全 文 ：收稿日期:2013-06-04
基金项目:湖北省自然科学基金创新群体项目(2009CDA115);湖北省研究与开发计划项目(2011BBB061) ;湖北省中小企业技术创新项目
(2012JLA073)
作者简介:肖浩(1986-)，男，在读硕士研究生，专业方向:野生植物资源保护与利用;E-mail:xiaohao8684@ 126. com。
* 通讯作者:郑小江，E-mail:hbzxj123@ 126. com。
响应面法优化发酵藤茶黄酮和多糖的综合提取工艺
肖 浩1，2，郑小江1*
(1. 生物资源保护与利用湖北省重点实验室 /湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000;2. 湖
北省恩施土家族苗族自治州农业科学院，湖北 恩施 445000)
摘要 目的:探讨发酵藤茶黄酮和多糖的综合提取工艺。方法:根据单因素试验的结果，采用响应面分析法优
化藤茶黄酮和多糖的综合提取工艺。结果:最佳提取工艺条件为:提取温度 96 ℃，时间 1. 6 h，料液比 1∶ 21。在此
工艺条件下，总黄酮提取得率为 22. 94%，多糖提取得率为 2. 13%。结论:为藤茶黄酮和多糖的综合提取工艺提供
了参考，有利于藤茶资源的综合开发利用。
关键词 发酵藤茶;黄酮;多糖;响应面法;综合提取
中图分类号:Ｒ286. 1 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)12-2028-06
Ｒesponse Surface Analysis for Optimization of Comprehensive Extraction of Flavonoid and
Polysaccharide in Fermented Ampelopsis grossedentata
XIAO Hao1，2，ZHENG Xiao-jiang1
(1. The Key Laboratory in Hubei Province About Biological Ｒesources Protection and Utilization in Hubei Institute For Nationalities /
College of Biological Science and Technology，Hubei Institute for Nationalities，Enshi 445000，China;2. Academy of Agricultural Sci-
ences of Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture，Enshi 445000，China)
Abstract Objective:To explore the comprehensive extraction conditions of flavonoid and polysaccharide in fermented Ampelopsis
grossedentata. Methods:On the basis of single factor experiments，response surface analysis (ＲSA)was used to optimize the extraction
of flavonoid and polysaccharide in fermented Ampelopsis grossedentata. Ｒesults:The optimal conditions were as follows:temperature
96 ℃，time 1. 6 h，solid-liquid ratio 1∶ 21. Under these conditions，the total flavonoids extraction yield was 22. 94%，the polysaccharide
extraction yield was 2. 13% . Conclusion:This study provides a reference for the comprehensive extraction of flavonoid and polysaccha-
ride in fermented Ampelopsis grossedentata，and lays a foundation for the comprehensive development and utilization of Ampelopsis
grossedentata.
Key words Fermented Ampelopsis grossedentata(Hand． -Mazz．)W． T． Wang;Flavonoid;Polysaccharide;Ｒesponse surface analy-
sis;Comprehensive extraction
藤茶为葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄 Ampe-
