全 文 ：江西农业学报　2007, 19(11):70 ～ 72ActaAgriculturaeJiangxi
铁钉菜乙醇提取物对真菌生长的影响
欧阳桐娇1 ,郑 怡2 ,刘艳如2 ,林 勇3 ,郭文杰 1 ,江枝和3
　 　收稿日期:2007-08-06
基金项目:福建省科技厅重点项目(2005N036)。
作者简介:欧阳桐娇(1963-),女 ,福建平潭人 ,助理研究员 ,从事植物资源化学研究工作。
(1.福建省农科院 生物技术研究所 ,福建福州 350003;2.福建师范大学生命科学院 ,福建福州 350007;
3.福建省农科院土壤肥料研究所,福建福州 350013)
摘　要:铁钉菜乙醇粗提物通过薄层层析法分离活性物质 ,分别采用纸片法和菌饼法测定了铁钉菜提取物及薄层层析带
对 3种真菌的菌丝生长的影响 ,用玻片法测定了对孢子萌发的抑制作用。实验结果表明:乙醇提取物对 3种真菌孢子萌发的
抑制作用最强 , 其中 ,浓度在 0.005mg/mL时对绿色木霉和黑曲霉孢子萌发的抑制率均达到 99%。
关键词:铁钉菜;薄层层析;真菌;菌丝生长;孢子萌发
中图分类号:Q949.327.1　文献标识码:A　文章编号:1001-8581(2007)11-0070-03
EffectofEthanolExtractfromIshigeokamuraonGrowthofFungi
OUYANGTong-jiao1 , ZHENGYi2 , LIUYan-ru2 , LINYong3 , GUOWen-jie1 , JIANGZhi-he3
(1.BiotechnologyInstitute, FujianAcademyofAgriculturalSciences, Fuzhou350003, China;
2.ColegeofLifeSciences, FujianNormalUniversity, Fuzhou350007, China;
3.InstituteofSoilandFertilizer, FujianAcademyofAgriculturalSciences, Fuzhou350013, China)
Abstract:ActivesubstancesseparatedbyTLCfromtheethanolextractofIshigeokamurawereusedtostudytheireffectsonthe
hyphalgrowthofthreefungibyusingthemethodofdiscandfilterpaper, aswelastheirrestrainingeffectsonthesporegerminationby
usingtheslidemethod.Theresultsindicatedthatethanolextractshowedstronginhibitiontothesporegerminationofthreefungiand
themaximuminhibitoryratereached97.0% toTrichodermavirideandAspergillusnigerundertheconcentrationof0.005mg/mL.
Keywords:Ishigeokamura;Thinlayerchromatographicanalysis;Fungus;Hyphalgrowth;Sporegermination
　　海洋占地球总面积的 71%,蕴藏着极其丰富的生物
资源 ,是有机物质的最大生产者 。这些有机物基本上是
海洋浮游植物合成的 ,特别是海藻 。因此可以说海洋藻
类是世界上最大的有机物合成并储存的资源宝库 ,并且
它们在海洋中分布广泛 ,从大洋水体到世界各沿岸海区 ,
