全 文 ：中国农学通报 2012,28(24):306-310
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
无 梗 五 加 [A. sessiliplorus (Ruqr. et Maxim.)
Seem.]是五加科五加属一种重要的药用植物，自古作
为补益强壮的药物，具有治疗阳痿、神经性消化不良、
妊娠疼痛、伤风及风湿症等多种作用[1]。现代学者的
研究主要集中在其根茎叶的研究，对其果实中活性物
质的研究还很少[2-5]。本研究主要的研究对象是无梗五
加果实多糖。与微生物多糖相比，水浸提所得的植物
多糖中通常伴有较多的蛋白杂质，而且二者常以糖蛋
白复合物的形式存在，为蛋白质的脱除带来了难度。
因此如何在高效率脱除蛋白质的同时又最大限度的保
留多糖一直是多糖纯化工艺中的难题，其关系到后续
多糖的结构分析及生物活性研究，是活性多糖纯品制
备必经步骤。
根据蛋白质的性质，将其沉淀分离的方法主要
有[6-9]：盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法。其中
前2种方法主要用于蛋白质的提取，而第3种有机溶剂
沉淀法是近年来普遍研究和采用的方法，如三氯乙酸
法(TCA)、Sevag法、鞣酸法、三氟三氯乙烷法、盐酸法
等。从保留多糖活性的角度考虑，Sevag法是相对较
为安全的方法，但其操作较为繁琐，通常需反复处理
10次以上。TCA法操作简单，去除效率较高，但大量
第一作者简介：王晶晶，女，1979年出生，内蒙古通辽市人，讲师，硕士，主要从事食品营养与安全研究。通信地址：121001辽宁省锦州市古塔区人民
街5段48号食品学院，E-mail：jjlive2007@126.com。
收稿日期：2011-10-14，修回日期：2012-01-19。
无梗五加果多糖脱蛋白工艺的优化
王晶晶 1，冯 颖 2，生依灵 1
（1辽宁医学院食品学院，辽宁锦州 121001；2沈阳农业大学食品学院，沈阳 110161）
摘 要：为获得无梗五加果多糖最佳脱蛋白工艺，采用单因素及正交试验设计，分别对酶法和三氯乙酸
(TCA)-Sevag 2种方法进行优化。结果表明：将无梗五加粗多糖液调至pH 6.5，采用质量浓度4%的木瓜
蛋白酶40℃下酶解2 h，5000 r/min离心10 min，取上清液加入其等体积TCA-Sevag (1:1，v/v)试剂脱蛋白
处理4次，其中Sevag试剂中氯仿:正丁醇=5:1(v/v)，脱蛋白率为95.6%，多糖损失率为21.5%。酶法联合
三氯乙酸(TCA)-Sevag脱除蛋白法是一种适合无梗五加果多糖的较高效的除蛋白方法。
关键词：无梗五加；多糖；脱蛋白；酶法；TCA-Sevag法
中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 论文编号：2011-2951
Optimization of Deproteinization Process of Polysaccharides
in Fruits from Acanthopanax Sessiliflorus Seem.
Wang Jingjing1, Feng Ying 2, Sheng Yiling1
(1Food Science College of Liaoning Medical University, Jinzhou Liaoning 121001;
2Food Science College of Shenyang Agricultural University, Shenyang l10161)
Abstract: To determine the best process to remove protein from polysaccharides in Fruits of Acanthopanax
Sessiliflorus Seem., two methods including enzymolysis and trichloroacetic acid (TCA)-Sevag were optimized
by single factor and orthogonal design. The results showed that polysaccharides solution at pH values adjusted
to 6.5 was dealt with the mass concentration of 4% papain for 2 h at 40℃, and then the supernatant following
by centrifuged for 10 min at 5000 r/min was handed for four times by 1:1 (v/v) TCA-Sevag [chloroform:butanol=
5:1(v/v)] reagent for that of equal volume. The deproteinization rate was 95.6% and the loss rate of
polysaccharides was 21.5% . The method of enzymolysis with TCA-Sevag had high efficiency in
deproteinization.