lopsis grossedentata (Hand． -Mazz．)W. T. Wang 的加
工品，俗称山甜茶、白茶、甘露茶、白毛猴、龙须茶、茅
岩莓茶等，主要分布于我国湖南、湖北、云南、贵州、
广东、广西、福建等地〔1，2〕。研究表明，藤茶中含有
黄酮、多糖、多酚、蛋白质、氨基酸等多种活性成分，
其中最主要的活性成分是以二氢杨梅素为主的黄酮
类物质〔3〕。同时藤茶多糖也具有抗氧化、抗肿瘤、
增强免疫力等功能，具有较高的开发利用价值〔4，5〕。
本文以发酵型藤茶加工后的边角料为试验材料，采
用热水浸提法，综合提取藤茶中的黄酮和多糖，然后
分离纯化，得到黄酮和多糖两类活性成分。该方法
工艺简单，成本低，提取得率较高，环保，适合工业化
连续生产，可为藤茶有效成分的综合开发利用提供
技术支持。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 1100 型液质联用仪(美国 Agilent 公
司);UV1100 紫外-可见分光光度计(北京瑞利分析
仪器公司);BC-Ｒ203 旋转蒸发器(上海贝凯生物化
工设备有限公司);GXZ-9140 数显鼓风干燥箱(海
博讯实业有限公司医疗设备厂);FA10048B 电子天
平(上海精密科学仪器有限公司);DFY-500 摇摆式
高速中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)。
1. 2 材料 试验所用材料“白露”为发酵型藤茶加
工后的边角料，由笔者郑小江教授鉴定为葡萄科蛇
葡萄属植物显齿蛇葡萄 Ampelopsis grossedentata
(Hand. -Mazz．)W. T. Wang 的加工品，2003 年通过
了品种审(认)定〔6〕。将藤茶加工后的边角料于
60 ℃鼓风干燥箱中烘干，粉碎，过 60 目筛，石油醚
(60 ～ 90 ℃)脱脂，保存备用。
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2 方法与结果
2. 1 浸提指标测定方法
2. 1. 1 总黄酮含量测定标准曲线绘制〔7〕:称取二
氢杨梅素对照品 5 mg，置于 50 mL 量瓶中，用 70%
乙醇溶解并定容，配制成 100 μg /mL 的对照品溶
液。吸取上述对照品溶液 0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5
mL，分别置于 10 mL量瓶中，用 70%乙醇定容至刻
度，在 292 nm下测定吸收度，以对照品浓度为横坐
标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得标准曲线方
程:Y1 = 0. 0383X1 + 0. 0091，r1 = 0. 9996，线性范围为
5. 0 ～ 25 μg /mL。
样品测定:取藤茶浸提液 0. 2 mL，用 70%乙醇
稀释 100 倍后在 292 nm下测定吸收度值，根据标准
曲线计算样品溶液中的总黄酮含量。
2. 1. 2 多糖含量测定标准曲线绘制〔8〕:精密称定
干燥至恒重的葡萄糖对照品 10 mg，用蒸馏水溶解
并定容至 100 mL 量瓶中，配成 0. 1 mg /mL 的对照
品溶液。分别吸取对照品溶液 0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、
1. 0 mL置 10 mL具塞试管中，各加入蒸馏水补充至
1 mL，加入 0. 2%硫酸-蒽酮试液 4 mL 摇匀，浸于冰
水浴中冷却，然后移至沸水浴中加热 10 min，取出用
冷水冷却至室温，室温放置 10 min 左右，于 620 nm
处测定吸光度。另精密吸取蒸馏水 1 mL，同法操
作，作为空白对照。标准曲线方程:Y2 = 0. 0317X2 －
0. 0012，r2 = 0. 9996，线性范围为 4. 0 ～ 20 μg /mL。
样品测定:取藤茶浸提液 5 mL，加入 3 倍体积
无水乙醇，摇匀，静置过夜，离心取沉淀，加水溶解定
容至 100 mL。取 1 mL 溶液参与反应，方法同标准
曲线。根据标准曲线计算样品中的多糖含量。
2. 2 单因素试验
2. 2. 1 浸提温度的影响:设定料液比 1∶ 20，提取时
间为 2 h，提取 1 次(下同)，不同浸提温度下的总黄
酮和多糖提取得率见图 1。随提取温度的升高而提
取的得率增加，且增加的幅度较大。当温度达到 85
℃后，增幅开始降低，考虑到生产成本及黄酮成分的
稳定性，选择 85 ℃为较合适的提取温度。
2. 2. 2 浸提时间的影响:设定料液比 1∶ 20，提取温
度为 85 ℃，不同浸提时间下的总黄酮和多糖提取得
率见图 2。随提取时间的延长而含量增加，但增加
的幅度不大。当时间达到 2. 5 h 后，虽然多糖提取
得率增大，但黄酮提取得率开始下降，可能是提取
时间的延长增加了杂质的溶出量，或者是黄酮成
分结构发生了变化。另外，提取时间的延长降低
了生产的效率。综合考虑，选择 2. 5 h为最佳的提
取时间。
