全 文 ：第 25卷 第 2 期 森 林 工 程 Vol.25 No.2
2009年 3 月 FOREST ENGINEERING Mar., 2009
优化喜树果中喜树碱和
10-羟基喜树碱的匀浆提取工艺
赵春建 , 李佳慧 , 杨 磊 , 李晓娟 , 祖元刚＊
(东北林业大学 , 哈尔滨 150040)
摘 要:采用匀浆提取的方法从喜树果中提取喜树碱和 10-羟基喜树碱 , 考察乙醇体积分数 、 匀浆时间和
液料比等因素对提取率和纯度的影响 , 并通过响应面法进行工艺优化 , 分别得到以喜树碱 、 10-羟基喜树碱的
提取率和纯度为响应值的回归方程 , 进而获得最佳工艺条件为乙醇体积分数 52.41%;匀浆时间 2.93 min;液料
比11.11 (mL∶g)。最佳条件下的验证实验表明:喜树碱提取率为0.092 3%, 浸膏中喜树碱的纯度为1.063 3%,
与模型值相对偏差分别为 0.75%和 0.88%;10-羟基喜树碱提取率为0.009 4%, 浸膏中 10-羟基喜树碱的纯度
为0.107 8%, 与模型值相对偏差分别为 0.53%和 0.78%, 说明回归方程可以很好地预测实验结果。
关键词:喜树果;喜树碱;10-羟基喜树碱;匀浆提取;响应面
中图分类号:TQ460.6 文献标识码:A 文章编号:1001-005X (2009)02-0022-06
Optimization of Homogenate Extraction of Camptothecin and 10-hydroxycamptothecin in Seeds of Fructus camptoth-
ecae acuminatae Zhao Chunjian , Li Jiahui , Yang Lei , Li Xiaojuan , Zu Yuangang (Northeast Forestry University , Harbin
150040)
Abstract:Camptothecin(CPT)and 10-hydrxycamptothecin(HCPT)in seeds of Fructus camptothecae acuminatae were ex-
tracted by homogenate method.The effects of volume fraction of ethanol , homogenate time and ratio of liquor to material on the ex-
traction yield and purity were investigated and the process was optimized by response surface methodology(RSM).The regression
equations based on the extraction yield and purity of CPT and HCPT were obtained , further, the optimum technology parameters
were obtained and they were that 52.41% of ethanol volume fraction , 2.93 min of homogenate time and 11.11 (mL:g) of
liquor to material.Under the optimum condition , the extraction yield of CPT was 0.092 3%, the purity of CPT in extractum was
1.063 3%, and the relative deviations of experimental and simulation values were 0.75% and 0.88%, respectively.The extrac-
tion yield of HCPT was 0.009 4% and the purity of HCPT in extractum was 0.107 8%.The relative deviations of experimental
and simulation values were respectively 0.53% and 0.78%, which showed regression equations can well predict the experimental
results.
Key words:Fructus camptothecae acuminatae;camptothecine;10-hydroxycamptothecine;homogenate extraction;re-
sponse surface
收稿日期:2008-10-20
