全 文 ：第 27卷 ,第 3期 光　谱　实　验　室 Vo l . 2 7 , No . 3
2 0 1 0年 5月 Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory May , 2 0 1 0
铁苋菜黄酮类化合物的提取及
清除羟自由基作用的研究①
① 蚌埠医学院优秀人才基金 ( 2006BR068) ;蚌埠医学院科研课题基金 ( BY0749)资助项目
② 联系人 ,电话: ( 0552) 3175292;手机: ( 0) 13695525872; E-mail: wchj ros a@ 163. com
作者简介:王春景 ( 1972— ) ,男 ,安徽省砀山县人 ,讲师 ,硕士 ,主要从事天然植物资源开发利用研究工作。
收稿日期: 2009-09-23;接受日期: 2009-10-28
王春景②　刘高峰　李 晶　胡小梅
(蚌埠医学院生物科学系　安徽省蚌埠市东海大道 2600号　 233000)
摘　要　采用不同的提取剂对铁苋菜黄酮类化合物进行了提取 ,通过单因素实验及正交实验对铁苋
菜黄酮类化合物提取的工艺条件进行了探讨 ,对铁苋菜提取物的抗氧化活性进行了初步研究。 结果表明 ,
乙醇、水、甲醇、丙酮 4种提取剂 ,乙醇的提取效果最好 ,铁苋菜黄酮提取的最佳工艺条件是温度 80℃、乙醇
浓度 55% 、料液比 1∶ 35g /m L、提取时间为 3. 0h,此条件下黄酮的提取率为 90. 82%。铁苋菜黄酮类化合物
对羟自由基具有一定的清除作用。
关键词　铁苋菜 ;黄酮 ;提取工艺条件 ;羟自由基
中图分类号: O657. 32　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1004-8138( 2010) 03-0797-06
1　引言
黄酮类化合物具有抑菌消炎、抗氧化、抗衰老、抗癌防癌、抗病毒等诸多功效 ,已从多种植物中
发现了黄酮类化合物 [1— 4 ]。铁苋菜 ( Acalypha australis L. )是大戟科铁苋菜属的一年生草本植物 ,
广泛分布于平原或山坡较湿润耕地和空旷草地。关于铁苋菜化学成分的研究有过一些报道 [5, 6 ] ,但
对黄酮类化合物的最佳提取工艺条件研究未见报道 ,本文对铁苋菜黄酮类化合物的提取工艺条件
及抗氧化性进行了初步探讨 ,以期为铁苋菜的开发利用提供参考依据。
2　实验部分
2. 1　仪器、药品和材料
索氏提取器 ; HH-S 1-8数显恒温水浴锅 (金坛市正基仪器有限公司 ) ; UV-1800紫外 /可见分
光光度计 (北京瑞利分析仪器公司 ) ; DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱 (上海精密实验设备有限
公司 ) ; BS224S精密电子天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司 )。
芦丁 (南京替斯艾么中药研究所 ,批号: TCM 027-090216)、乙醇、石油醚、乙醚、水杨酸、 H2O2、
FeSO4、 NaOH、 NaNO2、 Al( NO3 ) 3 ,以上化学药品除 H2O2为 30%其余均为分析纯。实验材料铁苋菜
采于蚌埠市郊区。
2. 2　黄酮含量的测定
称取芦丁 10mg用体积分数 70%的乙醇溶解并定容至 100mL为标准液 ,吸取芦丁标准液 0. 0、
1. 0、 2. 0、 3. 0、 4. 0、 5. 0、 6. 0、 7. 0、 8. 0mL于 9支刻度试管中 ,分别加 0. 6mL 5% NaNO2 ,摇匀 ,静置
6min;加入 10% Al( NO3 ) 3 0. 6mL,摇匀 ,静置 6min;再加入 4% NaOH 8mL,用 70%乙醇定容至
20mL,摇匀 ,静置 15min,以 70%的乙醇为空白对照 ,以 510nm作为入射波长测吸光度 ,用最小二乘
