全 文 ：土槿皮乙酸 B不通过 Fas途径诱导人乳腺癌
MCF-7细胞凋亡和 M期周期阻滞
于静华 1 ,田代真一 2 ,小野寺敏 2 ,池岛乔 1
(1.沈阳药科大学中日医药研究所 ,辽宁 沈阳　110016;2.昭和药科大学病态科学教研室 , 东京　194-8543, 日本)
中国图书分类号:R284.1;R329.25;R329.28;R737.902.2;
R977.6;R979.1
文献标识码:A　文章编号:1001-1978(2008)11-1509-05
摘要:目的　初探土槿皮乙酸 B(PAB)诱导人乳腺癌 MCF-7
细胞凋亡和周期阻滞。方法　MTT法测定PAB对 MCF-7细
胞的生长抑制情况;相差显微镜观察细胞形态变化;荧光显
微镜观察经 Hoechst33258染色的 DNA变化;流式细胞仪检
测用 PI染色后 MCF-7细胞的周期分布;免疫印迹实验检测
相关蛋白的表达。结果　PAB时间剂量依赖性的抑制 MCF-
7细胞生长。 4 μmol· L-1 PAB在 24 h使 DNA皱缩 , 在 36
和 48 h使 DNA皱缩的细胞死亡。 4 μmol· L-1 PAB时间依
赖性的促进 PARP〔poly-(ADP-ribose)polymerase〕的剪切。
在 36hPAB剂量依赖性的增加 cdc2和核内 cyclinB1的表
达。 Fas拮抗性抗体 UB2不影响 PAB诱导的凋亡 ,但 Fas激
动性抗体 CH11促进 PAB诱导的凋亡。并且 UB2不影响
PAB诱导的细胞周期阻滞 , Fas激动性抗体 CH11不影响 G1
和 S期 , 但促进凋亡特征性的亚二倍体峰生成。结论　 4
μmol· L-1的 PAB通过凋亡方式可明显地抑制 MCF-7细胞
生长 , 并促进 M期阻滞。 Fas途径不参与 PAB诱导的凋亡
和周期阻滞。
关键词:土槿皮乙酸 B(PAB);凋亡;M期阻滞;人乳腺癌
MCF-7细胞
收稿日期:2008-07-08,修回日期 2008-09-01
作者简介:于静华(1978-), 女 ,博士生 , Tel:024-23986973, E-mail:
yjh-0-2002@ 163.com;
池岛乔(1947-),男 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向:免疫
药理学 , 通讯作者 , Tel:024-23844463, E-mail:ikejimat@
vip.sina.com
　　土槿皮为松科植物金钱松的干燥根皮或近根树
皮 ,土槿皮乙酸(PAB)是从土槿皮中分离得到的新
型二萜酸化合物 ,现代药理实验研究表明 , PAB具
有抗真菌[ 1] ,抗肿瘤[ 2] ,抗血管生成[ 3] 、抗微管 [ 4]等
药理作用。该研究以现代医学的研究方法 ,证实了
PAB可通过凋亡和周期阻滞抑制人乳腺癌细胞
MCF-7细胞的生长 , Fas途径不参与其诱导的凋亡
和周期阻滞 。为进一步探讨 PAB对乳腺癌的治疗
作用机制提供了依据 。
1　材料与方法
1.1　药品与试剂　土槿皮乙酸 B(pseudolarixacid
B)购于中国药品生物制品检定所;应用时用二甲基
亚砜 (DMSO)溶解 , 并使 DMSO的终浓度低于
0.1%。甲基噻唑蓝 (MTT), Hoechst33258, DMSO、
碘化丙啶 (PI)和 RNaseA均为 Sigma产品;PARP
〔poly-(ADP-ribose)polymerase〕、FADD、FasL、cdc
2、cyclinB1、β -actin抗体及辣根过氧化物酶标记的
羊抗兔二抗购自 SantaCruzBiotec(CA, USA)。 Fas
激动性抗体 (cloneCH-11)和 Fas拮抗性抗体
(cloneUB2)购自 MedicalandBiologicalLaboratories
(Nagoya, Japan)。 RPMI1640 培养 基 (Gibco,
USA),胎牛血清(北京元亨圣马生物试剂公司)。
1.2　细胞培养　人乳腺癌细胞(MCF-7)购自美国
AmericanTypeCultureColection(ATCC)。细胞单
层接种在含 10%胎牛血清 、20g· L-1谷氨酰胺的
RPMI1640培养液中 ,在 37 ℃, 5%CO2培养箱中培
养。
1.3　实验方法
1.3.1　细胞生长抑制实验　取处于对数生长期的
MCF-7细胞接种于 96孔培养板中(细胞数为每孔 1
×104个),每孔 100 μl培养 12h后再加入 0、1.25、
2.5、10μmol· L-1的 PAB,每个浓度设平行孔 3个 ,
于 37 ℃, 5% CO2培养箱中继续培养 12、24、36和
48 h,每孔加入 5 g· L-1 MTT20 μl,继续培养 3 h
后 ,加入 150 μlDMSO溶解 ,于酶标仪 492 nm处检
测 ,计算药物的体外生长抑制率。