基金项目:国家科技支撑计划项目 (2006BAD18B04)
第一作者简介:赵春建 (1977-), 男 , 黑龙江哈尔滨人 , 副教
授 , 博士。研究方向:植物化学和植物药。
＊通讯作者:祖元刚 (1954-), 男 , 吉林镇赉人 , 博士 , 教
授。研究方向:植物学。
由喜树碱和 10-羟基喜树碱为原料合成的伊
立替康和拓扑替康已成为临床治疗癌症的一线药
物 , 用于治疗结肠癌 、小细胞肺癌 、非小细胞肺癌
和白血病等多种癌症[ 1] , 因此对喜树碱和 10-羟
基喜树碱的需求量非常大 。喜树碱和 10-羟基喜
树碱主要从喜树果中提取得到 , 其主要提取方法
有:碱水渗漉或搅拌 、甲醇 、 乙醇超声 、回流或索
氏提取以及超临界 CO2 萃取法等[ 2-7] 。碱水提取 ,
废液污染严重 , 处理成本高;回流和索氏提取 , 提
取操作时间长 , 效率低;超声提取能耗高 、噪音污
染大;超临界 CO2 萃取虽然选择性高 、 操作时间
短 , 但受处理量的限制 , 产量低 , 目前工业开发难
度较大。因此 , 寻找更加有效的提取喜树碱和 10
-羟基喜树碱的方法具有现实意义。
匀浆提取是指生物组织通过加入溶剂进行组织
匀浆或磨浆 , 以速度提取组织中有效成分的一种提
取方法。该法早期用于从动物组织中提取氨基酸 、
蛋白质等目的成分[ 8, 9] , 近年来祖元刚等应用匀浆
提取法对植物组织中萜烯醇 、黄酮类物质进行了提
取 , 获得了满意的效果[ 10 , 11] 。响应面分析法 (Re-
sponse Surface Methodology , RSM)是由 Box 于 1957
提出的一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计
方法[ 12] , 该法采用多元二次回归方程来拟合因素
与响应值之间函数关系 , 通过建立连续变量曲面模
型 , 寻求最优工艺参数。本文利用匀浆法对喜树果
中的喜树碱和 10-羟基喜树碱进行提取 , 对匀浆
提取过程中的各因素采用响应面分析法进行了优
化 , 为规模生产提供了有价值的工艺参数。
1 实验方法
1.1 实验仪器
匀浆萃取装置 (本实验室专利产品 , 专利号:
ZL02275225.0);高效液相色谱仪 , 包括 717 型自
动进样器 , 1525 型二元泵和 2487 型紫外检测器 ,
美国Waters公司产品;BS124S 天平 , 购自北京赛
多利斯仪器系统有限公司;3K30型离心机 , 美国
SIGMA公司;SZ -93 自动双重纯水蒸馏器 , 购自
上海亚荣生化仪器厂 。
1.2 实验材料和试剂
喜树果于 2006年采自四川省广汉市 , 喜树碱
和10-羟基喜树碱对照品购自 SIGMA公司 , 含量
测定用乙腈为色谱纯 , 购自美国 Dima Technology公
司 , 含量测定用二次蒸馏水自制 , 其余试剂均为国
产分析纯 。
1.3 分析方法
1.3.1 定量测定条件
参照文献提供的高效液相色谱法测定喜树碱和
10-羟基喜树碱[ 13] 。色谱柱:Aichrom Bond -AQ
C18 (4.6mm×250mm , 5μm);流动相:乙腈-水
(3∶7 , v v);流速:1.0 mL min;进样量:10 μL;
检测波长:254 nm 和 366 nm 。
1.3.2 标准曲线的绘制
精确称取喜树碱对照品 5.30 mg , 10-羟基喜
树碱对照品 4.75 mg , 置于 50 mL 容量瓶中 , 加无
水乙醇溶解并定容至刻度 , 制得标准品储备液 , 备
用。精密量取标准品储备液用无水乙醇稀释至不同
浓度 , 按1.3.1所述的色谱条件 , 进行HPLC分析 。
分别以喜树碱浓度 (X1 , mg mL)与其对应的峰面
积 (Y 1)、 10 -羟基喜树碱的浓度 (X2 , mg mL)
与其对应的峰面积 (Y 2)进行线性回归 , 得回归
方程及相关系数分别为 Y 1 =24 435 609.09X1 +
32 501.74 , R2 =0.999 1;Y 2 =23 804 210.21X2 +
1 046.73 , R2=0.999 6。
1.3.3 喜树碱和 10-羟基喜树碱含量的测定
提取液离心 (离心条件:温度 25 ℃;速度
12 000 r min;时间 8 min), 取上清液进行HPLC 检
测 , 每样重复进样 3 次 , 取平均值 , 代入回归方
程 , 计算喜树碱和 10-羟基喜树碱的浓度 , 然后
依式 1计算两种生物碱的提取率;提取液 80℃下
减压浓缩得浸膏 , 依式 2计算两种生物碱在浸膏中
的纯度。
Y = c ×V
10 ×M ; (1)
P = c ×V
10×m , (2)
式中:Y 为两种生物碱的提取率 , %);P 为两种生
物碱在浸膏中的纯度 , %;c 为两种生物碱在提取
液中的浓度 , mg mL;V为提取液体积 , mL;M 为
