全 文 ：收稿日期:2008-04-15.
基金项目:湖北省自然科学基金资助项目(2006ABA036);国家民委 2008年科学研究项目(08HB04).
作者简介:陈业(1977-),男 ,主要从事食品工程与分析检测的研究.＊通讯作者:罗祖友 ,博士 ,副教授 ,主要从事天然产物与功能食品化学的
研究.
藤茶黄酮类化合物的提取分离与定量方法研究进展
陈　业1 ,罗祖友 1, 2, ＊ ,向东山 2
(1.湖北民族学院 生物科学与技术学院 ,湖北 恩施 445000;
2.湖北省生物资源保护与利用重点实验室 ,湖北 恩施 445000)
摘要:藤茶黄酮的主要成分为二氢杨梅素(DMY)和杨梅素(MY), 以热水提取和乙醇回流提取为主;分离纯化
主要采用重结晶和柱层析法;紫外光度法(292nm)、A1Cl
3
显色法(294nm和 314nm)和反相 HPLC(290 ～ 294nm检
测)等方法用于藤茶黄酮含量的测定.为了给藤茶资源的深度开发提供系统适用的方法 ,对藤茶黄酮类化合物的提
取分离与定量方法的研究进行了综述.
关键词:藤茶;黄酮;提取分离;定量方法
中图分类号:Q539 文献标识码:A 文章编号:1008-8423(2008)03-0277-05
ProgressonExtractionandIsolationandQuantitativeMethods
ofFlavonoidsfromAmpelopsisGrossedentata
CHENYe1 , LUOZu-you1, 2, ＊ , XIANGDong-shan2
(1.SchoolofBiologicalScienceandTechnology, HubeiUniversityforNationalities, Enshi445000, China;
2.KeyLaboratoryofBiologicalResourcesProtectionandUtilizationofHubeiProvince, Enshi445000, China)
Abstract:TheconditionsofextractionandisolationandquantitativemethodsofflavonoidsfromAmpelop-
sisGrossedentataweresummarizedinthispaper.Dihydromyricetin(DMY)andmyricetin(MY)werethe
maincomponentsofflavonoidsfromAmpelopsisGrosedentata, whichwereusualyextractedwithhot-wa-
terorethanol-thermalreflux.Recrystalizingandcolumnchromatogramwereusedtoisolateandpurify
theflavonoids.ThecontentsoftheflavononidsweredeterminedbyUVspectrophotometryat292nm, and
AlCl3 spectrometricmethodat294nmor314nm, andreversed-phaseHPLCmethodwithUV290 ～ 294
nmdetection.ItisexpectedthattheinformationcouldhelptoexploitAmpelopsisGrossedentataresource
deeply.
Keywords:AmpelopsisGrosedentata;flavonoids;extractionandisolation;quantitativemethods
藤茶 ,植物学名显齿蛇葡萄 [ Ampelopsisgrosedentata(Hand-Mazz)W.T.Wang] ,葡萄科 (Vitaceae
Michx)蛇葡萄属(Ampelopsis),野生藤本植物 ,主要分布于我国湖南 、湖北 、云南 、贵州 、广东 、广西 、福建等地 ,
在湖南 、湖北等省已有一定规模的人工栽培[ 1 ～ 4] .藤茶为药食两用植物 ,最初作为一剂草药应用于民间[ 5] .10
多年来 ,我国对藤茶植物资源的开发利用 ,仍以初加工产品为主 ,即于春 、夏季采集植株上的幼嫩茎叶 ,仿照
制茶工艺加工成冲泡型的类茶产品 “藤茶 ”,因其外观和冲饮的口感特征 ,而有 “白猴 ”、“甘露茶 ”、“茅岩霉
茶 ”、“野藤茶 ”、“龙须茶 ”等俗称 [ 6, 7] ;随着人类对植物活性成分和功能食品研究的深入 ,我国对藤茶资源的
深度开发研究集中在其主要成分及其生物活性方面 ,特别是对藤茶中含量丰富的以二氢杨梅素为主的黄酮
第 26卷第 3期　　　　 　　　　　　　　　湖北民族学院学报(自然科学版)　　　　　　　　　 　　　　Vol.26　No.3
2008年 9月　　　　 　　　　JournalofHubeiUniversityforNationalities(NaturalScienceEdition)　　　　　　　　　Sep.2008
类成分研究较为系统 [ 8 ～ 12] ,但其深加工方面尚未见到商品化产品的报道.选择和确立适用于藤茶黄酮类成
分的提取分离及其定量方法与藤茶资源的深度开发利用密切相关.本文重点就我国藤茶黄酮类成分提取分
离与定量方法的研究方面进行综述.