生活环境变化多端 ,物种和生活环境的多样性为海洋藻
类带来了其生物活性物质的多样性。由于海洋环境的特
殊性 ,很多的海洋生物在高盐、高压、缺氧等恶劣生活环
境的长期进化和发展的过程中 ,为适应生存和竞争生存
空间 ,形成并产生了许多结构独特而药理作用显著的海
洋次生代谢物质 ,如抗菌、抗病毒 、抗肿瘤 、抗氧化等活性
物质[ 1] 。而海藻作为海洋生物链的第一生产者 ,为了抵
抗外界微生物的感染和猎食者的吞食而获得生存 ,它们
在不断的进化过程中产生了对各种敌害生物的抗性。由
于海藻本身没有像高等动物那样的细胞免疫系统 ,它们
的这种抗性是一种有目标地产生化学物质的防卫机制 ,
一般为藻类产生的次生代谢物质。另外 ,海洋藻类还是
很多其他消费者的活性物质的主要来源。自 20世纪 60
年代人们提出 “向海洋要药 ”的口号起 ,近 40年来海洋
化学及生命科学研究成为热点之一 [ 2 , 3] 。其中 ,对于海
洋藻类抗菌活性物质的研究由来已久 ,特别是随着很多
细菌 、真菌对抗生素耐药性和抗药性的加强 ,寻找新的抗
菌活性物质已成为了当务之急 。而海洋生物的多样性、
特殊性及复杂性是理想的新的抗菌素的资源宝库。海藻
抗菌活性物质的研究主要包括对具抗菌活性种类的筛
选 ,抗菌活性物质的提取、分离纯化及化学成分分析和结
构鉴定等。本研究以绿色木霉(Trichodermaviride)、黑曲
霉(Aspergilusniger)、圆弧青霉(Peniciliumcyclopium)为
研究对象 ,研究了乙醇提取物及薄层层析分离物对其生
长的影响 ,旨在为进一步开发利用海藻的天然活性物质
提供借鉴。
1　材料与方法
1.1　材料　铁钉菜采自石狮海域;海藻采回后立即清洗
干净 ,室内阴干 ,阴凉处保存备用。
1.2　真菌　本实验的供试真菌有 3种 ,即绿色木霉(Tri-
chodermaviride)、黑曲霉(Aspergilusniger)、圆弧青霉
(Peniciliumcyclopium),由福建农林大学许文耀教授分
离纯化 ,本实验室保存。
1.3　试剂　石油醚、丙酮、乙醇 、乙酸乙酯均为国产分析
纯 ,薄层层析硅胶为青岛海洋化工有限公司产品 。
1.4　仪器　高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公
司);SHB-ⅢB循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸
有限公司);旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);电热恒
温水浴锅(上海医疗器械五厂);VD-650型桌上式洁净
工作台(苏州净化设备);电热手提式压力蒸汽灭菌器
(上海医用核子仪器厂);TDGC2-3接触调压器(浙江正
泰电器股份有限公司);双层铁皮电炉(上海申航五金电
器厂丹阳分厂);ZF-Ⅰ型三用紫外分析仪(上海顾村电
光仪器厂)。
1.5　方法
1.5.1　铁钉菜样品的处理　将已经在通风处阴干的铁
钉菜 ,用高速万能粉碎机粉碎 ,保存于干燥器中备用。
1.5.2　铁钉菜的浸提液的制备　取干铁钉菜粉末适量 ,
加入 5倍体积的有机溶剂(乙醚 、乙醇),于 50 ℃水浴锅
中浸提 72 h,常温下每 3 d过滤 1次 ,再加等量的有机溶
剂 ,连续 3次 ,得到浸提液。
1.5.3　粗提物的制备　将浸提液经旋转蒸馏 ,直至把有
机溶剂全部蒸出 ,获得干物质即是粗提物 ,每一次旋转蒸
馏时都要过滤两次 。旋转蒸发时 ,当蒸馏瓶中的有机溶
剂很少时 ,每隔 30 min称重 1次 ,直至恒重。
1.5.4　萃取　将获得的粗提物以 10倍的比例 ,倒入蒸
馏水 ,充分振荡直到粗提物不再溶解 ,同样以 10倍的比
