全 文 ：327
周向军1，高义霞1，张永德1，张 继1，2，*
(1.天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水 741001;
2.西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州 730070)
摘 要:以苋菜为原料，利用正交实验研究了不同因素对苋菜多酚得率的影响，同时对苋菜多酚的抗氧化作用进行了
探讨。结果表明，提取时间对苋菜多酚得率有显著影响，最佳提取工艺为:提取时间 40min，提取温度 40℃，固液比
1∶25(g /mL) ，乙醇浓度 50%，在此条件下重复三次，苋菜多酚得率为 16.04%。抗氧化实验表明，苋菜多酚对羟自由
基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基均具有显著的清除作用(p ＜ 0.05) ，且清除作用随其浓度增大而增强。
关键词:苋菜，多酚，提取，抗氧化
Study on extraction technology and antioxidant activity of polyphenol
from Amaranthus mangostanus L.
ZHOU Xiang－jun1，GAO Yi－xia1，ZHANG Yong－de1，ZHANG Ji1，2，*
(1.College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，China;
2.Department of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China)
Abstract:Effect of different factors on polyphenol from Amaranthus mangostanus L.and its antioxidant activity were
investigated.The results showed that extraction time had significant effect on polyphenol yield，and the optimum
extraction conditions were obtained by orthogonal tests as follow:extraction time 40min，extraction temperature
40℃，solid － liquid ratio 1 ∶ 25(g /mL) ，ethanol concentration 50% .Under these conditions，polyphenol yield was
16.04% . Antioxidant activity showed that polyphenol from Amaranthus mangostanus L.had significant scavenging
action on hydroxyl radical，superoxide anion radical，DPPH free radical(p ＜ 0.05) ，and its scavenging action
increased with increasing concentration.
Key words:Amaranthus mangostanus L.;polyphenol;extraction;antioxidant activity
中图分类号:TS255.1 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2012)06－0327－05
收稿日期:2011－04－27 * 通讯联系人
作者简介:周向军(1980－) ，男，讲师，研究方向:生物化学与分子生
物学。
基金项目:天水师范学院重点学科支持项目。
苋菜(Amaranthusm angostanus L.) ，苋科青苋属
一年生草本植物，又称青香苋、赤苋、米苋等［1］。世界
粮农组织(FAO)调查资料发现，苋菜富含铁、钙和维
生素 C，是很好的绿色保健蔬菜［2］。苋菜具有较高的
药用价值，具有清热解毒、收敛止血等作用，主治黄
疸、痢疾等疾病［3］。多酚类物质是广泛存在于植物体
内的一类具有多种生理功能的活性物质，大量研究
表明，植物多酚在抗诱变、抗肿瘤、抗病毒、抗微生
物、抗衰老、抗氧化等很多方面具有显著作用，在食
品、化工等方面具有广阔的应用前景［4－7］。本实验主
要优化苋菜多酚提取工艺，同时探讨了其抗氧化活
性，为进一步开发苋菜资源提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
苋菜 采自甘肃天水南山，经 60℃杀青粉碎成
粉末过 80 目筛，含水量为 5.56%，置于干燥器中储存
备用;甲硫氨酸、邻菲啰啉、没食子酸、核黄素、Tris、
三氯化铁、三氯乙酸、铁氰化钾、氯化硝基四氮唑兰
(NBT)、福林酚试剂、Na2CO3 等 均为分析纯;VC 和
DPPH(1，1 －二苯基 － 2 －苦基肼自由基) Sigma
公司。
TGL－20M高速冷冻离心机 湘仪离心机有限公