1.3.2　Hoechst33258荧光染色分析细胞凋亡时
DNA的变化　细胞爬片 12 h后 。加入 0、4 μmol·
L-1的 PAB作用 24、36和 48h后 ,去培养液 ,用 PBS
洗 1遍 。去 PBS后。用 4%的多聚甲醛固定 1h。去
多聚甲醛后 ,用 PBS洗 2次 ,加入终浓度为 5 mg·
L-1的 Hoechst33258染色 30min。封片。于激发波
长为 350nm,发射波长为 460 nm的荧光显微镜下
拍照 。
1.3.3　细胞形态学观察　细胞以每孔 1×105个接
种于 6孔板中 ,培养 12h后 ,加入 0、4μmol· L-1的
PAB, 100 μg· L-1 CH11和 4 μmol· L-1的 PAB,
·1509·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2008 Nov;24(11):1509 ～ 13
100μg·L-1 UB2和 4μmol· L-1的 PAB于 36 h用
光学显微镜观察拍照 。
1.3.4　流式细胞仪分析 PI染色后细胞的周期[ 5] 　
收集 0、4 μmol· L-1 PAB, 100 μg· L-1 CH11和 4
μmol· L-1 PAB, 100μg· L-1 UB2和 4μmol· L-1
PAB作用 36h后的 MCF-7细胞 , PBS洗涤后 ,加入
70%的乙醇 10 ml固定 24 h后离心去乙醇 ,加入 1
mlPI溶液 (50 mg· L-1 PI, 1 g· L-1柠檬素钠 ,
0.1% TritonX-100, 1 g· L-1 RNase)。冰上 ,暗处
染色 30 min。用流式细胞仪 (BetonDickinson,
FranklinLakes, NJ, USA)测定。
1.3.5　Westernblot分析蛋白质的表达 [ 6, 7] 　收集
1×106个以上细胞 , 1 000×g离心 10 min, PBS洗 2
次 , 80 μl细胞裂解液(50 mmol· L-1 HEPES, 1%
Triton×100, 100 mmol·L-1 NaF, 1 mmol· L-1 ED-
TA, 1mmol· L-1 EGTA, 2 mmol· L-1正钒酸钠 , 1
mmol·L-1 PMSF, 10 g· L-1 PepstatinA)于冰上裂
解 1h, 25 000×g离心 5min,收集上清 。加入 20μl
5×上样缓冲液〔250mmol·L-1 Tris-HCl(pH6.8),
100g·L-1 SDS, 50%甘油 , 5g·L-1溴酚兰 , 5%二
巯基乙醇 〕,沸水中煮 3 min,使蛋白变性 。每个点
样孔加样 20 μl样品液 , 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶
分离蛋白质 。凝胶上的蛋白带转移到硝酸纤维素膜
上 ,封闭液封闭膜上的蛋白结合位点 2 h。加入抗
FADD、Fas-L、PARP、cdc2和 cyclinB1的抗体 (一
抗)及辣根酶标记的二抗 ,显色 。细胞核内的蛋白
的获得:收集到的细胞并用 60 μl裂解液于 4℃冰
上裂解 1 h。裂解液包括(mmol· L-1):HEPES20,
KCl10, MgCl2 1.5, EDTA1, EGTA 1, dithiothreitol
(DTT)1, andPMSF1, pH7.5。裂解后 16 000 ×g
离心 20 min。收集到的细胞饼加入裂解液 15 μl,
4℃冰上裂解 15 min, 裂解液包括 20 mmol· L-1
HEPES, 25% glycerol, 420 mmol· L-1 NaCl, 1.5
mmol·L-1 MgCl2 , 0.2mmol·L-1 EDTA, 0.5mmol
· L-1 DTT, 0.5 mmol· L-1 PMSF, and5 mg· L-1
leupeptin。 12 000 ×g离心 10 min,其上清为核蛋
白 。
1.4　统计学分析 　所有实验均重复 3次 ,用 x±s
表示。采用 Students′st-test进行分析 。
2　结果
2.1　PAB对 MCF-7细胞的生长抑制作用　1.25、
2.5和 10μmol· L-1PAB作用不同时间后 ,对 MCF-
7细胞的细胞毒作用呈明显的时间和剂量依赖性
(Fig1)。
Fig1　InhibitoryefectofPABonMCF-7celgrowth( x±s, n=3)
Cels(1×104 cells/wel)wereincubatedwith1.25 μmol· L-1
(◇), 2.5μmol· L-1(□), and10μmol· L-1(○)PABforvarious
timeperiods.GrowthinhibitionwasevaluatedbyMTTmethod.