Key words: Acanthopanax Sessiliflorus Seem.; polysaccharides; deproteinization; enzymolysis; TCA-Sevag
王晶晶等：无梗五加果多糖脱蛋白工艺的优化
使用易造成多糖分解。除了上述化学沉淀法，还可以
利用蛋白质分解除去的方法，即酶解法。但部分实验
表明[10-11]，其去除效果因原材料不同而出现明显差异。
此外还有层析法，如大孔吸附树脂法等，部分学者认
为[12]，该法适合小分子物质分离，对多糖这样的大分子
分离，易降低其生物活性，应慎重使用。本实验综合以
上因素，优化了TCA-Sevag法和酶解法，确定了一种
适合无梗五加果多糖脱除蛋白的工艺，为其他植物多
糖的除蛋白工艺提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
无梗五加果实（人工栽培无梗五加果实采于辽宁
省内，自然干燥）。
牛血清白蛋白（北京奥博星生物试剂公司）；氯仿；
正丁醇；三氯乙酸等均为分析纯，购至沈阳市试剂厂；
木瓜蛋白酶（无锡杰能科生物工程有限公司）。
1.2 主要仪器与设备
RE-52型旋转蒸发仪（上海博通经贸有限公司）；
电热恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；UV-1100
紫外可见分光光度计（上海分析仪器厂）；DZF6050真
空干燥箱（上海一恒科技有限公司）；TDL-5000B型离
心机（上海安亭仪器厂）。
1.3 实验方法
1.3.1 无梗五加果多糖APS的制备 将干燥粉碎后试
材用石油醚回流一夜，60℃烘干备用。称取2 g脱脂试
材，按照料水比 170，80℃下浸提 3 h，浸提 1次。浸提
液经过滤后旋转蒸发浓缩到原体积的 1/5，5倍醇沉，
静置过夜，9000 r/min，离心15 min，然后60℃干燥得到
粗多糖。将粗多糖复溶进行脱蛋白工艺研究。
1.3.2 蛋白质含量测定 采用 lowry法[13]，所得标准曲线
回归方程为Y=177.29X-7.1598(R2=0.9968)。
1.3.3 多糖含量的测定 采用苯酚-硫酸法[14]，所得标准
曲回归方程为Y=0.0084X+0.0028(R2=0.9991)。
1.3.4 脱蛋白率和多糖损失率公式
脱蛋白率=[(脱蛋白前蛋白质的量-脱蛋白后蛋白
质的量)/脱蛋白前蛋白质的量]×100%
多糖损失率=[(脱蛋白前多糖的量-脱蛋白后多糖
的量)/脱蛋白前多糖的量]×100%
1.3.5 无梗五加果多糖脱蛋白工艺的研究
（1）酶解法。配制一定浓度粗多糖溶液，对酶解的
pH (5.5、6、6.5、7、7.5)、温度(40、50、60、70、80℃)、时间
(1、2、3、4 h)、用量(1%、2%、3%、4%、5%)进行单因素实
验。酶解液经 5000 r/min离心 10 min，取上清夜测定
蛋白含量，筛选出最适的酶解参数。
（2）三氯乙酸浓度和加入量的选择。由于三氯乙
酸的酸性较强，易导致多糖的降解，因此对三氯乙酸浓
度的控制尤为重要。配制一定浓度粗多糖溶液，分别
加入 1/10体积不同体积浓度(0%、1%、3%、5%、7%、
10%、15%)的三氯乙酸溶液，震荡 20 min，静置 1 h，取
上清液，测定蛋白含量和多糖保留率，确定适宜的三氯
乙酸浓度。然后以此为依据，确定三氯乙酸加入量。
（3）Sevag-TCA法。配制一定浓度粗多糖样液，按
照L9(33)正交试验设计加入TCA和 Sevag试剂，静置
30 min，取上清液，测定蛋白含量。正交试验因素水平
范围为：A（多糖样液）：试剂分别为2:1，1:1和1:2(v/v)；
B(TCA:Sevag)：试剂分别为 1:10，1:5和 1:1(v/v)；C（氯
仿:正丁醇）：分别为5:1，3:1和1:1(v/v)。
（4）TCA法、Sevag法和TCA-Sevag法比较。配制
