全 文 ： 中国药学杂志 2009 年 7 月第 44 卷第 13 期 Chin Pharm J，2009 July，Vol. 44 No. 13 ·989·
基金项目：黑龙江省攻关课题(GC07C337)
作者简介：屈东香，女，硕士研究生 研究方向：红松松塔相关研究 *通讯作者：陈秀杰，女，教授，硕士生导师 研究方向：药用植物
和药物基因组的研究 Tel：（0451）86615922 Fax：（0451）86681297 E-mail：cxjie_666@sina.com
红松松塔水提物对小鼠自然杀伤细胞活性的影响
屈东香，陈秀杰*，刘永胜，窦智磊，刘磊，徐建凯，刘思博(哈尔滨医科大学，生物信息科学与技术学院，药代动力学与药
物基因组学教研室，哈尔滨 150081)

摘要：目的 ①探讨红松松塔水溶性物质提取的最佳工艺；②探讨红松松塔水溶性物质对小鼠自然杀伤细胞(natural killing
cells)活性的影响。方法 ①采用 L9(34)正交实验设计法，以质量提取率为指标，优选红松松塔水溶性成分提取的最佳工艺；
②用体外和体内给药的方式，采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法考察红松松塔水溶性成分对小鼠自然杀伤细胞活性的影响。结果
■①提取的最佳工艺为：红松松塔的粉碎粒度为 20 目，提取时间为 1 h，提取次数为 1 次，料液比为 1∶8；②红松松塔提
取物经大孔吸附树脂分离后，经体内外实验研究发现：在体外实验中红松松塔水提物(包括总提物、水洗脱物和乙醇洗脱物)
能提高小鼠自然杀伤细胞的活性；在体内实验中，红松松塔总提物和乙醇洗脱物均能明显提高小鼠自然杀伤细胞的活性，而
水洗脱物没有此效果。结论 红松松塔水溶性物质能够增强机体的自然杀伤细胞活性，即是能够增强机体的固有免疫力。
关键词：红松；正交实验设计法；自然杀伤细胞；乳酸脱氢酶释放法
中图分类号：R965 文献标识码：A 文章编号：1001-2494(2009)13-0989-04
Effect of Aqueous Extracts of Pinecone of Pinus koraiensis Sied.et Zucc on Mice Natural Killing Cells
QU Dong-xiang, CHEN Xiu-jie*, LIU Yong-sheng, DOU Zhi-lei, LIU Lei, XU Jian-kai, LIU Si-bo (College of
Bioinformatic Science and Technology, Harbin Medical University, Harbin, 150081, China)
ABSTRACT：OBJECTIVE To search the optimal extraction technology of pinecone of Pinus koraiensis Sied.et Zucc (here
simply termed PC). To study the effect of the extracts on mice natural killing cells. METHODS L9(34) orthogonal test was used to
optimize the technology for the water-solubility extracts of PC, with the extraction ratio as the criteria. The activity of mice natural
killing cells was measured by lactic dehydrogenase (LDH) release test after the cells were treated with extracts of PC in vitro and in
vivo. RESULTS The optimum conditions for extracting the water-solubility substances of PC were that PC’s particle size was of 20
screen mesh, 8 times of water, extracted once and each time lasted 1 h. After being separated by macroporous adsorptive resins, the
extracts of PC increased the activity of mice natural killing cells in vitro. The total extracts and extracts eluted by 40% ethanol raised
the activity of mice natural killing cells in vivo and substances eluted by water didn’t show the activity. Meanwhile the activity was
concentration-dependent. CONCLUSION The extraction technology was stable and accurate, and it was suitable for extracting
water-solubility substances of PC. The water-solubility extracts of PC extracted by this technology could enhance the activity of mice
natural killing cells.
KEY WORDS：Pinus koraiensis Sied.et Zucc；orthogonal test；natural killing cells；lactic dehydrogenase(LDH) release test