原料质量 , g;m 为浸膏质量 , g 。
2 结果与讨论
2.1 单因素实验
精确称取 10.00 g 喜树果 , 匀浆提取 , 比较不
同提取条件下喜树碱 、 10-羟基喜树碱的提取率和
在浸膏中的纯度 , 并以两种生物碱提取率和纯度均
较高时对应的条件为中心值 。
2.1.1 乙醇体积分数对提取效果的影响
乙醇体积分数对喜树碱和 10-羟基喜树碱提
取率及纯度的影响如图 1所示 。从图 1可以看出 ,
随着乙醇体积分数的增加 , 喜树碱与 10-羟基喜
树碱的提取率和纯度逐渐增加 , 当乙醇体积分数为
50%时 , 均达到最大值 , 此后逐渐下降 , 因此选择
乙醇体积分数 40%～ 60%为待优化范围。
2.1.2 匀浆时间对提取效果的影响
匀浆时间对喜树碱和 10-羟基喜树碱提取率
及纯度的影响如图 2所示 。图 2表明喜树碱是在匀
浆提取 4 min时纯度和提取率达最大值 , 而 10-羟
基喜树碱在匀浆 3 min 时纯度和提取率达到最大
值 , 随着匀浆时间的延长 , 喜树碱和 10-羟基喜
树碱提取率和纯度均不再增加。此外 , 匀浆时间过
长 , 会使物料破碎颗粒过细 , 影响匀浆的固液分离
速度。综合考虑 , 匀浆时间 2 ～ 4 min 为待优化范
围。
2.1.3 液料比对提取效果的影响
液料比对喜树碱和 10-羟基喜树碱提取率和
纯度的影响如图 3所示。图 3结果表明:随着液料
比的增加 , 两种生物碱的纯度和提取率逐渐增大 ,
当液料比为 11时 , 喜树碱和 10-羟基喜树碱的纯
度达最大值;喜树碱提取率在液料比为 11时达到
23第 2期 赵春建等:优化喜树果中喜树碱和 10-羟基喜树碱的匀浆提取工艺
图 1 乙醇体积分数对 CPT 和HCPT提取的影响
(n=3)
Fig.1 Effects of volume fraction of ethanol on extraction
of CPT and HCPT (n=3)
图 2 匀浆时间对 CPT和 HCPT提取的影响 (n=3)
Fig.2 Ef fects of homogenate time on extraction
of CPT and HCPT (n=3)
最大值;10-羟基喜树碱提取率在液料比 12 时达
到最大值 。原料的渗透作用要求液料比不宜过小 ,
而规模生产需要节约提取溶剂 , 综合考虑 , 选择液
料比 10 ～ 12为待优化范围 。
2.2 喜树碱和 10-羟基喜树碱匀浆提取条件优化
根据单因素试验结果 , 以乙醇体积分数 、匀浆
时间和液料比为影响因素 , 以喜树碱 、 10-羟基喜
树碱的纯度和提取率为响应值 , 应用 Design-Ex-
pert 7.0软件 , 按照 Box-Benhnken中心组合实验设
计原理 , 进行 3 因素 3 水平的响应面分析试验
图 3 液料比对 CPT 和HCPT提取的影响 (n=3)
Fig.3 Effect s of ratio of liquid to material on extraction
of CPT and HCPT (n=3)
(RSA), 以获取最佳工艺参数 。试验因素和水平安
排见表 1 , 结果见表 2。
表 1 响应面法分析的因素和水平
Tab.1 Factors and levels of RSA
因 素 -1 0 1
A:乙醇体积分数% 40 50 60
B:提取时间 min 2 3 4
C:液料比 mL∶g 10 11 12
应用 Design-Expert 7.0软件 , 将表 2中的数据
进行回归拟合后 , 得出 4个回归方程:
喜树碱提取率:
Y 1 =-3.117 1+0.021 2X1 +0.032 2X2 +
0.499 9X 3 -0.001 0X1 X2 +0.001 0X 1X3 +
0.015 9X 2X 3 -0.000 3X1 2 -0.025 1X2 2 -
0.026 6X3 2 , R2 =0.961 0。
喜树碱纯度:
Y 2 =-13.259 0 +0.168 9X1 -0.799 0X2 +
2.040 9X 3 -0.005 7X1 X2 +0.009 0X 1X3 +
0.154 1X 2X 3 -0.002 4X1 2 -0.109 9X2 2 -
0.135 9X3 2 , R2 =0.980 4。
10-羟基喜树碱提取率:
Y 3 =-0.246 6+0.001 6X1 +0.007 1X2 +
0.003 7X 3 +0.000 0X1 X2 -0.000 1X 1X3 +
0.000 1X 2X 3 -0.000 1X1 2 -0.001 1X2 2 -
0.001 5X3 2 , R2 =0.957 7。
24 森 林 工 程 第 25卷
表 2 响应面法设计与试验结果
Tab.2 Design and experimental results of RSM
试验号 X1 :乙醇体积分数%