一定浓度粗多糖溶液 3份，1份按照（2）中确定的参数
加入三氯乙酸溶液；1份加入 1/4体积的氯仿-正丁醇
(3:1)溶液；1份按照（3）中获得的参数加入TCA-Sevag
试剂，分别震荡20 min，静置30 min，取上清液，评价其
一次脱蛋白率及多糖保留率，以确定与酶法相配合的
有机溶剂除蛋白法。
（5）酶法+TCA-Sevag法。按照（1）和（3）中确定的
参数，采用酶法联合TCA-Sevag法脱蛋白处理4次。
2 结果与分析
2.1 酶解法最佳参数的确定
由图1~4可知，木瓜蛋白酶解最佳参数为：木瓜蛋
白酶用量为4%，pH=6.5，T=40℃，t=2 h，脱蛋白率仅为
14%，效率较低。因此单独使用酶法根本无法彻底去
除蛋白，这可能是由于酶的专一性较高，而选择一种合
适的蛋白酶比较难。
2.2 三氯乙酸浓度和用量的确定
由图5可知，当三氯乙酸浓度增加到10%(v/v)时，
蛋白含量降低不明显，再增加浓度二者变化不明显，且
2.52.6
2.72.8
2.93.0
3.13.2
3.33.4
3.5
5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0pH值
蛋
白
质
含
量
/mg
图1 酶解pH对蛋白质含量的影响
pH
·· 307
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考虑到三氯乙酸浓度过大还有可能出现多糖降解的危
险，因此，三氯乙酸浓度确定为10%。
由图6可知，随着乙酸加入量的加大，蛋白与多糖
含量均呈下降趋势，但当加入量大于50%时，蛋白含量
降低不显著，且多糖损失严重，不宜继续加大用量。因
此10%三氯乙酸加入量确定1/2体积多糖液。
2.3 TCA-Sevag法最佳参数的确定
由表 1可知，TCA-Sevag法各因素蛋白脱除效果
影响次序为B>C>A，这说明影响蛋白脱除效果的最重
要参数是TCA与 Sevage试剂之比。TCA-Sevag法的
最佳组合为：A2B3C1，即TCA-Sevag试剂用量为等体积
多糖样液，TCA:Sevag为 1:1(v/v)，氯仿:正丁醇为 5:1
(v/v)，经此法脱蛋白1次，脱蛋白率为34.6%，多糖损失
率36%。
2.4 3种脱蛋白法比较
根据表 2可知，TCA-Sevag法无论从脱蛋白率还
是多糖保留率都好于其他 2种化学法，但多糖损失都
比较大，提示无梗五加果实中可能以糖蛋白形式存在
的多糖较多，因此随蛋白一同沉降下来。根据2.1节中
实验结果可知，酶解法脱蛋白率为14%，与这3种方法
相比，效率较低。考虑其可以分解与多糖结合的部分
蛋白，这是有机溶剂法所不能替代的，且酶法操作条件
温和，酶解可降低酶解液黏度，有利于多糖物质溶出，
因此，采用酶法联合TCA-Sevag法对多糖液进行脱蛋
2.52.6
2.72.8
2.93.0
3.13.2
3.33.4
3.5
1 2 3 4 5
时间/h
蛋
白
质
含
量
/mg
2.82.9
3.03.1
3.23.3
3.43.5
3.63.7
3.8
40 50 60 70 80
温度/℃
蛋
白
质
含
量
/mg
0.00.5
1.01.5
2.02.5
3.03.5
4.04.5
0 3 5 7 10 13 15
三氯乙酸浓度/%
多
糖
与
蛋
白
质
含
量
/mg
蛋白质 多糖
图2 酶解时间对蛋白质含量的影响 图3 酶解温度对蛋白质含量的影响
图4 酶用量对蛋白质含量的影响 图5 三氯乙酸浓度的选择
0
1
2
3
4
5
6
10 20 30 40 50 70 100
乙酸用量/%
多
糖
与
蛋
白
含
量
/mg
蛋白含量 多糖含量
图6 三氯乙酸用量的选择
3.053.10
3.153.20
3.253.30
3.353.40
3.453.50
3.55
0% 2% 4% 6%
用量/%
蛋
白
质
含
量
/mg
0 2 4 6
·· 308