松塔系松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物红松、马
尾松、华山松、油松等的球果。《本草纲目》记载，
松塔具有祛痰、止咳平喘、祛风、润肠、安神的功
效。国内外药学工作者应用现代药学手段对不同种
属的松塔进行了相关研究，如日本研究人员对白松
松塔提取物的研究表明，其有较强的免疫增强作
用[1-2]，抗癌、抗病毒和抗菌活性[2]；日本五针松松
塔热水提取物具有抗人类免疫缺陷病毒抗体
（HIV-1）、人类单纯性泡疹病毒（HSV）、流感病
毒（Influenza virus）能力[3-6]；德国的研究者也证明
海岸松也有较强的免疫增强作用[7]。但是，目前对
于红松松塔的研究仅限于成分分析[8-9]，其相关药理
学研究尚处于空白阶段。红松是东北地区的主要树
种，分布广，松塔产量高，但一直以来松塔仅仅作
为柴薪被废弃。本实验对红松松塔水溶性成分的提
取方法及其对小鼠免疫力的影响进行了研究，为红
松松塔的药用开发提供参考依据。

1 材 料
1.1 药材
红松松塔（采于黑龙江小兴安岭红松林区，并
经哈尔滨医科大学生药学教研室金锐教授鉴定为
Chin Pharm J，2009 July，Vol. 44 No. 13 中国药学杂志 2009 年 7 月第 44 卷第 13 期 ·990·
松科植物红松（Pinus koraiensis Sied.et Zucc)。
1.2 试剂
新生牛血清(杭州四季青生物公司，批号：
070614)，RPMI-1640 培养液(美国 Gibco 公司，批
号：070218)，PBS（博士德生物工程有限公司，批
号：070503），乳酸钠（博士德生物工程有限公司，
批号：070422），枸橼酸（博士德生物工程有限公
司，批号：070423），乳酸脱氢酶（LDH）底物：
NBT（硝基蓝四氮唑，Amresco 公司，批号：070302），
NAD＋（氧化型辅酶Ⅰ，Recho 公司，批号：061220），
PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐，Sigma 公司，批号：
070121），NP40（Amresco 公司，批号 070430），台
盼蓝（Sigma 公司，批号：2586B027），乙醇(天津
市富宇精细化工有限公司，批号：0710301)。
1.3 动物和细胞
昆明种小白鼠 100 只，雄性，体重 18~22 g，（哈
尔滨医科大学实验动物中心）。Yac-1 细胞(哈尔滨医
科大学免疫教研室惠赠)。
1.4 仪器
Nikon IMT-413 倒置显微镜；CO2 培养箱
（Thermo 公司）；医用超净工作台（苏州市洁净空
调设备厂）； Elx800 型酶联免疫检测仪（BIO-TEK
公司），电热套（DRT-W 型，巩义市予华仪器有限
公司），中药粉碎机（DFY-500，山东青州三宝中
药厂）等。