法得校准曲线: y= 15. 377x- 0. 0082, r2= 0. 9996。
样品中的黄酮含量测定皆参照校准曲线制作的测定方法测定吸光度 ,再由回归方程计算出黄
酮 浓度 ,然后代入公式 m= VV2C /V1 ,计算出提取的铁苋菜黄酮类化合物的质量 ,再除以样品质量
便得黄酮类化合物的含量。式中: V——指提取液总体积 ; V1——从提取液中取出测吸光度的黄酮
液体积 ; V2—— V1经稀释后的体积 ; C—— 指回归方程算出的黄酮浓度 ; m——提取的铁苋菜黄酮
类化合物的质量。
2. 3　提取方法
2. 3. 1　提取工艺流程 [7, 8 ]
105℃杀青 30min 85℃恒温烘干后粉碎 过 40目筛 索氏提取器中 45℃乙醚脱脂
回流提取 石油醚除杂质 合并提取液并浓缩 烘干得粗黄酮粉。
2. 3. 2　不同提取剂对黄酮提取量的影响
称取粉碎过筛经乙醚充分脱脂后挥去乙醚的铁苋菜 2g每份共 12份 ,按 1∶ 30料液比分别加体
积分数 70%的乙醇、蒸馏水、甲醇、丙酮 , 75℃水浴提取 4次 ,每次 3. 0h合并 4次提取液 ,测定铁苋菜
黄酮含量 ,每种提取剂 3个重复 ,比较提取效果。
2. 3. 3　提取工艺条件优化
在上述实验的基础上 ,以提取温度、乙醇浓度、料液比和提取时间为考察因素分别做单因素实
验 ,然后每因素选取 4个水平 ,设计 L 16 ( 44 )正交实验 ,以铁苋菜黄酮含量为考察指标 ,从而确定最佳
提取工艺条件。
2. 4　铁苋菜提取液对羟自由基的清除作用
主要参照 Fenton反应原理及李贵荣 [ 9]等方法进行的。
在 13支试管中分别加入浓度均为 60mmol /L Fe2+ 、水杨酸 -乙醇溶液各 2mL,依次加入
0. 5mg /L的铁苋菜提取液 0、 0. 5、 1. 0、 1. 5、 2. 0、 2. 5、 3. 0、 3. 5、 4. 0、 4. 5、 5. 0、 5. 5、 6. 0mL,加蒸馏水
至 20mL,再分别加入 60mmol /L的 H2O2 2m L,摇匀 , 10min后以蒸馏水为参比 ,于 510nm处测吸光
度值 ,代入公式计算清除率。其清除率计算公式为:
图 1　不同提取剂对铁苋菜黄酮的提取效果
注:图中的数值为 3次重复的平均值±标准差
( X-± S )。
清除率 (% )= A0- Ax
A0
× 100
式中: A0——试剂空白液的吸光度 ; Ax——加提取液时的
吸光度。
3　结果与分析
3. 1　不同提取剂对黄酮提取量的影响
从铁苋菜中提取黄酮类化合物 ,乙醇、水、甲醇、丙酮
4种提取剂的提取效果不同 (图 1)。 结果表明 ,用乙醇提
取效果最好 ,用水做提取剂效果次之 ,甲醇的提取效果略
次于水的提取效果 ,丙酮的提取效果较差 ,故在工业生产及试验室中提取铁苋菜黄酮类化合物 ,选
择乙醇作为提取剂比较理想。
798 光谱实验室 第 27卷
3. 2　提取工艺条件的优化
3. 2. 1　提取温度对黄酮提取量的影响
称取铁苋菜 2g每份若干包 ,乙醚充分脱脂后挥去乙醚 ,按 1∶ 30加入 75%的乙醇 ,在不同温度
下水浴提取 3. 5h,过滤 ,等体积石油醚萃取 ,比色法测吸光度 ,代入公式求出黄酮提取量 (图 2)。
由图 2可知 ,随着温度升高 ,黄酮提取量随之提高。 85℃时黄酮的提取量有所下降 ,这可能由于
温度较高时 ,脂溶性杂质的溶出量加大 ,与黄酮竞争溶剂 ,使黄酮的提取量降低。 鉴于此 ,把提取温
度定为 65— 80℃作为进一步优化的温度选择范围。
3. 2. 2　乙醇浓度对黄酮提取量的影响
称取铁苋菜 2g每份若干包 ,乙醚充分脱脂后挥去乙醚 ,以 1∶ 30加入不同体积分数的乙醇 ,在
75℃水浴提取 3. 5h,过滤 ,等体积石油醚萃取 ,比色法测定吸光度代入公式求出黄酮提取量 ,得出
乙醇浓度与黄酮提取量的关系 (图 3)。
