率为
182.28 cGy/min,照射野 18 cm×18 cm,源皮距为 75
cm,照射剂量为 6 Gy,在玉林市肿瘤医院放射治疗中
心进行 。
1.4　动物分组和处理　
无特定病原体(SPF)级昆明种雄性小鼠 40只 , 6
周龄 ,体质量 20 g左右 ,购自广西医科大学医学实验
动物中心。动物分笼饲养 ,自由饮食 ,自然光照 ,室内
温度 24℃,相对湿度 60%,适应性饲养 7d后 ,随机分
为 5组 ,即阴性对照组 、单纯辐射组(IR组)、辐射 +低
剂量给药组(IR+LD组)、辐射 +中剂量给药组(IR+
MD组)、辐射 +高剂量给药组 (IR+HD组),每组 8
只 。除阴性对照组外 ,给予各组小鼠 60Coγ射线 6 Gy
一次性全身均匀照射。照射后当日 ,各给药组分别灌
胃给予按相当于生药 5、10、20 g·kg-1· d-1五指毛桃
水提液 , 1次 /d,连续 7 d。阴性对照组 、IR组给予等
量生理氯化钠溶液。各组均于实验结束次日处死小
鼠 ,取肺 、肝 、睾丸 、股骨和周围血用于 SCGE实验。
1.5　单细胞悬液的制备　
将肺 、肝和睾丸组织用 37℃磷酸盐缓冲液(PBS)
冲洗 2次 ,用眼科剪剪碎 ,以一定量 PBS稀释后 ,过
滤 、收集滤液 , 1 000 r/min离心 5 min(离心半径 120
mm),弃上清液 ,重悬。取股骨 ,剔尽肌肉 ,用眼科剪
将股骨从骨干中间剪断 ,再用 2 ml注射器进行骨髓腔
冲洗 ,直到骨头发白 ,收集冲洗下的细胞悬液 ,过滤后
取滤液离心 、重悬 。周围血沿离心管内壁轻轻加在
0.2ml淋巴细胞分离液液面上 , 3 500 r/min,离心 4
min。离心后吸取中间层淋巴细胞移入离心管中 ,加
入 PBS至 2ml, 1 500 r/min离心 8 min,弃上清液 ,再
将淋巴细胞重悬于 PBS。所有细胞密度均调为 108 ～
10
9个 /L,并以台盼蓝排斥法染色观察细胞存活率。
1.6　SCGE实验　
1.6.1　铺胶 　在完全磨毛的载玻片 (75 mm×25
mm)上铺第 1层 180 μl质量分数为 1.0%的 NMA,待
其固化后铺第 2层 100 μl质量分数为 0.8%的 LMA
和细胞悬液的混合液(体积比为 5∶3),待第 2层固化
后铺第 3层质量分数为 0.5%的 100μlLMA。固化条
件均为 4℃, 10 min。
1.6.2　细胞裂解　将玻片置于碱性裂解液(2.5 mol/
LNaCl, 100 mmol/LNa2EDTA, 10 mmol/LTris-base,
1%十二烷基肌氨酸钠 ,临用前加终浓度为 1% Tri-
tonX-100, 10%DMSO, pH10.0)中 , 4℃下裂解 2h。
1.6.3　细胞 DNA解旋和电泳　将玻片置于水平电泳
槽中 ,加入新配制的电泳缓冲液(1 mmol/LNa2EDTA,
300 mmol/LNaOH, pH13.0)浸泡 20 min, 以便双链
DNA解螺旋。室温下调节缓冲液液面高低 ,于 19 V,
190 mA下电泳 20 min。随后将玻片浸入 0.4 mol/L
Tris-base缓冲液(pH7.5)中 ,中和 30min。
1.6.4　染色与观察　5 mg/L溴化乙锭染色 ,双蒸水
漂洗 , 24 h内在荧光显微镜下观察。
1.6.5　拍照与统计学分析　每只小鼠随机选择 50个
细胞进行分析 ,每组共计数 400个 。细胞图像由 CCD
拍摄 ,用 CASP彗星图像分析软件自动分析 。分析指
标为国际公认的尾部 DNA百分率(TailDNA%)和尾
矩(Tailmoment)。其中 TailDNA%为单一的彗尾强
度指标 , Tailmoment为复合指标 ,定义为彗尾 DNA百
分率和彗尾长度的乘积 。将实验测得的指标数值输
入 Origin7.0统计分析软件 ,进行双尾 t检验 ,并作图 。