1　藤茶黄酮的主要类型
黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物 ,属于植物次级代谢产物 ,其母核结构多为 C6-C3
-C6的基本骨架 ,即两个苯环(A环 、B环)通过三碳链相互联结而成(如图 1所示),母核上常有羟基 、甲氧
基 、甲基等取代基 ,据取代基和 C环氧化程度可将黄酮类化合物分为黄酮与黄酮醇 、二氢黄酮与二氢黄酮
醇 、异黄酮和二氢异黄酮等类型 [ 13, 14] .自然界的黄酮类化合物多以甙类形式存在 ,通常将甙类的黄酮部分称
为甙(或苷)元 ,与甙元相连接的部分称配基 ,多为各种单糖或低聚糖.
现有研究资料显示 ,藤茶中总黄酮含量高达 45%左右(干重),但因原材料来源和提取分离 、测定方法等
不同 ,相关文献中报道的藤茶黄酮含量存在较大的差异 [ 15 ～ 18] .藤茶黄酮的两种主要成分为二氢杨梅树皮素
(DMY, dihydromyricetin, C15H12O6)和杨梅树皮素(MY, myricetin, C15H10O6),简称二氢杨梅素和杨梅素(如图
2所示),二者均属于黄酮醇类 ,其中 ,二氢杨梅素又被称为蛇葡萄素或福建茶素(ampelopsin)[ 19, 20] .此外 ,藤
茶中还含有藤茶甙(grossedentataside, 4′-羟基 -3′-甲氧基异黄烷 -7-0-α-L-鼠李糖(1※6 )-β -D
-葡萄糖甙)、藤茶素(grossedentstasin, 4′-羟基 -3′-甲氧基异黄烷 -7-0-α-L-吡喃鼠李糖甙)、芦丁 、
杨梅甙(杨梅素 -鼠李糖甙)、槲皮素 、槲皮素 -3-O-β -D-葡萄糖甙等黄酮及黄酮甙类化合物 [ 21 ～ 24] .
2　藤茶黄酮的提取
植物黄酮类化合物的提取 ,以溶剂浸提法为主 [ 25] .(1)广泛采用有机溶剂提取 ,如甲醇 、乙醇 、丙酮等作
溶剂 ,其中以乙醇提取为主 ,有冷浸或热回流法;(2)热水提取;(3)碱液提取;(4)系统溶剂提取;(5)超临界
流体萃取等.在溶剂浸提的基础上 ,辅以超声波 、微波手段 ,以强化提取效果.
藤茶中的两种主要黄酮成分均属多羟基黄酮醇类化合物 ,具极性 ,易溶于热水 、乙醇等 ,迄今为止 ,对藤
茶黄酮 ,尤其是二氢杨梅素的提取 ,以热水提取 、乙醇回流提取为主 ,以超声波或微波加以辅助.
周天达和何桂霞等[ 26, 27]将藤茶粗粉末以石油醚脱去脂溶性色素 ,再用 95%乙醇回流提取 ,收集乙醇提
取液 ,经浓缩除醇 、分离纯化 ,得到二氢杨梅素和杨梅素.袁阿兴等 [ 20]将显齿蛇葡萄地上部分粉碎成粗粉 ,热
水煎煮 3次 , 2h/次 ,趁热过滤 ,冷却 、沉淀 ,收集沉淀部分 ,再经分离纯化得到双氢黄酮类.覃洁萍等 [ 19, 28]先
用工业酒精对藤茶进行回流提取 ,对醇提液脱醇后 ,再用石油醚萃取 ,下层液静置 、分步结晶 ,分别得到杨梅
素和二氢杨梅素;后改用水煎煮藤茶 ,趁热收集滤液 ,经浓缩结晶得到粗品黄酮 ,再分别以丙酮和乙醇对粗品
进行提取 、分离和加水重结晶得到二氢杨梅素和杨梅素.王岩等 [ 29]专门研究了乙醇回流提取藤茶黄酮的乙
醇浓度 、用量 、提取时间和次数 ,确定以 80%乙醇 、1∶10的料液比 、加热回流提取 2次 、60min/次为最佳提取
工艺条件.