2.2　PAB对 MCF-7细胞 DNA的影响 　Hoechst
33258主要染细胞的 DNA。当凋亡发生时 ,因为细
胞核皱缩 ,经 Hoechst33258染色后 ,细胞核变亮蓝
色。 4μmol· L-1 PAB作用 24 h后 ,细胞核变亮的
细胞增加 , 36 h时 ,细胞核变亮的细胞最多。 48 h
时 ,细胞核变亮的细胞以凋亡的方式死亡 ,而细胞核
没有变亮的细胞仍然存活(Fig2)。
Fig2　DNAmorphologicalchangesofMCF-7cels
treatedwith4μmol· L-1 PAB
DNAmorphologicalchangesofMCF-7celswereobservedunderflu-
orescencemicroscopy.A:0h;B:24h;C:36h;D:48h.Arowsin
(B, C, D)indicatedthecondensednuclei.(A, B, C, D)bar=30μm.
2.3　PAB降解细胞 DNA修复蛋白　细胞凋亡执
行阶段的另一个重要特征是 PARP被 caspase降解
·1510· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2008 Nov;24(11)
而失活 [ 8] 。 Caspase-3是降解 PARP的最有效的
酶 [ 9] 。 4 μmol· L-1 PAB作用 24、36和 48 h后 ,
PARP被时间依赖性的降解(Fig3)。
Fig3　ExpressionofPARPin4μmol·L-1
PAB-treatedMCF-7cels
　　Celsweretreatedwith4μmol·L-1 PABfordiferenttimeperiods.
Celllysateswereseparatedby12% SDS-PAGE, andtheproteinexpres-
sionwasdetectedbyWesternblotanalysis
2.4　PAB对细胞周期蛋白表达的影响　CyclinB1
和 cdc2结合后可以促进细胞周期由 G2期向 M期
过渡。核内 cyclinB1的积聚及总的 cdc2的增加是
细胞 M期阻滞的标志 [ 10 ～ 12] 。 1、2、4、10 μmol· L-1
PAB作用 36h后 ,核内 cyclinB1和总的 cdc2表达
剂量依赖性的增加(Fig4)。
Fig4Theexpressionoftotalcdc2andcyclinB1innucleiof
MCF-7celswithdifferentdosesofPABtreatmentat36h
2.5　Fas途径不参与 PAB诱导的 MCF-7细胞凋
亡及细胞周期阻滞　CH11是 Fas受体激动性抗体 ,
促进凋亡。 UB2是 Fas受体拮抗性抗体 ,抑制凋亡 。
PAB作用 36h后 ,细胞浮起变圆 ,并出现凋亡小体 。
但加入 UB2后并没有减弱 PAB诱导的凋亡 。而加
入 CH11后却促进了 PAB诱导的凋亡 (Fig5)。用
流式细胞仪分析经 PI染色的 MCF-7细胞 ,发现流
式细胞仪与 Westernblot的结果一致 , PAB诱导 M
期阻滞。 PAB促进凋亡的亚二倍体峰出现 。而
UB2则不影响 PAB诱导的凋亡和周期阻滞。但
CH11加入后则促进 PAB诱导的亚二倍体峰的出
现 , CH11不影响 G1和 S期细胞的比率(Tab1),只
是通过促进凋亡的亚二倍体峰生成而减少 M期细
胞的比率(Fig6)。同时从 Westernblot结果 ,我们
可以看出 FADD、FasL的表达没有随剂量的改变而
变化(Fig7)。
Tab1　CelcycledistributionofPAB-treatedMCF-7celsat36h
Group Cellcycle/%Sub-G1 G0 /G1 S G2 /M
Control 4.73 60.66 20.25 14.36
PAB 20.36 9.90 11.44 58.30
PAB+UB2 18.53 11.09 12.96 57.42
PAB+CH11 46.87 8.45 12.56 32.12
Fig5TheefectofPABonmorphologicalchangesofMCF-7cels
　　Underphasecontrastmicroscopythemorphologicalalterationof
MCF-7celswasobservedafterPABtreatmentfor36 h.A:control;B:
thecelsweretreatedwithPAB4μmol·L-1;C:thecelsweretreated
withPAB4μmol· L-1 inadditionto100μg· L-1 UB2;D:thecels
weretreatedwith4μmol· L-1 PABinpresenceof100μg· L-1 CH11.