2　结果
2.1　细胞活力检测　
按 1.5描述的方法 ,可以得到足够数量的肺 、肝 、
睾丸 、骨髓和血液的单个细胞 。经台盼蓝排斥法染
色 ,镜下可见:细胞呈圆形 ,形态较均一 ,且分散良好 ,
细胞存活率均在 90%以上 。显示该方法分离小鼠组
织细胞快速简便且细胞存活率高 ,可用于 SCGE实验。
2.2　五指毛桃水提液对辐射小鼠 DNA损伤的修复
作用　
各实验组 TailDNA%和 Tailmoment分别见图 1。
结果显示 ,小鼠接受 6 Gy60Coγ射线照射后 , IR组各
细胞的 TailDNA%和 Tailmoment与阴性对照组相比
均明显升高 ,差异具有统计学意义(P<0.01),提示造
模成功。各辐射 +给药组的 TailDNA%和 Tailmo-
ment均显著低于 IR组(P<0.01),且随着给药剂量的
增加 , DNA损伤修复增加 , 残余损伤逐渐减少 , Tail
DNA%和 Tailmoment逐步降低 。 IR+HD组肝 、睾丸
·380· 中国职业医学　2010年 10月第 37卷第 5期　ChinOccupMed, October, 2010, Vol.37, No.5
细胞的 TailDNA%和 Tailmoment与阴性对照组比较
差异无统计学意义(P>0.05), IR+MD组睾丸细胞的
Tailmoment与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>
0.05)。提示五指毛桃水提液能促进受辐射小鼠多组
织细胞 DNA损伤的修复。
与阴性对照组比较 , aP<0.01, bP<0.05;与 IR组比较 , cP<0.01。
图 1　五指毛桃水提液对小鼠组织细胞 DNA的影响
3　讨论
DNA是电离辐射的重要靶分子 ,电离辐射通过直
接或间接作用造成 DNA损伤 ,如碱基变化 、糖基损伤 、
单链和双链断裂 、以及 DNA和蛋白质的交联等。其
中 , DNA链断裂是辐射所致生物效应中最重要的原初
损伤 [ 7] ,被认为是启动和促进肿瘤发生发展的重要因
素 ,也成为辐射导致人类和动物多种肿瘤发生以及细
胞恶性转化的重要机制。 SCGE是 20世纪 80年代建
立的用于检测 DNA损伤和修复的敏感技术 [ 8] ,该技
术不仅能从单细胞水平上检测 DNA链断裂 ,而且可以
根据 DNA链断裂的量化指标 ,进一步分析辐照后不同
时相点 DNA残余损伤的量 ,从而揭示 DNA的修复过
程 。采用该技术 ,黄晓兰等 [ 9]研究了枸杞多糖对小鼠
睾丸细胞 DNA损伤的保护作用 ,黄洁等 [ 10]研究了石
花多糖对辐射致小鼠淋巴细胞 DNA损伤的修复作用。
本研究运用此技术检测60Coγ射线对小鼠多个组织器
官 DNA的损伤 ,评价五指毛桃水提液对 DNA损伤的
修复作用。结果显示 ,五指毛桃水提液可使辐射小鼠
肺细胞 、肝细胞 、睾丸细胞 、骨髓细胞和周围血淋巴细
胞的 TailDNA%和 Tailmoment均降低 ,表明五指毛桃
水提液能较好地促进60 Coγ射线诱发的小鼠多组织
DNA损伤的修复 ,具有一定的抗辐射作用。
中药作为辐射防护剂的研究已经取得了很大的
进展 ,经过多年的研究 ,人们发现具有清热解毒 、活血
化瘀 、补血益气 、养阴升白的中药均有不同程度的抗
辐射作用 , 其主要原理在于中药的不同组分如多糖
类 、生物碱类 、皂苷类等通过不同途径对辐射损伤产
生防护作用 [ 11] ;且中药毒性低 ,在辐射防护剂的研究
中显示出巨大的优势和潜力 。五指毛桃含有丰富的
多糖 、生物碱 、补骨脂素等生物活性物质 ,这些物质对
辐射损伤均有一定的防治作用。多糖是细胞膜的重
要组分 ,可以强化免疫细胞 ,抵抗射线对细胞膜的损
伤。 KIM等 [ 12]在细胞照射后直接进行总 DNA抽取 ,