基于二氢杨梅素在热水和冷水中溶解度的显著差别 ,以水作为提取剂 ,逆流提取法成为一种改进的环
保 、节能节水的二氢杨梅素水提取法 [ 30] ,采用三级逆流 、30min/级 、1∶10的料液比 、提取温度 100℃,辅以弱
碱性(pH8-9)条件 ,提取效果优于 3次单级提取的效果.
较为先进的提取法是微波动态循环阶段连续逆流提取(microwavedynamicmultistagecountercurentex-
traction, MDMCE)技术[ 31] ,它结合了微波辅助提取中药有效成分的优势和连续逆流提取的特点 ,采用先进的
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具精密控温 、控制加热功率和时间的 MARS5微波装置(美国),对藤茶中的二氢杨梅素进行微波动态循环连
续逆流提取 ,效果优于微波静态间歇提取(microwavestaticbatchextraction, MSBE).
3　藤茶黄酮主要成分的分离纯化
对藤茶黄酮的初步分离主要用结晶法.由于藤茶黄酮的冷水不溶性 ,无论采用热水煎煮所获的水提取
液 ,还是乙醇回流提取 、脱醇后的水溶液 ,均可在加热溶解和充分过滤后 ,将滤液浓缩 、放置冷却析出结晶
(黄色),分离得到藤茶黄酮粗品 [ 19, 20, 26 ～ 28] .
进一步的纯化分离可用重结晶 、柱层析法 [ 26, 27] .初步分离得到的黄酮粗品可用水反复重结晶得白色针
晶 ,或直接将粗品上硅胶层析柱 , 用甲苯 -乙酸乙酯 -甲醇(10∶8∶5)洗脱 , 硅胶薄层层析检查 ,合并相同组
分处理后 ,得到白色针状结晶 ,鉴定为二氢杨梅素(3′, 4′, 5′, 3, 5 , 7-六羟基 -2, 3 -双氢黄酮醇 , di-
hydromyricetin);将粗品重结晶的母液合并 、浓缩至干得黄色沉淀物 ,用少许甲醇溶解并加硅胶拌样 ,水浴蒸
干后再上硅胶层析柱中以甲苯 -乙酸乙酯 -甲酸(10∶8∶5)洗脱 ,硅胶薄板层析检查 ,合并相同组分处理后
得黄色针晶 ,鉴定为杨梅素(即 3, 5, 7, 3′, 4′, 5′-六羟基黄酮醇 , myricetin).
根据两种主要黄酮成分在丙酮中的溶解性差异 ,可对藤茶黄酮粗品进行纯化分离 [ 28] .将适量黄酮粗品
加丙酮回流提取 5 ～ 10min,重复 1次 ,分别收集丙酮提取液和不溶性残渣;对提取液浓缩除丙酮后 ,加水放
置析出大量白色结晶 ,过滤 ,重复一次 ,得白色细针晶或粉末状结晶 ,即为二氢杨梅素;对不溶性残渣加适量
乙醇 -水(1∶1)回流提取 20min,趁热过滤 ,滤液经浓缩 、放置 ,逐步析出棕黄色簇状或小颗粒状结晶 ,即为
杨梅素.
还可对黄酮粗品用乙醇 、氯仿 -乙醇反复重结晶 ,得白色结晶(二氢杨梅素)[ 20] .也可对黄酮粗提除醇
后的水溶液采用分段放置结晶 、分段收集 ,达到分离纯化两种黄酮的目的 [ 19] ,放置后先析出黄色菊花状结
晶 ,分离结晶(I),再对液相进一步浓缩后再放置 ,析出粉末状结晶(Ⅱ);对结晶(I)加丙酮重结晶一次 ,再用
甲醇二次重结晶 ,得黄色簇状小针晶(杨梅素),对结晶(Ⅱ)用乙醇一水加活性炭重复重结晶 ,得白色细针状
结晶(二氢杨梅素).此外 ,可对乙醇回流提取 、除醇 、浓缩后的黄酮粗提液(或浸膏),经适当处理 ,再用乙酸
乙酯或乙醚提取 ,获得相应的乙酸乙酯浸膏或乙醚浸膏;乙醚浸膏上 100 ～ 200目聚酰胺层析柱 ,以乙醇 -水
溶剂系统梯度洗脱 ,洗脱液再经 sephadexLH-20柱层析纯化 ,得到杨梅素与杨梅甙 [ 32] ;乙酸乙酯浸膏经聚
酰胺柱层析 ,可分离纯化出二氢杨梅素(蛇葡萄素)[ 24] .
