全 文 ：China Pharmaceuticals
2012年 7月 5日 第 21卷第 13期
Vol． 21，No． 13，July 5，2012
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(收稿日期:2011 － 06 － 26;修回日期:2011 － 12 － 14 )
卷柏为卷柏科植物卷柏 Selaginella tamariscina(Beauv． ) Spring
或垫状卷柏 Selaginella pulvinate(Hook． et Grev． ) Maxim 的干燥全
草，具有活血通经之功效，为 2010年版《中国药典 (一部 )》所收载 [1]。
卷柏属植物的主要化学成分为双黄酮类化合物，其次是生物碱、
苯丙素类化合物等。穗花杉双黄酮 ( amentoflavone )为卷柏药材化
学检验的对照品和质量控制的指标成分 [ 1 ]，具有多种生理活性，
如抗肿瘤、抗炎、抗菌、血管舒张等 [ 2 － 3 ]。文献报道的穗花杉双黄
酮制备方法是采用制备液相分离 [4 ]，成本较高，对仪器要求也较
高。本研究中采用相对优化的穗花杉双黄酮制备方法，报道如下。
1 仪器与试药
Agilen － 8453 型紫外 －可见分光光度计;Agilen LC － MSD
XCT － plus质谱仪;Bruker Avance DRX － 500 型核磁共振仪;X － 5
型显微熔点测定仪;Waters 1525 型高效液相色谱仪:Breeze 2 色
谱工作站，在线脱气机，手动进样器，Waters 2489 型紫外可见检
测器; 色谱柱为Diamosil C18 柱 ( 250 mm × 4． 6 mm，5 μm);
KQ500DB 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);高速万
能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司);TD 低温微型提取浓缩机
组 (瑞安天众医药化工机械公司 );φ30 cm × 35 cm的不锈钢层析
柱(实验室自制)。薄层色谱及柱色谱用硅胶(青岛海洋化工厂);
色谱纯甲醇 ( Calipure 进口分装 )，其他所用试剂均为分析纯;卷
柏药材购自河北安国中药材市场，经北京中医药大学张贵君教授
鉴定为 Selaginella tamariscina ( Beauv． ) Spring的干燥全草。
2 方法与结果
2．1 提取与分离
本研究使用了中试规模的 TD型中药提取装置(单批最大处
理量 20 kg)提取药材。取卷柏药材 50 kg，用粉碎机粉碎成直径小
于 1 cm的颗粒，分 3 次装入 200 L中药提取罐，每次 16． 7 kg。加
入 160 L 95% 乙醇，先浸泡 12 h，再在 75 ℃下回流提取 1． 5 h，残
渣再用 70%乙醇回流提取 1 h。提取液抽入真空浓缩罐，在 50 ℃、
真空度 0． 07 MPa下回收溶剂，得到浸膏 5． 5 kg。浸膏加少量温水
混悬后，依次分别用石油醚、乙酸乙酯萃取直至水层溶液薄层色
谱法(TLC)基本检测不到目标物，浓缩乙酸乙酯层得萃取物。萃取
物上硅胶柱层析进行分离，乙酸乙酯萃取物用少量甲醇溶解，与
等质量的 160 ～ 200 目硅胶拌匀、55 ℃烘干后分 2 次干法装入已
压实的层析柱 (φ30 cm × 35 cm的不锈钢层析柱 )。经过试验筛选，
确定洗脱剂为石油醚 －乙酸乙酯 －甲醇 ( 50 ∶ 10 ∶ 1 )。结合色带
情况收集流分，收集液点板后合并有目标物的流分，减压回收溶
剂后低温析出淡黄色沉淀，即为穗花杉双黄酮粗品。沉淀依次用
适量脱水乙酸乙酯、甲醇超声溶解后过滤，各重复 1 次。经多次试
验证明，丙酮为最佳重结晶溶剂。粗黄酮经脱水丙酮结晶、重结
晶，55 ℃干燥后得淡黄色穗花杉双黄酮纯品。
2．2 结构鉴定
穗花杉双黄酮对照品为淡黄色晶体(丙酮)，熔点为 298 ～300℃，
易溶于热甲醇、丙酮。365 nm 紫外灯下 10%硫酸 －乙醇试液显
檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨
卷柏中穗花杉双黄酮化学对照品的制备方法＊
刘朋朋，刘 勇，刘永刚，蔡 伟，张宏桂
(北京中医药大学中药学院，北京 100102)
摘要:目的 研究从卷柏中分离穗花杉双黄酮化学对照品的制备方法与分析技术。方法 采用溶剂和色谱方法从卷柏中分离、纯化、制备
穗花杉双黄酮对照品，以紫外、红外光谱、质谱、氢谱和碳谱鉴定结构，以薄层色谱法、高效液相色谱法进行纯度检查。结果 制得的穗花