王晶晶等：无梗五加果多糖脱蛋白工艺的优化
白处理4次，考察其脱蛋白效果。
2.5 酶法+Sevag-三氯乙酸法
由图7可知，随着处理次数的增加，脱蛋白率趋于
平缓，多糖损失率继续加大。酶法联合TCA-Sevag处
理 4次，脱蛋白率为 95.6%，多糖损失率为 21.5%。与
单独采用酶法和有机溶剂法相比，多糖损失率明显降
低，效果较好。
3 结论与讨论
通过本次实验中所确定的木瓜蛋白酶解参数进行
脱蛋白处理，蛋白脱除率仅为14%，效率较低。该法不
适合单独对无梗五加果实多糖进行脱蛋白处理。这正
证实了部分文献中[9-10]记载的单独采用酶法去除某些
多糖中蛋白，很难达到理想效果的结论。但考虑其可
水解部分的游离蛋白和结合蛋白，减少后续有机溶剂
除蛋白的次数，降低多糖随凝胶物沉淀而损失的可能，
因此，将酶解法与化学沉淀法结合使用。
TCA法操作简单，但其浓度和使用量难于控制，
易造成多糖分解。与TCA法相比，Sevag法操作较为
复杂，因此本实验考察了将两法配合使用的效果。通
过优化三氯乙酸浓度和用量，三氯乙酸浓度确定为
10%，加入量为1/2体积多糖液。这与文献中记载的浓
度范围和使用量相吻合 [15]。然后通过正交试验对
TCA-Sevag法进行优化，各因素对蛋白脱除效果影响
次序为三氯乙酸:Sevage(v/v)>氯仿:正丁醇(v/v)>多糖
样液:试剂(v/v)。
将本实验中优化所得的TCA-Sevag法与TCA法
和Sevag法相比较，以确定与酶法相结合使用的有机
溶剂除蛋白法。结果发现TCA-Sevag法1次脱蛋白率
及多糖保留率都好于其他2种化学法，但3种方法多糖
损失都比较大。因此，采用酶解法联合TCA-Sevag法
对多糖液进行脱蛋白处理。
本实验所获得无梗五加果多糖脱蛋白工艺为：将
多糖液调至pH 6.5，采用4%(g/g)木瓜蛋白酶40℃下酶
解2 h，5000 r/min离心10 min，取上清液加入其等体积
TCA-Sevag(1:1)试剂，其中 Sevag试剂中氯仿:正丁醇
(5:1)，分别震荡 20 min，静置 30 min，取上清液再加入
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
R
A多糖样液:试剂(v/v)
1(2:10)
1
1
2(1:1)
2
2
3(1:2)
3
3
4.87
4.45
5.04
0.2
B三氯乙酸:Sevage(v/v)
1(1:10)
2(1:5)
3(1:1)
1
2
3
1
2
3
5.57
5.16
3.63
0.65
C氯仿:正丁醇(v/v)
1(5:1)
2(3:1)
3(1:1)
2
3
1
3
1
2
4.31
4.64
5.41
0.36
蛋白含量/mg
1.61
1.74
1.52
1.77
1.7
0.98
2.19
1.72
1.13
表1 TCA-Sevag法正交试验结果
方法
三氯乙酸法
Sevag法
TCA-Sevag法
脱蛋白率/%
21.4
24.1
34.6
多糖损失率/%
41
40
36
表2 3种脱蛋白方法比较
010
2030
4050
6070
8090
100
0 1 2 3 4 5
处理次数
脱
蛋
白
率
和
多
糖
损
失
率
%
脱蛋白率
多糖损失率
图7 酶法结合TCA-Sevag法脱蛋白效果
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TCA-Sevag试剂，重复脱蛋白4次，脱蛋白率为95.6%，
多糖损失率为21.5%。
本实验中以蛋白脱除率和多糖保留率为评价指
标，优化确定了一种适合无梗五加果多糖脱蛋白的工
艺，但对于该工艺或其他几种常用的脱蛋白工艺对活
性多糖活性及结构是否造成影响，以及造成怎样的影
响，正是本研究及致力于多糖研究的大多数学者下一
步应着重解决的问题。
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