“增温溶解 ,保温过柱 ,温水洗脱 ”为纯化 、制备二氢杨梅素的新方法 [ 33, 34] .利用 D16树脂吸附杂质的能
力大于吸附二氢杨梅素的能力的特点 ,将二氢杨梅素粗提液上 D16树脂柱 ,溶解和洗脱水温度以 60 ℃较
好 ,适宜的上样量与过柱速度 、适宜的水解吸速度 ,收集洗脱液后 ,再利用二氢杨梅素易溶于热水难溶于冷水
的特性进行重结晶 ,加活性炭处理 ,纯度可达到 96.3%.
藤茶中两种主要黄酮成分的基本性质 [ 26 ～ 28] .二氢杨梅素:白色针状结晶 , mp:245 ～ 246℃.易溶于热水 、
热乙醇 、丙酮 , 溶于甲醇 、乙醇 ,微溶于水 、醋酸乙酯 ,难溶于氯仿 、石油醚.杨梅素:黄色结晶 , mp:324 ～
326℃,溶于甲醇 、乙醇 、热水 ,微溶于水 ,难溶于氯仿 、丙酮 、石油醚.
4　藤茶黄酮主要成分的定量方法
对藤茶黄酮的定量方法主要有光谱法和色谱法.光谱法有:荧光光度法 、紫外光度法 、A1Cl3显色法 、差
示分光光度法等.色谱法则主要采用硅胶薄板层析 、HPLC等.
朱炯波等[ 35]根据黄酮类化合物本身具有荧光的性质 ,研究了荧光分析法直接测定显齿蛇葡萄中总黄酮
含量的条件.以芦丁为标样 ,激发及发射波长分别为 424nm和 530nm,以 pH2的 95%乙醇作溶剂 , 2 ～ 4h内
稳定 ,检出限为 2.07×10-9mol·L-1 ,样品测定重现性较好.魏捷 [ 36]以蛇葡葡萄素为标样 ,用 95%乙醇为溶
剂 ,直接于 292nm处测定紫外吸光度并计算样品中蛇葡萄素含量.何桂霞等 [ 17]以二氢杨梅素为对照品 ,用
A1Cl3显色法(最大吸收波长 314nm)和硅胶薄层扫描法分别测定藤茶总黄酮含量和二氢杨梅素含量 ,结果
显示藤茶总黄酮含量为 43.4% ～ 44.0%,二氢杨梅素的含量高达 37.4% ～ 38.5%.熊皓平等 [ 18]以二氢杨梅
素为标样 ,采用 A1Cl3分光光度法 ,于 294nm测定藤茶总黄酮含量 ,结果表明:标液浓度在 5 ～ 50μg· mL-1
范围内 ,吸光度与浓度呈良好的线性关系 , 4h内稳定.陈凤桂等 [ 37]比较了 “二氢杨梅素 ”的紫外吸收光谱和
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第 3期　　　　　　　　　 　陈　业等:藤茶黄酮类化合物的提取分离与定量方法研究进展　　　　　　　　　　　　　
“二氢杨梅素 +A1Cl3 ”显色后的紫外吸收光谱 ,发现两者在最大吸收波长下的吸光度值差别不大 ,只是显色
导致了红移 ,而二者吸光值差值较大的波长是 375nm,此时吸光度值却很小 ,而且 A1Cl3显色法稳定性较差 ,
从而提出以二氢杨梅素为标样 ,不显色直接用紫外法于 291nm处测定藤茶总黄酮含量更方便 、稳定 、节省试
剂 ,测得总黄酮提取得率在 35 ～ 39%.覃洁萍等 [ 15]利用藤茶样品溶液中黄酮类成分与 ZrOCl2络合后 , 在
(318±1)nm波长下吸光度值发生显著变化 、而其它共存成分(如叶绿素等)不发生吸收性质改变的特点 ,采
用差示分光光度法 ,通过在(318±1)nm处测定络合前后的吸光度差值 ,消除背景吸收(共存成分)的干扰 ,
测定藤茶样品中黄酮类成分的含量.