并用琼脂电泳检测 DNA链断裂的程度 ,验证了照射
前加灵芝多糖的确对 DNA链断裂有保护作用 ,而且具
有清除羟自由基的作用。邓杨梅等 [ 13]的研究也表明 ,
螺旋藻多糖能预防紫外线诱发的 DNA损伤 ,并能促进
紫外线诱发损伤后的 DNA修复合成 ,有增强核酸内切
酶和连接酶活力的作用 。有些生物碱类物质有显著
的抗辐射作用 ,其机制可能通过提高抗氧化水平来保
护机体 ,如苦豆子总碱可增加自由基清除酶活力 ,清
除辐射过程脂质过氧化物的形成 ,提高血清中超氧化
物歧化酶 (SOD)活力 , 降低肝脏中丙二醛(MDA)水
平 ,减轻辐射对小鼠的损伤效应 [ 14-15] 。补骨脂素是
五指毛桃主要成分之一 ,能显著提高体内过氧化氢酶
活力 ,抑制细胞内自由基反应 [ 5] ,减少自由基对 DNA
链的破坏 。五指毛桃防治辐射所致 DNA损伤的机制
可能如下:①其活力成分对损伤后的 DNA具有较强的
修复能力 。某些活力因子可作为 DNA修复系统酶类
的活力基团 ,或者可提高这些酶类的活力。 ②其活力
成分可使机体 SOD等抗氧化系统酶类的活力升高 ,从
而提高清除自由基的能力 ,阻止过多的自由基氧化损
伤 DNA等生物大分子。此外 ,本课题组的研究还表明
了五指毛桃含有丰富的 Fe、Cu、Mn等微量元素 [ 16] ,这
些元素参与了酶蛋白的空间构成及作为酶的激活剂 ,
对机体内 DNA、蛋白质损伤的修复 ,清除氧自由基 ,提
高机体的免疫力具有重要作用 。
(下转第 384页)
·381·中国职业医学　2010年 10月第 37卷第 5期　ChinOccupMed, October, 2010, Vol.37, No.5
置基本为稳态噪声。与固定工作岗位工人比较 ,巡检
工人在不同巡检位置声压级可能不同 , 甚至相差较
大 ,但每个位置的声压级相对稳定。因此 ,本文观察
的巡检工接触噪声 LAeq.8h2种测量方法测量结果一
致 ,与固定工作岗位工人稳态噪声测量结果一致的报
道相符合。对巡检位置非稳态噪声的测量结果是否
一致还有待于进一步的探讨。
声级计测量易受声源的稳定性 、计时的准确性等
因素的影响 [ 5] ,其测量结果只是巡检工个体噪声接触
水平真实值的近似 ,因此当测量结果位于噪声职业接
触限值 [ 85 dB(A)]附近时 [ 6] ,应谨慎地对待测量结
果 ,不能简单地定性为超标或不超标。有条件的机构
可用个人声暴露计进行复测 ,没有条件时至少重复测
量 3次 ,取平均值进行评价 。
个人声暴露计能准确 、直接地测量出巡检工全天
累积接触噪声 LAeq.8 h,对评价巡检工个体噪声接触水
平具有重要的意义 ,但不能显示巡检工巡检路线中的
具体信息 ,如巡检工停留哪些位置 ,停留位置的环境
噪声水平以及停留时间等 。相反 ,声级计虽然存在测
量繁琐 、影响结果准确性因素多 、计算复杂等缺点 ,但
在测量过程中能充分掌握这些信息 ,而这些信息对识
别 、治理噪声危害具有重要的指导意义。如环境噪声
较高的停留位 ,可在充分调查噪声来源 、噪声性质的
基础上 ,采取相应的减振 、隔声 、吸声等降噪措施;确
因工艺 、技术等限制无法进行降噪处理的巡检位 ,可
限制巡检工在此位置的停留时间。因此 ,声级计不仅
能准确评价稳态噪声环境中流动工作岗位工人个体
噪声接触水平 ,而且在识别和控制噪声危害方面具有
一定的指导作用 。
参考文献:
[ 1] 　赵一鸣.对噪声个体暴露测量与评价的思考和探索 [ J] .中华预
防医学杂志 , 2001, 35(4):272-273.
[ 2] 　中华人民共和国卫生部.GBZ/T189.8— 2007工作场所物理因素
测量第 8部分:噪声 [ S] .北京:人民卫生出版社 , 2007.
[ 3] 　赵朔虹 ,熊俊.职业性噪声对机体体液免疫功能的影响 [ J].中国
职业医学 , 2009, 36(4):340-341.