2 方 法
2.1 正交实验法优选松塔水溶性成分工艺
2.1.1 单因素考查 将去籽后的红松松塔用体积
分数 95%乙醇浸泡脱脂 24 h，晾干后粉碎至不同粒
度（20、40、80 目）以备用。称取同量的不同粒度
的松塔粉，加 8 倍体积的水，加热回流提取 1 h，
提取液趁热过滤，滤液浓缩后真空干燥 2 h(60 ℃，
-0.09 MPa)，置干燥器中冷却 0.5 h，迅速称重，计
算质量提取率。以值最高者为最佳条件。
2.1.2 正交实验 为全面考察提取工艺参数，本实
验以质量提取率为指标，选取影响较大的 3 个因素，
每个因素分 3 个水平：溶剂用量 A(料液比，1∶8，
1∶16，1∶24)、提取次数 B(1 次、2 次、3 次)、提
取时间 C(1，1.5，2 h)，采用加热回流提取法，按
照 L9(34)安排正交实验方案。①实验方法：称取 20
目红松松塔粉 900 g，平均分成 9 份，每份 100 g，
按照 L9(34)进行加热回流提取，提取液滤过，经减
压回收溶剂至干后，真空干燥 2 h(60 ℃，-0.09
MPa)，准确称重，计算质量提取率。并对所得实验
结果进行方差分析。②验证实验：取同一红松松塔
粉末 3 份，各 30 g，用最佳工艺提取，采用上述方
法测定，验证工艺的稳定性和可行性。
2.2 药效实验样品的制备
将红松松塔用体积分数 95%乙醇浸泡脱脂后，
用“2.1”中所得实验条件提取，得红松松塔总提物
（以下简称总提物）。将总提物用 AB-8 型大孔吸附
树脂分离，用蒸馏水洗柱，浓缩洗脱液得到红松松
塔水洗物（以下简称水洗物），水洗后用体积分数
40%乙醇洗柱，浓缩洗脱液得到红松松塔醇洗物（以
下简称醇洗物）。将得到的样品用生理盐水配制成
不同浓度的溶液，备用。阴性对照组用生理盐水。
2.3 LDH 底物溶液的配制(临用现配)
NBT 4 mg、NAD 10 mg、PMS 1 mg，加蒸馏
水 2 mL 溶解，混匀后取上清液 1.6 mL，加 1 mol·L-1
乳酸钠 0.4 mL，然后加入 PBS(pH 7.4)至 10 mL。
2.4 红松松塔水提物体外对小鼠自然杀伤细胞
(natural killing cells)活性的影响实验
2.4.1 靶细胞制备 取传代培养 24～28 h 对数生
长期的 YAC-1 细胞，用 RPMI-1640 培养液洗涤 2
次， 1 000 r·min-1 离心 5 min。10%FCS-RPMI-1640
培养液重悬细胞，并用 0.5%台盼蓝染色检测细胞存
活大于 95%，调整细胞浓度至 1×105个·mL-1。
2.4.2 效应细胞制备 将小鼠颈椎脱位处死，无菌
取脾脏，除去脂肪膜等，放入加有约 5 mL PBS 液
的平皿中，用 5 mL 注射器抽取平皿内液体缓缓注
入脾脏内，将脾细胞冲洗出来。如此反复冲洗，直
到脾脏变白为止（约冲洗 5～6 次），将细胞移入离
心管内，离心洗 1 次，1 000 r·min-1 离心 5～10 min，
重复洗 1 次，用 10％FCS-RPMI-1640 培养液重悬细
胞，计数细胞，并调细胞为 1×107 个·mL-1。将调好
的细胞接种至 96 孔板中，每孔 0.1 mL，同时加入
配制好的不同浓度的样品，共育 24 h 后加入靶细
胞。
2.4.3 孵育 取靶细胞 0.1 mL（效应细胞浓度：靶
细胞浓度=100∶1）加入细胞培养板中，同时设靶
细胞自然释放孔（0.1 mL 靶细胞＋0.1 mL 10％
FCS-RPMI-1640 培养液）和最大释放孔（0.1 mL 靶
细胞+0.1 mL 1％NP40 液），1 000 r·min-1，低速离心
2 min。置 37 ℃，5％CO2孵育 2 h。2 h 后以 1 000
r·min-1，离心 5 min。
2.4.4 测定 吸取各孔上清 0.1 mL 加至新 96 孔板
中，每孔再加入 0.1 mL 新配制的 LDH 底物溶液，
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室温避光反应 10～15 min。加入 30 µL 1 mol·L-1 枸
橼酸终止液终止酶促反映。酶联监测仪在 570 nm
波长下读各孔 A 值。
2.5 红松松塔水提物体内对小鼠自然杀伤细胞活
性的影响实验
①将 100 只昆明小鼠按体重随机分成 10 组，
每组 10 只，设阴性对照组、总提物组、水洗物组
和醇洗物组，3 个受试组均设立低、中、高浓度组。
分组后，灌胃给药 1 次·d-1，灌胃体积为 0.2 mL，
每 1 mL 含生药提取物量为 50 g，连续 15 d。②靶
细胞制备：同体外实验。③效应细胞制备：细胞调
整方法同体外实验，得到细胞悬液后直接与靶细胞
共育。④孵育：方法同体外实验。
2.6 数据分析
所有的实验均重复 3 次，数据采用 SPSS13.0
软件处理。组内比较采用单因素方差分析，组间比
较采用 t 检验。
根据下列公式计算自然杀伤细胞活性［自然杀
伤 细 胞 的 活 性 （ 100% ） ＝
100A A
A A
− ×−
实验组 值 自然释放孔 值 ％最大释放孔 值 自然释放孔 值 ］。将实验组与
阴性对照组比较，P<0.05 者视为有活性。