何桂霞等[ 38, 39]采用薄层扫描法测定藤茶中二氢杨梅素和杨梅素的含量 ,点样于硅胶 G-CMC-Na薄层
板 ,以甲苯 -乙酸乙酯 -甲酸(10∶8∶5)为展开剂 ,层析后 ,用 3%FeCl3乙醇溶液喷雾显色后 ,覆盖玻璃板并
密封四周 ,二氢杨梅素和杨梅素斑点呈紫色 ,对薄层色谱图进行扫描测定各斑点的面积积分值 , 3h内面积值
稳定 ,通过标准曲线计算样品中的含量 ,结果显示:藤茶中二氢杨梅素和杨梅素的含量分别为 38.17% ～
38.81%和 1.72 ～ 1.78%.
高效液相色谱法(HPLC)是近几年发展起来的测定藤茶及其深加工产品中二氢杨梅素和杨梅素含量的
方法 ,研究者多采用 RP-HPLC法.藤茶素片是一种处于研究中的抗氧自由基药物 ,由藤茶经乙醇提取精
制 ,其主要成分为二氢杨梅素 ,以二氢杨梅素为对照品 ,采用 AlsphereODS柱(4.6×250mm, 5μm),流动相
为乙腈 -0.1%磷酸水溶液(15∶85),检测波长 290nm,流速 1.0mL· min-1 ,柱温 30℃,测定藤茶素片中的二
氢杨梅素含量 ,精密度高 ,稳定性好 ,二氢杨梅素溶液在 0.0744 ～ 0.3720mg· mL-1的浓度范围内具有良好
的线性关系 [ 40] .对不同采收时期和不同部位的藤茶中二氢杨梅素含量的测定 ,采用 NovapakC18柱(4.6mm
×150mm, 5μm),甲醇 -水 -磷酸(27∶73∶0.1)为流动相 ,流速 1.0mL· min-1 ,紫外检测波长 290nm,柱温
为 25℃,结果表明 ,二氢杨梅素在 4.32 ～ 69.12μg· mL-1范围内 ,峰面积与浓度呈良好的线性关系;测得 5
月份藤茶叶中二氢杨梅素含量最高 ,达 27.8% ～ 31.2%[ 41] .田森林和张友胜等 [ 42, 43]分别以二氢杨梅素 、杨
梅素为标准品 ,采用 Nova-PakC18不锈钢柱(3.9mm ×150mm),检测波长分别为 294、254nm,流动相为
甲醇 -水(40∶60和 24∶76,用磷酸调 pH),流速 1.0mL·min-1 ,进样量 10μL,柱温 30℃,二者检测限量分别
为 10、15ng;测得湖南藤茶总黄酮含量大于 40%,不同部位的二氢杨梅素含量在 11.87% ～ 40.66%之间 ,杨
梅素含量在 2%左右 ,分离效果好 ,干扰少.覃洁萍等[ 44, 45]采用 ShimpackCLCODS柱 (4.6mm ×150mm, 5
μm)分析 ,流动相为甲醇一水一冰醋酸(50∶50∶1),流速 1.0mL·min-1 ,检测波长 275nm,柱温 30℃,同时分
离测定藤茶素胶囊中二氢杨梅素和杨梅素两种成分的含量 ,重复性好 ,快速 、方便;单独测定二氢杨梅素含
量 ,则以甲醇 -0.05%磷酸(55∶45)为流动相 ,检测波长 292nm,柱温 25℃,分离效果好.
5　展望
藤茶黄酮作为天然植物活性成分 ,具有低毒 、药理与保健作用明显 、资源丰富等优势 ,研究者已将以二氢
杨梅素为主的藤茶黄酮作为食品抗氧化剂 、药物活性成分等进行开发和应用研究 [ 44, 46 ～ 50] .随着对藤茶黄酮
的提取 、分离 、分析测试手段的提高和完善 ,包括标准方法的建立 ,将有力促进藤茶资源的深度开发.
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第 3期　　　　　　　　　 　陈　业等:藤茶黄酮类化合物的提取分离与定量方法研究进展