Arowsin(B, C, D)indicatetheapoptoticbody.(A, B, C, D)bar=
22.5μm.
Fig6　Flowcytometricanalysisofthecel
cycledistributioninMCF-7celsofPABtreatment
At36hMCF-7celswerecolectedandstainedbyPIstaining.A:0
μmol· L-1 PAB;B:4μmol· L-1 PAB;C:4μmol· L-1 PAB+100
μg· L-1 UB2;D:4μmol· L-1 PAB+100μg· L-1 CH11.
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Fig7　FADDandFasLproteinexpressionswerenotchanged
inMCF-7celswithdifferentdosesofPABtreatment
3　讨论
PAB时间剂量依赖性的抑制 MCF-7细胞的生
长 。倒置显微镜下可以观察到细胞浮起变圆 ,凋亡
小体增加。流式细胞仪显示 PAB作用后 , MCF-7细
胞有凋亡特征性的亚二倍体峰的产生 。并且 PAB
处理后 MCF-7细胞的 DNA皱缩 。说明 PAB通过凋
亡方式抑制 MCF-7细胞的生长 。 PAB是抗微管药
物 [ 4] ,而抗微管药物多诱导细胞 M期阻滞。本文发
现 PAB上调 cdc2和 核内 cyclinB1的表达 ,而 cdc
2和核内 cyclinB1上调是 M期周期阻滞的标志 ,这
与流式细胞分析结果相吻合 ,即 PAB诱导 MCF-7细
胞 M期周期阻滞 。PARP是 DNA损伤修复蛋白 ,其
可以在周期阻滞的情况下修复受损的 DNA,使细胞
能够正常地分裂增殖。 PAB时间依赖性的降解
PARP,使细胞在周期阻滞后不能修复损伤而导致细
胞的凋亡。 PARP是 caspase-3的底物之一 , caspase-
3使 PARP由 116 ku降解为 85 ku而失活形式 。但
MCF-7是 caspase-3 功能性缺失的人乳腺癌细
胞 [ 13] ,这说明除了 caspase-3,在 MCF-7细胞中还有
别的上游蛋白降解 PARP,具体是哪个上游蛋白发
挥作用 ,这需要我们进行更深一步的研究 。FasL与
Fas受体结合后 ,接头蛋白 FADD被募集到 Fas受体
的胞质结构域而启动凋亡 [ 14] 。 PAB不影响 Fas途
径相关蛋白 FasL、FADD的表达 。UB2对 PAB诱导
的凋亡没有影响 ,而 CH11则促进 PAB诱导的凋
亡 ,说明 PAB不通过 Fas途径诱导细胞凋亡 ,但
CH11则因激活了 Fas途径而协同 PAB诱导的凋
亡 。同时 UB2对 PAB诱导的 M期细胞周期阻滞没
有明显的影响 , CH11只是通过增加凋亡的亚二倍
体峰而减少 M期的比率 ,说明 Fas途径不参与 PAB
诱导的 M期周期阻滞。除了 Fas途径诱导细胞凋
亡外 ,线粒体途径和 MAPK家族也参与其中 ,我们
将对这两条途径进行研究 ,考察它们是否参与 PAB
诱导 MCF-7细胞的凋亡 。
总之 , PAB通过凋亡和周期阻滞抑制 MCF-7细
胞的生长。 Fas途径不参与 PAB诱导的凋亡和周期
阻滞。
参考文献:
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·1512· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2008 Nov;24(11)
PseudolaricacidBinducedapoptosisandmitoticarrest
circumventingFasreceptorpathwayinMCF-7cels
YUJing-hua1 , TASHIROShin-ichi2 , ONODERASatoshi2 , IKEJIMATakashi1
(1.China-JapanResearchInstituteofMedicalandPharmaceuticalSciences, ShenyangPharmaceuticalUniversity,
Shenyang　110016, China;2.DeptofClinicalandBiomedicalSciences, ShowaPharmaceuticalUniversity;Tokyo　19-8543, Japan)
Abstract:Aim　TostudythemechanismsofPseudola-
ricacidB(PAB)-inducedMCF-7 celapoptosisand
mitoticarrest.Methods　MTTasaywasperformedto
assessthecelgrowthinhibition, contrastphasemicro-
scopewasusedtoobservecelularmorphologicaltera-
tion, andthechangeofDNAwasdetectedbyfluores-
centmicroscopy.Thedistributionofcelcyclewasde-
terminedbyflowcytometricanalysisofpropidiumio-
didestaining, andtheproteinexpressionwasexamined
byWesternblotanalysis.Results　PABinhibited
MCF-7 celgrowthinadose-andtime-dependentman-
ner.4μmol· L-1 PABinducedDNAcondensationat
24 h.PABcleavedPARPinatime-dependentman-
ner.At36 h, PABup-regulatedtheexpressionofcdc
2 andnuclearcyclinB1.Fasantagonisticantibody
UB2 hadnoefectonapoptosis, butagonisticantibody
CH11 enhancedtheapoptosisinducedbyPAB.UB2
exertednoefectoncelcyclearest, andCH11 had
thesameactionasUB2 exceptforreducingthemitotic
arrestthroughenhancingapoptoticsubdiploidpeak.