图 3表明 ,乙醇浓度为 55%时 ,黄酮提取量最高 ,随浓度进一步增加 ,黄酮提取量略有降低 ,但
75%的提取量仍高于 50%的提取量。 75%以后 ,黄酮的提取量随乙醇浓度增加下降较快 ,这可能因
为当乙醇浓度过高时 ,水溶性黄酮的溶出减少而脂溶性杂质如色素鞣质等溶出增多 ,这些杂质会和
脂溶性黄酮竞争溶剂 ,从而使黄酮提取量下降。而过多的杂质溶出 ,会给以后的纯化分离带来不便。
综合各因素考虑 ,把乙醇浓度定在 55%— 70%作为进一步优化提取条件的范围。
图 2　不同提取温度对铁苋菜黄酮提取量的影响 图 3　不同乙醇浓度对铁苋菜黄酮提取量的影响
3. 2. 3　料液比对黄酮提取量的影响
称取铁苋菜 2g每份若干包 ,乙醚充分脱脂后挥去乙醚 ,在 75℃ ,乙醇 75%时以不同的料液比提
取 3. 5h,过滤 ,等体积石油醚萃取 ,比色法测定吸光度代入公式求出黄酮提取量 ,得出料液比与黄
酮提取量的关系 (图 4)。
一般说来 ,溶剂用量越大 ,黄酮的提取量就越高 ,但当溶剂的量增大到一定值时 ,黄酮的提取量
会渐趋稳定。而过大的液料比会造成溶剂和能源的浪费 ,并增大了浓缩的工作量。由图 4可知 ,随着
料液比的增大 ,黄酮的提取量明显增大 ,至 1∶ 45后渐趋稳定。 这可能是由于黄酮的溶出已达到了
平衡 ,选择液料比 1∶ 30— 1∶ 45作为进一步优化的条件。
3. 2. 4　提取时间对黄酮提取量的影响
称取铁苋菜 2g每份若干包 ,乙醚充分脱脂后挥去乙醚 ,以 1∶ 30加入 75%的乙醇 , 75℃水浴提
取 1. 5— 5h(每次间隔 30min) ,过滤 ,等体积石油醚萃取 ,比色法测定吸光度代入公式求出黄酮提取
量 ,得出提取时间与黄酮提取量的关系 (图 5)。
由图 5可知 ,随着提取时间的增加 ,黄酮的提取量明显增加 , 4. 5h后 ,黄酮提取量渐趋稳定 ,并
逐渐下降 ,这可能是黄酮的浸出率达到了动态平衡 ,而时间过长 ,乙醇的挥发量增多 ,提取液的浓度
下降 ,同时 ,氧化分解的黄酮量也逐渐增多 ,黄酮的提取量因此下降。 基于上述考虑 ,选择 3. 0—
4. 5h作为进一步优化提取条件的时间范围。
799第 3期 王春景等:铁苋菜黄酮类化合物的提取及清除羟自由基作用的研究
图 4　不同料液比对铁苋菜黄酮提取量的影响 图 5　不同提取时间对铁苋菜黄酮提取量的影响
3. 2. 5　正交实验结果
在上述单因素实验的基础上 ,对影响铁苋菜黄酮提取量的因素 A温度、B乙醇浓度、C料液比、
D提取时间进行 4因素 4水平正交实验 ,各因素水平设计如下:
A1= 65℃ , A2= 70℃ , A3= 75℃ , A4= 80℃ ; B1= 55% , B2= 60% , B3= 65% , B4= 70% ; C1=
1∶ 30,C2= 1∶ 35,C3= 1∶ 40,C4= 1∶ 45; D1= 3. 0h,D2= 3. 5h, D3= 4. 0h,D4= 4. 5h。
正交实验结果见表1,由表 1可看出 ,第 13号实验 ( A4B1C4D2 )黄酮提取量最高。对比 T值、 R值 ,
铁苋菜黄酮提取的最佳工艺条件为 A4B1C2D1 ,即在温度 80℃、乙醇浓度 55%、料液比为
1∶ 35g /mL、提取时间为 3. 0h时 ,黄酮的提取量最高 ;温度、乙醇浓度、料液比、提取时间 4个因素对
黄酮提取量的影响为: 温度> 乙醇浓度> 料液比> 提取时间 (即 A> B> C> D )。
表 1　L16 ( 44 )正交实验方案及结果
实验号 A温度
(℃ )
B乙醇浓度
(% )
C料液比
( g∶ mL)
D提取时间
( h)
黄酮含量
( mg· g- 1)
1 A 1 B1 C 1 D1 19. 94
2 A 1 B2 C 2 D2 19. 19
3 A 1 B3 C 3 D3 15. 42
4 A 1 B4 C 4 D4 16. 71