X 2:提取时间
min
X 3:液料比
mL:g
Y 1:CPT 提取率
%
Y2:CPT 纯度
%
Y 3:HCPT
提取率%
Y4:HCPT纯度
%
1 50 2 10.00 0.056 9 1.056 0.005 7 0.106 3
2 50 3 11.00 0.095 2 1.079 0.009 8 0.111 4
3 50 3 11.00 0.101 7 1.095 0.009 3 0.100 6
4 50 4 12.00 0.091 3 0.886 0.007 8 0.076 2
5 40 3 10.00 0.064 8 0.741 0.005 2 0.059 6
6 50 3 11.00 0.089 8 1.026 0.008 8 0.100 9
7 40 4 11.00 0.058 3 0.505 0.007 2 0.062 1
8 60 3 12.00 0.072 4 0.818 0.007 7 0.087 4
9 50 4 10.00 0.056 2 0.668 0.006 4 0.075 9
10 60 2 11.00 0.081 4 1.040 0.007 6 0.097 1
11 40 2 11.00 0.052 8 0.507 0.007 8 0.074 6
12 60 3 10.00 0.056 4 0.688 0.007 1 0.086 4
13 60 4 11.00 0.066 3 0.810 0.007 4 0.090 2
14 50 3 11.00 0.081 6 1.137 0.008 2 0.114 2
15 50 2 12.00 0.058 7 0.657 0.007 5 0.084 3
16 40 3 12.00 0.061 2 0.510 0.008 5 0.071 1
17 50 3 11.00 0.096 6 0.977 0.011 0 0.111 4
10-羟基喜树碱纯度:
Y 4 =-2.012 9+0.021 8X1 -0.023 8X 2 +
0.290 9X3 +0.000 1X 1X 2 -0.000 3X1 X3 +
0.005 6X2 X3 -0.000 0X 1 2 -0.008 5X2 2 -
0.013 0X 32 ,R 2 =0.980 3。
其中:Y 1为喜树碱提取率;Y 2 为喜树碱纯度;Y 3
为 10-羟基喜树碱提取率;Y 4 为 10-羟基喜树碱
纯度;X1 为乙醇体积分数;X 2 为提取时间;X3
为液料比 。
表 3 回归方程方差分析 (n=3)
Tab.3 Variance analysis for regression equation (n=3)
模型 X1 X2 X3 X 1X 2 X 1X 3 X 2X 3 X 12 X 22 X 32 失拟项
Y 1: 自由度 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3
CPT F 4.70 2.33 0.72 3.53 1.26 1.21 3.05 10.06 8.01 8.98 3.04
提取率 P 0.027 0.171 0.424 0.102 0.299 0.308 0.124 0.016 0.025 0.020 0.102
% 显著性 ＊ ns ns ns ns ns ns ＊ ＊ ＊ ns
Y 2: 自由度 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3
CPT F 9.45 17.58 2.25 1.19 1.54 3.85 11.20 27.99 6.02 9.17 3.75
纯度 P 0.004 0.004 0.177 0.311 0.255 0.091 0.012 0.001 0.044 0.019 0.068
% 显著性 ＊ ＊ ns ns ns ns ＊ ＊＊ ＊ ＊ ns
Y 3: 自由度 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3
HCPT F 4.17 0.22 0.00 8.93 0.05 2.40 0.04 4.09 7.12 12.13 0.18
提取率 P 0.037 0.653 0.951 0.020 0.826 0.165 0.851 0.083 0.032 0.010 0.907
% 显著性 ＊ ns ns ＊ ns ns ns ns ＊ ＊ ns
Y 4: 自由度 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3
HCPT F 9.35 21.09 8.01 0.20 0.15 0.53 2.37 26.45 5.94 14.57 1.58
纯度 P 0.004 0.003 0.025 0.668 0.710 0.490 0.168 0.001 0.045 0.007 0.278