杉双黄酮经薄层色谱法检查无杂质斑点，经高效液相色谱法检测纯度达 98． 5%以上。结论 所建立的分离、纯化方法简便，成本低。
关键词:卷柏;穗花杉双黄酮;对照品
中图分类号:R284;R282． 71 文献标识码:A 文章编号:1006 － 4931 (2012 )13 － 0012 － 02
Preparation Method of Chemical Reference Amentoflavone from Selaginella
Tamariscina (Beauv． ) Spring
Liu Pengpeng，Liu Yong，Liu Yonggang，Cai Wei，Zhang Honggui
( College of Chinese Medicine，Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing，China 100102 )
Abstract: Objective To investigate the preparation method and analysis technique of chemical reference amentoflavone from Selaginella
tamariscina ( Beauv． ) Spring． Methods The chemical reference amentoflavone was isolated and purified by solvent extract and chro-
matography，which structure was determined by UV，IR，MS，1H － NMR and 13C － NMR． The purity was analyzed by TLC，HPLC． Results
The TLC showes the amentoflavone has no impurity spot． The HPLC indicates that it’s purity reaches 98． 5% above． Conclusion The
mothod of isolation and purification for amentoflavone reported in this paper is simple and economical．
Key words: Selaginella tamariscina ( Beauv． ) Spring; chemical reference amentoflavone; reference
＊国家“十一五”科技支撑计划项目，项目编号:2009ZX09308 － 001 － 1 － 6;国家自然科学基金资助项目，项目编号: 30870262。
·药物研究·
Drug Research
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2012年 7月 5日 第 21卷第 13期
Vol． 21，No． 13，July 5，2012 China Pharmaceuticals
A B
A． 环己烷 －丙酮 ( 1 ∶ 1 ) B． 氯仿 －甲醇 －甲酸 ( 10 ∶ 1 ∶ 0． 1 )
图 1 薄层色谱图
色为黄色荧光。UV λMAX(MeOH):270 nm，338 nm。IR v(KBr)cm － 1:
3 400( － OH)，1 660(C =O)，1 600，1 500，840( － Ar)。ESI －MS m / z:
537 [M － H] －;1H － NMR(Acetone － d6，500 MHz)δ:6． 770(1H，s，
H － 3)，6． 263(1H，d，J = 2 Hz，H － 6)，6． 547(1H，d，J = 2 Hz，H －
8)，8． 070(1H，dd，J = 2，8． 5 Hz，H － 2’)，7． 27(1H，d，J = 8． 5 Hz，
H － 3’)，8． 166(1H，d，J = 2 Hz，H － 6’)，6． 702(1H，s，H － 3’’)，
6． 467(1H，s，H － 6’’)，7． 691(2H，d，J = 9 Hz，H － 2’’’，H － 6’’’)，
6． 858(2H，d，J = 9 Hz，H － 3’’’，H － 5’’’)，13． 054(1H，s，OH － 5)，
13． 220(1H，s，OH － 5’’);13C － NMR(Acetone，500 MHz)δ:164． 211
(C －2)，103． 500(C －3)，182． 205(C －4)，161． 926(C －5)，98． 893