图 1 浸提温度对藤茶黄酮和多糖提取得率的影响
图 2 浸提时间对藤茶黄酮和多糖提取得率的影响
2. 2. 3 液料比的影响:设定提取温度为 85 ℃，提
取时间为 2. 5 h，不同液料比下总黄酮和多糖提取得
率见图 3。从图 3 可以看出，随着液料比的增加，总
黄酮和多糖提取得率均升高，在液料比为 20∶ 1 时达
到最大值，随后开始下降，故选择 20∶ 1 为最佳的液
料比。
图 3 液料比对藤茶黄酮和多糖提取得率的影响
2. 3 响应面分析 根据单因素试验结果，采用
Box-behnken 设计试验方法对浸提温度、浸提时间、
料液比 3 个因素(分别以 A、B、C 代码表示)进行优
化。三个试验水平分别以 － 1、0、1 进行因素编码，
试验设计方案见表 1，结果见表 2，方差分析见表 3、
表 4。
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表 1 Box-Behnken试验因素水平及编码
因素与水平 A浸提温度 /℃ B浸提时间 /h C料液比
－ 1 75 2. 0 1∶ 15
0 85 2. 5 1∶ 20
1 95 3. 0 1∶ 25
表 2 Box-Behnken设计方案与试验结果
试验号 A B C 总黄酮提取得率 /%
多糖提
取得率 /%
1 － 1 － 1 0 21. 66 1. 60
2 1 － 1 0 22. 48 1. 93
3 － 1 1 0 22. 78 1. 67
4 1 1 0 22. 32 2. 04
5 － 1 0 － 1 20. 88 1. 63
6 1 0 － 1 21. 50 1. 89
7 － 1 0 1 23. 07 1. 45
8 1 0 1 22. 94 2. 14
9 0 － 1 － 1 21. 99 1. 66
10 0 1 － 1 21. 34 2. 00
11 0 － 1 1 22. 84 1. 57
12 0 1 1 23. 50 1. 72
13 0 0 0 22. 52 1. 58
14 0 0 0 22. 74 1. 63
15 0 0 0 22. 81 1. 66
从表 3 和表 4 的方差分析中可以看出，模型 P
值均小于 0. 01，说明各响应值对该模型是非常显著
的，具有统计学意义。失拟项均为不显著，说明回归
方程与试验拟合情况好，试验误差小，可用该回归方
程对不同提取条件下的总黄酮和多糖提取率进行预
测。校正决定系数 ＲAdj分别为 0. 9190、0. 9252，表明
模型能解释 91. 90%和 92. 52%响应值的变化。
由表 3 可以看出，影响总黄酮提取得率的主次
因素顺序为:料液比 ＞浸提时间 ＞浸提温度。其中
C为极显著影响因素，交互项 BC 达到极显著水平，
AB达到显著水平，平方项 A2、C2 达到显著水平。
藤茶总黄酮提取得率的回归方程:
Y1 = 22. 69 + 0. 11A + 0. 17B + 0. 79C － 0. 32AB
－ 0. 19AC + 0. 42BC － 0. 3A2 － 0. 075B2 － 0. 29C2。
经分析得，在 A = 1. 05，B = － 1. 75，C = 0. 21
时，即提取温度为 95. 5 ℃，时间为 1. 63 h，料液比为
1∶ 21. 05为提取藤茶总黄酮的最佳工艺条件，在此条
件下，总黄酮提取得率预测值为 22. 49%，多糖提取
得率为 2. 03%。
图 4 给出了当浸提温度、浸提时间、料液比其中
一个选取固定值时，其他两因素及其交互作用对藤
茶黄酮提取得率影响的响应曲面及等高线图。
表 3 藤茶总黄酮提取得率方差分析表
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
Model 7. 10 9 0. 79 18. 64 0. 0025 ＊＊
A 0. 090 1 0. 090 2. 14 0. 2038
B 0. 22 1 0. 22 5. 23 0. 0710
C 4. 93 1 4. 93 116. 56 0. 0001 ＊＊
AB 0. 41 1 0. 41 9. 68 0. 0265 *
AC 0. 14 1 0. 14 3. 32 0. 1278
BC 0. 70 1 0. 70 16. 48 0. 0097 ＊＊
A2 0. 34 1 0. 34 8. 12 0. 0358 *
B2 0. 021 1 0. 021 0. 49 0. 5147
C2 0. 31 1 0. 31 7. 22 0. 0435 *
残差 0. 21 5 0. 042
失拟项 0. 17 3 0. 055 2. 41 0. 3066
纯误差 0. 046 2 0. 023
总和 7. 31 14
相关系数 0. 9711
校正决定系数 0. 9190
变异系数 C. V. % 0. 92
注:* P ＜ 0. 05，显著水平;＊＊P ＜ 0. 01，极显著水平
等高线的形状可以反映出交互效应的强弱，椭
圆形表示交互效应显著，而圆形与之相反。从图 4
可以看出，浸提温度和时间的交互作用显著，提取时
间与料液比的交互作用显著，对藤茶黄酮提取得率
有较大影响。