5 A 2 B1 C 2 D3 21. 54
6 A 2 B2 C 1 D4 16. 30
7 A 2 B3 C 4 D1 14. 81
8 A 2 B4 C 3 D2 12. 30
9 A 3 B1 C 3 D4 22. 26
10 A 3 B2 C 4 D3 21. 88
11 A 3 B3 C 1 D2 17. 68
12 A 3 B4 C 2 D1 22. 35
13 A 4 B1 C 4 D2 22. 40
14 A 4 B2 C 3 D1 22. 37
15 A 4 B3 C 2 D4 22. 17
16 A 4 B4 C 1 D3 20. 41
K 1 71. 26 86. 14 74. 33 81. 28
K 2 64. 95 79. 74 85. 45 71. 57
K 3 84. 17 70. 08 72. 35 79. 25
K 4 87. 35 71. 77 75. 80 77. 44
T1 17. 82 21. 54 18. 58 20. 32
T2 16. 24 19. 94 21. 36 17. 89
T3 21. 04 17. 52 18. 09 19. 81
T4 21. 84 17. 94 18. 95 19. 36
R 5. 6 4. 02 3. 27 2. 43
　　表 1的正交实验设计中不包括最佳提取条件 A4B 1C2D1 ,需进行实验验证。将经乙醚脱色素的铁
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苋菜在 80℃水浴中 ,按 1∶ 35料液比 , 55%乙醇 ,提取 3. 0h,结果见表 2。可见 ,在 A4B1C2D1条件下 ,
黄酮的提取量大于表 1设计的第13号实验 ( A4B1C4D2 ) ,按A4B1C2D1设定的条件从铁苋菜中提取黄
酮 ,不仅提取率最高 ,而且实验稳定性强。
表 2　正交实验验证性实验结果
实验次数 1 2 3 4 5 平均 标准差
黄酮含量 ( mg· g- 1 ) 22. 43 22. 55 22. 72 22. 87 22. 69 22. 65 0. 18
提取率 (% ) 89. 94 90. 40 91. 09 91. 70 90. 96 90. 82 0. 67
　　进一步进行方差分析 ,结果见表 3。本实验所选择的 4因素的 4个水平中 ,温度的 4个水平对黄
酮的提取量影响差异显著 ( p < 0. 05) ,其他 3因素的 4个水平对黄酮的提取量影响差异不显著 (p>
0. 05)。 比较 F值 , FA> FB> FC> FD ,这与对表 1的直观分析结果相吻合。
表 3　L16 ( 44 )正交实验方差分析
变异来源 自由度 ( df ) 平方和 ( SS) 均方 ( MS) F p值
A 3 84. 166 28. 055 4. 374 0. 027
B 3 41. 567 13. 856 1. 391 0. 293
C 3 25. 398 8. 466 0. 742 0. 547
D 3 13. 117 4. 372 0. 323 0. 809
误差 e 3 0. 657 0. 219
总和 T 15 164. 905
图 6　铁苋菜黄酮对羟自由基的清除效果
3. 3　铁苋菜提取液清除羟基作用分析
人体内的氧自由基如游离羟基、超氧阴离
子等的过量产生 ,是人体细胞衰老凋亡和癌变
的重要原因。 黄酮类化合物因具有清除羟基、
超氧阴离子能力而具有抗氧化性。 · OH-是
毒性最大的活性氧 ,对细胞内 DNA的破坏作
用最大 [10 ] ,它可以加成至碱基双键中 ,破坏碱
基 ,从而产生基因突变 ;还可以加成到胸腺嘧
啶、胞嘧啶的 C5、 C6或腺嘌呤的 C7、 C8上 ,形成
碱基自由基。生成的这些嘧啶和嘌呤自由基可
以相互结合 ,或再通过其他自由基反应生成过氧化物 ,这些变化可造成碱基被破坏 ,从而产生遗传
突变 [11 ]。