Conclusion　 PAB inhibited MCF-7 cel growth
throughmitoticarestandapoptosis.Apoptosisandmi-
toticarestwereindependentofFaspathway.
Keywords:pseudolaricacidB;apoptosis;mitoticar-
rest;MCF-7 cel
蚤休醇提物对 H2 O2 损伤
的 ECV304细胞的细胞周期与凋亡的影响
高琳琳 1 ,李福荣1 ,康　莉 1 ,司艳红 1 ,王　浩2 ,胡维诚 3
(1.泰山医学院病理生理学教研室 , 山东 泰安　271000;
2.山东中医药大学基础医学院 , 山东 济南　250014;3.山东大学基础医学院 , 山东 济南　250012)
中国图书分类号:R284.1;R329.25;R329.28;R543.502.2;
R543.5053.1
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2008)11-1513-05
摘要:目的　制备中药蚤休醇提物 , 研究其对 H2O2诱导的
脐静脉内皮细胞(ECV304细胞)损伤的保护作用及其机制。
方法　体外培养 ECV304细胞 , 建立氧化损伤的细胞模型 ,
然后分为五个实验处理组:① 正常对照组;②氧化损伤组;
③高浓度蚤休醇提物(EFB500 ng· L-1)组;④中浓度蚤休
醇提物(50ng· L-1)组 , ⑤低浓度(5 ng· L-1)组。应用流
式细胞仪 AnnexinV/PI染色检测该药物干预 H
2
O
2
氧化损
收稿日期:2008-07-15,修回日期:2008-08-20
基金项目:山东省卫生厅青年项目基金资助项目(NoJZ43);山东省
泰安市科技局科技基金资助项目(No20051011)
作者简介:高琳琳(1966 -),女 ,博士 ,副教授 ,研究方向:动脉粥样
硬化发病机制 , Tel:0538-6225010, E-mail:Dejia99@ 126.
com;
王　浩(1945-), 男 ,教授 , 博士生导师 , 研究方向:中西
医结合研究动脉粥样硬化发病机制 ,通讯作者 , Tel:0531-
82613352, E-mail:wanghaoshenghua@hotmail.com
伤前后的细胞凋亡 、PI染色检测细胞周期与凋亡的关系;
RT-PCR检测各实验组 caspase-3 mRNA表达的变化。 结果
　采用流式细胞仪 PI染色检测结果对细胞周期进行分析 ,
表明损伤作用于 ECV-304细胞后 , 细胞在 G
0
/G
1
期的数目
增多 ,在 S期的数目减少 , 同时流式细胞仪检测可见亚二倍
体峰 ,而蚤休醇提物预处理以后 , S期细胞数明显增多。流
式细胞仪 AnnexinV/PI检测方法显示 ,损伤组的早期与晚期
凋亡率之和最高 ,预处理后细胞的早期与晚期凋亡率之和降
低。 caspase-3 mRNA水平在各实验组的表达显示损伤组与
内参照相比的灰度值最大 , 经过预处理之后其值明显下降
(P<0.01)。结论　蚤休醇提物可以保护 H2O2 造成的
ECV304细胞的氧化损伤 ,是通过保护细胞周期正常进行 、抑
制凋亡蛋白 caspase-3介导的凋亡信号转导通路实现的。
关键词:内皮细胞;蚤休醇提物;氧化;损伤;细胞周期;凋亡;
caspase-3
　　动脉粥样硬化(AS)的发生机制存在多种假说 ,
目前占主导地位的 “损伤一反应假说”和 “炎症说 ”
·1513·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBulletin　2008Nov;24(11):1513 ～ 7