由表4可以看出，影响多糖提取得率的主次因
·0302· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 12 期 2013 年 12 月
a料液比 = 1∶ 21. 05
b时间 = 1. 63 h
c温度 = 95. 5℃
图 4 试验因素及其交互作用对藤茶黄酮提取得率影响的响应曲面及等高线图
素顺序为:浸提温度 ＞浸提时间 ＞料液比。其中 A
为极显著影响因素，交互项 AC 达到极显著水平，平
方项 A2 达到极显著水平。藤茶多糖提取得率的回
归方程:Y2 = 1. 62 + 0. 21A + 0. 046B + 0. 01AB +
0. 11AC + 0. 027BC + 0. 15A2 + 0. 036B2。
经分析得，在 A = － 0. 016，B = 0. 065，C = －
1. 87，即提取温度为 84. 84 ℃，时间为 2. 53 h，料液
比为 1∶ 10. 65 为提取藤茶多糖的最佳工艺条件，在
此条件下，多糖提取得率预测值为 1. 62%，总黄酮
提取得率为 20. 15%。
图 5 给出了当浸提温度、浸提时间、料液比其中
一个选取固定值时，其他两因素及其交互作用对藤
茶多糖提取得率影响的响应曲面及等高线图。
由图 5 可以看出，浸提温度和料液比的交互作
用显著，浸提取时间与料液比的交互作用显著，对藤
茶多糖提取得率有较大影响。
·1302·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 12 期 2013 年 12 月
a料液比 = 1∶ 10. 65
b时间 = 2. 53 h
c温度 = 84. 84 ℃
图 5 试验因素及其交互作用对藤茶多糖提取得率影响的响应曲面及等高线图
综合以上分析，采用提取总黄酮的最佳工艺对
黄酮和多糖的提取得率均较高，可作为两者同时提
取的最佳工艺。由此确定，综合提取藤茶总黄酮和
多糖的最佳工艺条件为:浸提温度 95. 5 ℃，浸提时
间 1. 63 h，料液比 1∶ 21. 05。
2. 4 验证试验 结合模型预测的最佳工艺条件，
根据实际情况调整浸提温度为 96 ℃，浸提时间为
1. 6 h，料液比为 1∶ 21，按此工艺进行验证试验，结果
总黄酮提取得率为 22. 94%，多糖提取得率为
2. 13%，验证试验结果与预测值接近，进一步验证了
模型与试验结果的可靠性。
·2302· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 12 期 2013 年 12 月
表 4 藤茶多糖提取得率方差分析表
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
Model 0. 49 9 0. 055 20. 25 0. 002 ＊＊
A 0. 34 1 0. 34 125. 65 ＜ 0. 0001 ＊＊
B 0. 017 1 0. 017 6. 32 0. 0536
C 0. 000 1 0. 000 0. 000 1. 0000
AB 4. 0 × 10 －4 1 4. 0 × 10 －4 0. 15 0. 7166
AC 0. 046 1 0. 046 17. 07 0. 0091 ＊＊
BC 3. 025 × 10 －3 1 3. 025 × 10 －3 1. 12 0. 3389
A2 0. 084 1 0. 084 31. 02 0. 0026 ＊＊
B2 4. 741 × 10 －3 1 4. 741 × 10 －3 1. 75 0. 2431
C2 4. 103 × 10 －5 1 4. 103 × 10 －5 0. 015 0. 9068
残差 0. 014 5 2. 708 × 10 －3
失拟项 0. 010 3 3. 425 × 10 －3 2. 10 0. 3391
纯误差 3. 267 × 10 －3 2 1. 633 × 10 －3
总和 0. 51 14
相关系数 0. 9733
校正决定系数 0. 9252
变异系数 C. V. % 3. 02
注:＊＊P ＜ 0. 01，极显著水平
3 结论与讨论
应用响应面分析法优化的藤茶黄酮和多糖的综
合提取工艺条件为:浸提温度 95. 5 ℃，浸提时间
1. 63 h，料液比 1:21. 05。根据实际情况调整浸提温
度为 96 ℃，浸提时间为 1. 6 h，料液比为 1 ∶ 21。按
此模型进行验证试验，其结果为总黄酮提取得率为
22. 94%，多糖提取得率为 2. 13%。
本文以“白露”发酵型藤茶加工后的边角料为
试验材料，探讨了黄酮和多糖的综合提取工艺，希望
能为藤茶有效成分的综合开发利用提供技术指导。
从本试验的结论可以看出，藤茶加工后的下脚料中
还含有较多的黄酮和多糖，可作为一种开发天然产
物的资源加以充分利用，能减少资源浪费，同时也能
提高藤茶的综合经济价值。
致谢:感谢湖北省林学一级学科硕士点(湖北民族学院)对本实
验的资助。
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