例倒入乙酸乙酯 ,充分振荡至粗提物全部溶解 ,然后把溶
液倒入分液漏斗中 ,上下充分振荡后 ,放在铁架台上静置
至分层 ,将水相和乙酸乙酯相分别收集。萃取时振荡一
定要充分 ,静置后 ,取乙酸乙酯相 ,这样就配制成 0.1 g/
mL的粗提有机溶剂溶液。
1.5.5　薄层层析分离方法　制作薄层层析板 ,称取薄层
层析硅胶 10 g,量取 30mL质量分数为 0.5%的羧甲基纤
维素钠 ,倒入研钵内研磨 10min,后铺板、颠板 、在光线下
观察 ,直至板均匀为止 ,常温下自然风干。烘箱中 100 ℃
条件下 ,烘 30 min活化 ,距离板边缘 1.5 cm处先画上一
条基线 ,然后将浸提液点到基线上 。将板点好后 ,配制展
层剂 ,将其倒入层析缸中 ,再把板放入层析缸 ,等各个特
征带分离后即可把板拿出。展层剂为丙酮∶石油醚 =1
∶3。
1.5.6　特征带的制备　对已经分离好的多个板 ,观察展
出来的条带数 ,计算出 Rf值 ,准备好试剂瓶收集特征带。
1.5.7　菌丝生长抑制实验　采用菌饼法进行生长速率
测定 ,在 PDA平板表面中心接种菌饼 ,然后用移液枪取
20μL铁钉菜提取液 ,注射在菌饼周围 。以等量的乙酸
乙酯作为对照 ,每处理重复 3次 。 28 ℃恒温培养 。观测
菌丝生长 ,测量直径 ,连续测量 3次 ,记录数据 。按慕立
义 [ 4]的方法计算抑制率:菌丝生长抑制率 =[ 1 -(处理
组生长直径 -菌饼直径)/(对照组生长直径 -菌饼直
径)] ×100%。
1.5.8　孢子萌发抑制实验　采用玻片法往干燥洁净的
无菌凹玻片凹孔中滴加 100μL海藻提取液 ,在超净台上
挥发至干;然后每孔滴加 100 μL配制好的孢子悬浮液 ,
28 ℃恒温保湿培养 6 h,显微镜下观察并记录孢子萌发
情况 。以等量的乙酸乙酯为对照 ,每处理重复 3次.按下
面公式计算孢子萌发抑制率:
孢子萌发抑制率 =(1 -处理萌发率 /对照萌发率)
×100%
2　结果与分析
2.1　乙醇提取物抗真菌活性　通过对铁钉菜乙醇浸提
后得到的粗提物 ,经薄层层析后 ,取各个特征带的乙醇浸
泡液并以乙醇作为对照 ,采用纸片法进行抗菌试验 ,抗菌
结果如表 1所示:通过薄层层析后 Rf0.52对圆弧青霉的
抗菌活性明显增加 ,而对黑曲霉 、绿色木霉的抗菌活性消
失 , Rf0.81的抗菌活性减弱。
表 1　铁钉菜提取物及层析带的抗真菌活性
提取物及层析带 黑曲霉 绿色木霉 圆弧青霉
乙醇提取物 2.59 - 1.23
Rf0.52 - - 1.63
Rf0.81 1.24 - -
　注:表中数据为抑制圈直径(mm);-表示没有抑制效果。
2.2　铁钉菜乙醇提取物对菌丝生长的抑制作用　以乙
醇作为对照 ,测定铁钉菜乙醇浸提粗物和薄层层析带乙
醇浸泡液对菌丝生长的抑制作用 ,试验结果表明:铁钉菜
乙醇提取物及各薄层层析带对绿色木霉均没有明显的抑
制作用;从表 2可见 ,乙醇提取物 、Rf0.52、Rf0.55、Rf
0.63对圆弧青霉的抑制率都随着时间的增加而降低 ,其
中 Rf0.55的抑制率最高 , Rf0.60反而促进其菌丝生长。
由表 3可知 ,乙醇提取物及薄层层析的 3个带即 Rf
0.00、 Rf0.63、Rf0.81对黑曲霉的抑制率随时间的增加
而降低 , Rf0.63对黑曲霉的抑制率较原粗提物高出 11.6
～ 29.5个百分点 ,而有些条带则表现出促进生长作用。
表 2　铁钉菜提取物及层析带对圆弧
　　　　　　　　青霉菌丝生长的抑制率 %
培养时间
(h)
乙醇提
取物
Rf
0.00 0.52 0.55 0.60 0.63 0.81
24 53.3 -33.3 33.3 66.7 -86.7 33.3 -66.7