根据 Fenton反应原理 , H2O2与 Fe2+混合产生· OH- ,但由于· OH-具有很高的反应活性 ,存
活时间短 ,若在体系中加入水杨酸 ,就能有效地捕捉· OH- ,并产生有色产物 ,该产物在λ= 510nm
处有最大吸收峰 ,若在反应体系中加入具有清除· OH-功能的被测物 ,便会与水杨酸竞争· OH- ,
而使有色产物生成量减少。采用固定反应时间法 ,在相同体积的反应体系加入一系列不同浓度的铁
苋菜黄酮提取液 ,并以蒸馏水为参比 ,与试剂空白液比较 ,在λ= 510nm处测量各浓度下的吸光度
A,便能测定被测物 (黄酮类物质 )对· OH-的清除作用 ,铁苋菜提取液对· OH-的清除效果见图 6,
由此可见 ,铁苋菜黄酮提取液对羟基有一定的清除作用 ,且随着黄酮浓度增加 ,清除率逐渐上升。
4　结论
铁苋菜中的黄酮类化合物以芦丁为标准试剂 ,测得其含量约为 24. 94mg· g- 1 ,折合百分含量
约为 2. 49% 。采用乙醇作为提取剂 ,其最优提取工艺条件是提取温度 80℃、乙醇浓度 55% 、料液比 1
∶ 35、提取时间 3. 0h。 抗氧化性试验证明 ,铁苋菜黄酮具有一定的清除羟基作用 ,其清除作用随着
801第 3期 王春景等:铁苋菜黄酮类化合物的提取及清除羟自由基作用的研究
黄酮浓度的增大而增强。
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Study on Extraction and Function of Scavenging Hydroxyl Free Radical
of Flavonoids from Acalypha Australis L.
WANG Chun-Jing　 LIU Gao-Feng　 LI Jing　 HU Xiao-Mei
( Departm ent of B ioscience, Bengbu Med ical College, Bengbu , Anhui 233000, P. R .Ch ina )
Abstract　 Dif ferent ex t raction reagents w ere used to ex t ract the f lav onoids f rom Acalypha
australis L. . The ex t raction condi tions w ere approached by single facto r and o rthogonal
experiments and anti-oxidant capaci ty o f the f lav onoids f rom Acalypha austral is L. w as
prelimina rily studied as well. The best technological conditions are: at 80℃ , 55% ethano l, material
to ex traction reagent 1∶ 35g /mL, the ex traction time fo r 3. 0h. The f lav onoids yield of ex t raction
reached 90. 82% . The flavonoids f rom Acalypha australis L. has scavenging activi ty on hydroxyl
f ree radicals.
Key words　 Acalypha Australis L. ; Flavonoids; Ex traction Technolo gical Condi tions;
Hydroxyl Free Radical
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802 光谱实验室 第 27卷