% 显著性 ＊ ＊ ＊ ns ns ns ns ＊＊ ＊ ＊ ns
注:＊＊表示极显著 (P≤0.001);＊表示显著 (0.001
前述回归方程描述各因子与响应值之间线性关系
的显著性由 F 检验来判定 , 概率 P 值越小 , 则其相
应变量的显著性越高。回归方程方差分析结果见表3。
由表3可知 , 提取时间和液料比的平方项对喜树碱提
25第 2期 赵春建等:优化喜树果中喜树碱和 10-羟基喜树碱的匀浆提取工艺
取率 、喜树碱纯度 、 10-羟基喜树碱提取率和 10-羟
基喜树碱纯度影响均显著 , 乙醇体积分数对喜树碱纯
度和 10-羟基喜树碱纯度影响显著 , 液料比对10-羟
基喜树碱提取率影响显著。从表 3还可知 , 所选用的
模型均显著 , 失拟项均不显著 , 说明以上4个回归方
程对试验数据拟合较好。
2.3 响应面图分析结果
因为乙醇体积分数和液料比均可影响目标化合
物在物料中的传质效率 , 而提取率又与提取时间密
切相关 , 因此上述两两因素间可能存在交互作用 。
根据表3显著性分析结果 , 并使用表 2数据 , 分别
绘制了对响应值 Y 1 , Y 2 , Y 3 , Y 4 影响最大的两因
素交互作用的响应面图 , 分别如图 4 ～ 图 7所示。
图4显示了 X 1=50%时 , Y 1=f (X 2 , X3)的
响应面图和等高线图 。图 5 显示了 X1 =50%时 ,
Y 2=f (X2 , X 3)的响应面图。图 4和图 5结果表
明:当乙醇体积分数 (X1)为 50%时 , 提取时间
(X2)和液料比 (X3)的交互作用对喜树碱提取率
(Y 1)和喜树碱纯度 (Y 2)影响最为显著 。
图 4 Y 1 = f(X2 , X 3)的响应面图
Fig.4 Responsive surface of Y1 = f(X 2 , X3)
图 5 Y 2=f (X2 , X 3)的响应面图
Fig.5 Responsive surface of Y2 = f(X 2 , X3)
图 6 Y 3 = f(X1 , X3)的响应面图
Fig.6 Responsive surface of Y 3 = f(X1 , X 3)
图 7 Y 4 = f(X2 , X3)的响应面图
Fig.7 Responsive surface of Y 4 = f(X2 , X 3)
图 6显示了 X2 =3 min时 , Y 3 = f(X1 , X3)的
响应面图 , 表明当提取时间 (X2)为 3 min 时 , 乙
醇体积分数 (X1)和液料比 (X 3)交互作用对 10
-羟基喜树碱提取率 (Y 3)影响最为显著。
图 7显示了 X1=50%时 , Y 4 = f(X2 ,X 3)的响
应面图 , 表明当乙醇体积分数 (X1)为 50%时 ,
提取时间 (X 2)和液料比 (X 3)的相互作用对 10
-羟基喜树碱纯度 (Y 4)影响最为显著 。
应用 Design-Expert 7.0 软件 , 以喜树碱和 10
-羟基喜树碱提取率与纯度为指标 , 对提取结果进
行优化 , 得到同时提取两种目标产物最佳提取工艺
条件:乙醇体积分数为 52.41%, 提取时间为 2.93
min , 液料比 11.11 (mL∶g);喜树碱提取率为
0.093 7%、纯度为1.082 1%;10-羟基喜树碱提
取率为0.009 5%、 纯度为0.109 5%。
3 结 论
在单因素试验设计基础上 , 使用 Design-Ex-
26 森 林 工 程 第 25卷
pert 7.0 设计的 3 因素 3 水平响应面分析法试验 ,
确定喜树碱和 10-羟基喜树碱的最佳提取工艺参
数为:乙醇体积分数 52.41%;提取时间 2.93 min;
液料比 11.11 (mL∶g)。按照此工艺提取 , 重复实
验三次取平均值 , 验证实验结果。得到喜树碱提取
率为0.092 3%, 纯度为1.063 3%, 与模型值相对
偏差分别为 0.75%和 0.88%;10-羟基喜树碱提
取率为0.009 4%, 纯度为0.107 8%, 与模型值相
对偏差分别为 0.53%和 0.78%, 说明回归方程可
以很好地预测实验结果。
【参 考 文 献】
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[责任编辑:肖生苓]
(上接第 8页)
(2)进一步优化挤压成型和热解工艺 , 降低能
耗和处理成本。
(3)对热解产物生物质炭 、 生物焦油 、生物醋
液和生物燃气进行深加工 , 提高附加值 , 增加企业
收入 , 使林源活性物质提取行业能够得以可持续发
展。
【参 考 文 献】
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[责任编辑:肖生苓]
27第 2期 赵春建等:优化喜树果中喜树碱和 10-羟基喜树碱的匀浆提取工艺