3 结 果
3.1 单因素考查
当红松松塔粉碎为 3 个不同粒度时，其提取率
分别为：20 目为（12.15±0.65）%、40 目为（10.1±0.32）
%、80 目为（9.9±0.57）%。由结果可知，将红松
松塔粉碎成 20 目为最佳条件。
3.2 正交实验
结果见表 1，方差分析结果见表 2。由表 1 和
表 2 可知，A、B、C 3 个因素对红松松塔水溶性成
分质量提取率的影响次序为 A>B>C。提取时间和提
取次数对提取效率有显著影响，所以提取时间选择
A1；提取次数选择 B1；料液比对提取效率无显著
影响，从降低生产成本的角度出发，本实验条件选
择 C1；故提取的最佳工艺为 A1B1C1，即提取时间
为 1 h，提取次数为 1 次，料液比为 1∶8。
3.3 验证实验
验证实验结果与正交实验基本一致，说明工艺
稳定可行。验证实验结果见表 3。
3.4 红松松塔水提物体外对小鼠自然杀伤细胞活
性的影响
实验结果见表 4，由表 4 可知，红松松塔提取
物在体外能明显增强小鼠自然杀伤细胞杀伤活性，
且随着浓度的增加，活性呈上升趋势。其中醇洗物
在体外提高小鼠自然杀伤细胞的活性最明显，水洗
物较弱。
3.5 红松松塔水提物体内对小鼠自然杀伤细胞活
性的影响

表 1 L9(34)正交实验设计及结果. ±x s
Tab.1 Results of orthogonal test. ±x s
A B C
No.
Time Number of times Dosage ratio
Quality extraction
Ratio / %
1 1 1 1 11.30±0.08
2 1 2 2 10.30±0.05
3 1 3 3 11.40±0.02
4 2 1 2 10.60±0.09
5 2 2 3 9.80±0.11
6 2 3 1 10.20±0.05
7 3 1 3 10.10±0.08
8 3 2 1 9.50±0.07
9 3 3 2 10.00±0.06
K1 33.60 32.00 31.00
K2 30.60 30.20 31.50
K3 29.60 31.60 31.30
93.80±0.07

表 2 水溶性物质质量提取率方差分析结果表
Tab.2 Results of analysis of variance
Source SS f F P
A 2.89 2 200.00 <0.05
B 0.60 2 41.23 <0.05
C 0.04 2 2.92
Error 0.03 2

表 3 验证实验结果
Tab.3 Results of verification test
Times Quality extraction ratio/% RSD/%
1st 11.86
2nd 11.83
3rd 11.79
0.056