36 42.9 -28.6 14.3 57.1 -85.7 14.3 -14.3
　注:浓度为 0.01g/mL。
表 3　铁钉菜提取物及层析带对黑曲霉
　　　　　　　　　菌丝生长的抑制率 %
培养时间
(h)
乙醇提
取物
Rf
0.00 0.52 0.55 0.60 0.63 0.81
24 17.6 15.3 -23.5 -47.1 -17.6 47.1 23.5
36 16.7 12.6 -20.8 -12.5 -12.5 28.3 4.2
　注:浓度为 0.01g/mL。
2.3　铁钉菜提取物对孢子萌发的抑制作用　对铁钉菜
乙醇粗提物和薄层层析带的乙醇浸泡液(以乙醇作为对
照)进行孢子萌发抑制试验 ,结果见表 4 ～ 6。从表 4看
出 ,乙醇提取物的分离带 Rf0.52对圆弧青霉的孢子萌
发有抑制作用 ,而铁钉菜乙醇提取物在浓度 0.005 g/mL
时抑制率达到了最高 。从表 5看出 ,铁钉菜乙醇提取物
71　11期　　　　　　　　　　　　欧阳桐娇等:铁钉菜乙醇提取物对真菌生长的影响
对绿色木霉孢子萌发有抑制作用 ,浓度为 0.005 g/mL时
抑制率达到了 99%。从表 6中可以看出 , Rf0.52对黑曲
霉孢子萌发的抑制率随着浓度的下降而降低。
表 4　铁钉菜提取物及层析带对
　　　　　　　圆弧青霉孢子萌发的抑制率 %
提取物及层析带 浓度(g/mL)
0.010 0.005 0.001
乙醇提取物 80 97 78
Rf0.52 66 86 92
表 5　铁钉菜提取物及层析带对
　　　　　　　绿色木霉孢子萌发的抑制率 %
提取物及层析带 浓度(g/mL)
0.010 0.005 0.001
乙醇提取物 95 99 97
Rf0.55 67 58 76
Rf0.60 93 74 42
表 6　铁钉菜提取物及层析带对
　　　　　　　　黑曲霉孢子萌发的抑制率 %
提取物及层析带 浓度(g/mL)
0.010 0.005 0.001
乙醇提取物 80 99 92
Rf0.52 89 86 72
3　讨论
前人研究业已证明海藻中含有丰富的抗菌活性物
质 ,并且有良好的抗细菌活性 [ 5-6] 。但对海藻提取物中
是否有抗真菌活性物质尚存在争议。有研究表明 ,海藻
提取物的抗细菌活性和抗真菌活性相当。而有的试验结
果表明海藻提取物没有抗真菌活性。 Sreenivasa和 Pad-
makumar发现海藻提取物具有抗真菌活性 。陈灼华等 [ 5]
和 Zheng, etal[ 7]的研究也都证明了海藻提取物的抗真菌
活性。作者所做的实验表明铁钉菜乙醇提取物有一定的
抗真菌活性。
海藻提取物中有许多的活性物质。徐年军等 [ 6]和
林雄平[ 8]等使用乙酸乙酯和水对海藻乙醇提取物进行
萃取后 ,对两萃取相分别采用薄层层析进行了初步分离 ,
并测定了不同层析带的抑菌活性 ,结果发现大部分薄层
层析分离组分的抗菌活性均强于分离前的粗提物。作者
所做的实验也用薄层层析法分离了乙醇提取物 ,表明大
部分薄层层析分离组分都有抗菌活性 ,可是没有粗提物
的活性高。
本实验采取了菌饼法 、玻片法、纸片法测定铁钉菜
提取物对 3种真菌生长的影响 ,其中纸片法是比较成熟
的方法 ,前人经常有使用纸片法的报道 ,而其他 2种方法
的报道较少 。本文菌饼法、玻片法的实验结果与纸片法
的实验结果还是比较一致的 。
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(上接第 69页)
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72 江　西　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　 　　　　　　19卷