[ 4] 　成小如 ,陈山松 ,李玉秦 ,等.两种测量方法评价稳态噪声暴露与
高频听力损伤的剂量 -反应关系 [ J] .中国工业医学杂志 , 2001,
14(5):263-265.
[ 5] 　陈山松 ,成小如 ,李玉秦 ,等.同一车间中冲压工和下料工个体噪
声暴露的测量与评价 [ J] .中国职业医学 , 2003, 30(4):6-8.
[ 6] 　中华人民共和国卫生部.GBZ2.2— 2007工作场所有害因素职业
接触限值第 2部分:物理因素 [ S].北京:人民卫生出版社 , 2007.
(收稿日期:2010-03-29　　修回日期:2010-04-26)
(上接第 381页)
　　五指毛桃的药理作用广泛 ,作为传统中草药沿用
已久 ,但未见其关于辐射修复作用的研究报道 。本研
究表明 ,五指毛桃水提液能修复辐射对机体造成的多
组织 DNA的损伤 ,为五指毛桃在抗辐射损伤作用方面
进一步的研究提供实验依据。
参考文献:
[ 1] 　朱寿彭 ,李章.放射毒理学 [ M] .2版.北京:原子能出版社 , 1992:
89-115.
[ 2] 　中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典 [ M] .北京:人
民卫生出版社 , 1997:90.
[ 3] 　刘春玲 ,魏刚 ,何健雄 ,等.五指毛桃不同采收部位挥发油及醇提
物成分的分析 [ J] .广州中医药大学学报 , 2004, 21(3):204-205.
[ 4] 　董青松 ,欧彪 ,陈乾平.五指毛桃研究进展 [ J] ,广西医学, 2006, 28
(6):950-952.
[ 5] 　蔡青圆 ,陈虎彪 , 赵中振 ,等.五指毛桃拮抗毒品可卡因的肝毒性
作用及其活性成分研究 [ J].中国中药杂志 , 2007, 32(12):1190-
1193.
[ 6] 　周添浓 ,王艳 ,唐立海 ,等.南芪北芪抗应激与免疫调节作用的研
究 [ J] .中药新药与临床药理 , 2008, 19(1):15-18.
[ 7] 　孔福全 ,王潇 ,倪嵋楠 ,等.辐射致 DNA损伤中 DNA浓度的影响
[ J] .科学通报 , 2007, 52(24):2826-2831.
[ 8] 　COLLINSAR.ThecometassayforDNAdamageandrepair:princi-
plesapplications, andlimitations[ J] .MolBiotechnol, 2004, 26(3):
249-261.
[ 9] 　黄晓兰 ,杨明亮 ,吴晓雯 ,等.枸杞多糖对小鼠睾丸细胞 DNA损伤
的保护作用 [ J] .卫生研究 , 2003, 32(6):599-601.
[ 10] 黄洁 ,徐文清 ,沈秀 ,等.石花多糖对辐射损伤小鼠防护作用的研
究[ J] .中国生化药物杂志 , 2008, 29(1):53-56.
[ 11] 毕良文 ,段伟 ,王晓莉 ,等.中药辐射防护剂的研究进展 [ J].中国
辐射卫生 , 2006, 15(1):118-120.
[ 12] KIMKC, KIMIG.GanodermalucidumextractprotectsDNAfrom
strandbreakagecausedbyhydroxylradicalandUVirradiation[J].Int
JMolMed, 1999, 4(3):273-277.
[ 13] 邓杨梅 ,张洪泉 ,邢淑华 ,等.螺旋藻多糖对紫外线诱发的人胚肺
二倍体细胞 DNA损伤修复的影响[ J] .中国海洋药物杂志 , 2001,
7(2):27-31.
[ 14] 梁莉 ,李谦 ,王婷 ,等.苦豆子总碱对亚慢性辐射损伤小鼠的防护
作用 [ J] .中药药理与临床 , 2004, 20(5):14-16.
[ 15] 梁莉 ,杨永建 ,李新芳 , 等.苦豆子总碱减轻亚慢性照射对小鼠的
损伤效应 [ J] .中药药理与临床 , 2002, 18(4):16-17.
[ 16] 文靖 ,王晓平 ,黄文巧.对中药五指毛桃中 6种微量元素的测定结
果评价 [ J] .中国卫生产业 , 2009, 7(下):5-6.
(收稿日期:2010-04-21　　修回日期:2010-07-12)
·384· 中国职业医学　2010年 10月第 37卷第 5期　ChinOccupMed, October, 2010, Vol.37, No.5