表 4 各提取物不同浓度对小鼠自然杀伤细胞影响的体外
实验结果. n=10， ±x s
Tab.4 Effect of different concentrations on mice natural
killing cells in vitro. n=10， ±x s
Cytoactive/% Extracts
concentrations
/g·L-1 Total extracts Eluted by water Eluted by 40% ethanol
0.012 15.9±0.07 16.2±0.11 17.3±0.05
0.12 19.9±0.091) 22.5±0.091) 23.9±0.041)
1.2 23.1±0.061) 26.2±0.081) 29.1±0.052)
2.4 25.6±0.051) 30.1±0.102) 35.5±0.032)
注：同阴性对照组比较；1)P<0.05， 2)P <0.01
Note：1)P <0.05, 2)P <0.01, vs control
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实验结果见表 5。由表 5 可知，在连续灌胃给
药 15 d 后，各受试组小鼠自然杀伤细胞杀伤活性均
有所提高，且活性与剂量呈正相关。其中红松松塔
总提物和醇洗物对小鼠自然杀伤细胞活性的影响
较明显，其中醇洗物的活性最明显，水洗物不具有
此活性。

4 讨 论
中药在传统应用中均以水煎剂常见，在民间流
传用松塔煮水喝治疗胃癌的偏方，说明其有效成分
极有可能是水溶性的。在提取条件优化过程中，提
取时间越短质量提取率越高，其原因可能为某些物
质经过太长时间的受热已经分解或者固化，而导致
质量提取率下降。而提取次数越多，质量提取率反
而越低，可能是因为药材反复受热，存在着同样的
原因。料液比之所以对提取效率没有影响，其原因
可能是即使使用最低量进行提取，即料液比为 1∶8
时，提取出的物质也没有达到饱和。利用正交实验
设计法优化传统提取方法，有利于减少成本和时
间。
小鼠自然杀伤细胞是一种重要的免疫细胞，是
机体重要的非特异性防御机能之一，它作为一类独
立的淋巴细胞群，无需抗原预先致敏即可直接杀伤
靶细胞，包括肿瘤细胞、病毒或细菌感染的细胞以
及机体某些正常细胞，同时，它可溶解靶细胞如特
异性肿瘤细胞株和受细胞内病原体感染的细胞，还
可通过分泌炎性介质介导 T 细胞的分化，而控制 T
细胞反应，因而被视为机体免疫防御系统的第一道
防线。

表 5 各提取物不同浓度对小鼠自然杀伤细胞影响的体内
实验结果. n=10， ±x s
Tab.5 Effect of different concentrations on mice natural
killing cells in vivo. n=10， ±x s
Cytoactive/% Extracts
concentrations
/g·L-1 Total extracts Eluted by water Eluted by 40% ethanol
25 30.38±0.321) 23.82±0.23 47.71±0.122)
50 32.03±0.181) 24.63±0.19 50.52±0.182)
75 33.55±0.211) 25.11±0.31 51.25±0.092)
100 34.91±0.221) 26.92±0.16 53.24±0.112)
注：同阴性对照组比较；1)P<0.05， 2)P<0.01
Note：1)P <0.05，2)P<0.01，vs control

经本实验证明，红松松塔水提物(包括总提物、
水洗脱物和乙醇洗脱物)在体外能提高小鼠自然杀
伤细胞的活性；红松松塔总提物和乙醇洗脱物在体
内均能明显提高小鼠自然杀伤细胞的活性，而水洗
脱物没有此效果。体内外实验结果出现差异的原因
可能为：样品口服后，在机体中会经过吸收、分布、
代谢和排泄这 4 个过程，有些在体外有效的成分经
过这些过程后可能会被分解或有些在体外因为各
组分之间的掩盖作用而没有显示的药效在体内会
有体现，而体外实验是样品直接作用于靶细胞，没
有这些复杂因素的影响，因而体内外的实验结果会
有一些不同，具体机制还有待于进一步研究。
综上所述，红松松塔水溶性物质能够增强机体
的自然杀伤细胞活性，即是能够增强机体的固有免
疫力。本实验结果可以为红松松塔的药用研发提供
治疗方向的参考依据。
致谢：衷心感谢哈尔滨医科大学免疫学教授徐红薇及硕士研
究生路丹对本实验的帮助。

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