(C －6)， 162． 492(C －7)， 93． 928(C －8)， 157． 959(C －9)，
104． 500 (C － 10)，122． 519(C － 1’)，127． 994(C － 2’)，116． 656
(C － 3’)，159． 384(C － 4’)，119． 928(C － 5’)，131． 747(C － 6’)，
163． 956(C － 2’’)，103． 444(C － 3’’)，182． 595(C － 4’’)，161． 702
(C － 5’’)，98． 842(C － 6’’)，160． 917(C － 7’’)，102． 927(C － 8’’)，
155． 251(C － 9’’)，104． 674(C － 10’’)，122． 441(C － 1’’’)，128． 288
(C － 2’’’，C － 6’’’)，115． 847(C － 3’’’，C － 5’’’)，161． 0(C － 4’’’)。以
上数据与文献报道对照，基本一致 [5 ]。
2．3 纯度考察
2． 3． 1 薄层色谱法
取穗花杉双黄酮对照品，溶于甲醇配成 1 g / L的溶液，照薄
层色谱法 [ 2010 年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验，吸取上述
溶液 5，10，15，20，30，40 μL，点于同一硅胶 G薄层板上，平行点 3
块薄层板，分别以石油醚 －乙酸乙酯 －甲醇 ( 50 ∶ 10 ∶ 1 )、氯仿 －
甲醇 －甲酸 ( 10 ∶ 1 ∶ 0． 1 )、环己烷 －丙酮 ( 1 ∶ 1 )为展开剂 [ 5 ]，展开，
取出，晾干。在日光下观察，均为 1个黄色斑点，无杂质斑点(图 1);
在 365 nm紫外灯下观察，均为 1个亮黄色斑点，无杂质斑点。
2． 3． 2 高效液相色谱法
对照品溶液制备:称取穗花杉双黄酮对照品约10 mg，精密称
定，置 10 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
色谱条件及系统适用性试验:色谱柱:Diamosil C18柱 (250 mm ×
4． 6 mm，5 μm);流动相:甲醇－ 0． 1%磷酸水溶液(A － B)，按 2010
年版《中国药典》中的规定进行梯度洗脱;流速:1． 0 mL /min;检测
波长:254 nm、330 nm;柱温:35 ℃。在该色谱条件下，理论板数按
照穗花杉双黄酮峰计算应不低于 3 000。
纯度检查: 依次吸取对照品溶液5，20 μL，注入液相色谱仪
测定，按面积归一化法计算。结果表明穗花杉双黄酮不同进样量、
不同检测波长下纯度均达到 98%以上，分别为 99． 56%(330 nm，
5 μL)，99． 55%(330 nm，20 μL)，98． 88%(254 nm，5 μL)，98． 71%
(254 nm，20 μL)，符合对照品定量分析的要求(图 2)。
3 讨论
在较短时间里，应用常规的提取分离设备，从 50 kg卷柏中制
备出至少 10 g符合 2010 年版《中国药典 (一部 )》标准的穗花杉双
黄酮对照品。试验方法快速、经济、简便、安全。为了使有效成分提取
完全，本试验采用梯度提取，即先用 95%乙醇提取，然后残渣再用
70%乙醇提取 1次。已有文献报道用制备液相分离纯化穗花杉双黄
酮，而本研究只是用了常规层析柱，洗脱 1次后就得到了粗黄酮，经
优选溶剂重结晶即可达到对照品纯度(98%以上)，免去了制备液相
分离纯化步骤，比较经济、快速。经试验，本研究确定了洗脱剂为石
油醚 －乙酸乙酯 －甲醇 (50 ∶ 10 ∶ 1)，这些试剂都是实验室常用试
剂，经济、低毒。
作者简介:刘朋朋(1988 －)，男，安徽砀山人，硕士研究生，研究
方向为中药药效物质基础研究，(电话)010 － 84738642; 张宏桂
(1955 －)，男，教授，研究方向为中药药效物质基础研究、体内代谢，
本文通讯作者，(电话)010 － 84738642(电子信箱)bzy714@
163． com。
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(收稿日期:2011 － 12 － 19 )
(左上 330 nm检测，进样量 5 μL;右上254nm检测，进样量 5 μL;
左下 330 nm检测，进样量 20 μL;右下254nm检测，进样量 20 μL)
图 2 穗花杉双黄酮对照品高效液相色谱图
·药物研究·
Drug Research
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