司;722 可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司;
DK－S24 电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备公司;
PHS－3D 精密酸度计 上海精密科学仪器有限公司
雷磁仪器厂;AL－204 电子天平 梅特勒－托利多;
ZRD－7080恒温鼓风干燥箱 上海智城分析仪器制造
有限公司;90－3磁力搅拌器 上海亚荣生化仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 多酚标准曲线的制作 精密称取没食子酸标
准品 0.025g，用水溶解并定容至 50mL，得 0.5mg /mL
的标准溶液。准确吸取标准溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、
0.8、1.0、1.2、1.4mL置于 10mL 容量瓶中，再加入 1mL
328
福林酚试剂，摇匀后再加入 2mL 质量分数 15% 的
Na2CO3 溶液，定容至 10mL，75℃水浴 10min 后，在波
长为 760nm 处测定样品的吸光度。以浓度为横坐
标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线［8－10］。
1.2.2 苋菜多酚的制备及含量测定 样品粉碎过 80
目筛，称取苋菜粉 1.0g放入圆底烧瓶中，按一定的固
液比加入一定体积一定浓度的乙醇，置于一定的温
度条件下浸提一定时间，3000r /min 离心 10min 进行
第二次提取，合并两次液体，记录总体积。取一定量
的苋菜多酚液，同标准曲线操作，计算样液多酚
含量。
多酚总含量(mg)=样液多酚含量(mg /mL)×
10(mL)×提取液总体积(mL)/测定样液体积(mL)
多酚得率(%)= 多酚总含量(mg)/苋菜重量
(mg)× 100%
1.2.3 单因素实验 称取 1.00g 苋菜粉末，以一定比
例的固液比加入一定体积的乙醇，在一定的温度条
件下分别浸提一定时间，离心合并上清液测定多酚
含量，以探讨提取时间、提取温度、固液比及乙醇浓
度对多酚得率的影响。
1.2.4 正交实验 在单因素实验基础上，以提取时
间、固液比、提取温度及乙醇浓度为考察因素，采用
正交设计 L9(3
4)进行苋菜多酚提取最佳工艺的优
化，见表 1。
表 1 因素水平表
Table 1 Factors and levels table
水平
因素
A提取时间
(min)
B固液比
(g /mL)
C提取温度
(℃)
D乙醇浓度
(%)
1 30 1∶15 35 45
2 40 1∶20 40 50
3 50 1∶25 45 55
1.2.5 抗氧化实验
1.2.5.1 总还原力的测定 取 1.00mL 提取液置于试
管中，依次加入 0.75mL 0.2mol /L pH 6.6 磷酸盐缓冲
溶液、0.75mL 1%铁氰化钾混匀，50℃水浴 20min;冰
浴快速冷却后，加入 0.75mL 10% 三氯乙酸，置于
3000r /min、4℃下离心 10min;取上清液 1.5mL 加入
0.1% FeCl3 0.5mL及 H2O 10mL 混匀后，室温静置反
应 10min，在 700nm处测定提取液吸光值为 A1，以 VC
为对照 A，并以零管空白，计算样液的相对还
原力［11］。
相对还原力 = A－A1
1.2.5.2 对羟基自由基(·OH)清除率的测定 试管
中依次加入 5mmol /L邻菲啰啉 0.2mL、Tris－HCl缓冲
液 (50mmol /L，pH 7.4)1.0mL、7.5mmol /L FeSO4
0.2mL、2.5mmol /L EDTA 0.2mL 及一定体积的样品，
补充体积至 4.8mL 后加入 1% H2O2 0.2mL 启动反
应，37℃水浴反应 60min 后于 536nm 处测定吸光
度值［12］。
· OH 清除率 (%) = ［A0 － Ax－A( )x0 ］/A0
× 100%
式中:A0 为空白液吸光度;Ax 为加入多酚溶液
后吸光度;Ax0为多酚溶液本底吸光度。
1.2.5.3 对超氧阴离子(O －2 ·)清除率的测定 以
0.05mol /L pH 7.4 的 PBS 缓冲液为溶剂，配制 3.3 ×
10 －6 mol /L 的核黄素，0.01mol /L 甲硫氨酸，4.6 ×
10 －5mol /L氯化硝基四氮唑兰。分别取上述 3 种溶液
各 2.0mL，加入不同浓度的多酚溶液 1.0mL，空白管以
1.0mL缓冲液代替样品溶液。置于光照箱中光照
30min，取出后以缓冲液为参比于 560nm 处测定容液
的吸光度［13］。A0 为空白管吸光度，A样 为样品管吸
光度。
清除率(%)=(A0－A样)/A0 × 100%
1.2.5.4 对 DPPH自由基清除率的测定 准确量取
1.2mL DPPH溶液，加入 2.8mL 95%乙醇溶液，混匀，
在波长 520nm处测吸光度记为 AC，自由基清除率为
零。分别准确量取 1mg /mL的多酚溶液 0.2、0.4、0.6、
0.8、1.0mL，加入 1.2mL DPPH 溶液及 2.6、2.4、2.2、
2.0、1.8mL的 95%乙醇溶液混合均匀，在波长 520nm
处测吸光度记为 Ai。另外分别准确量取 1mg /mL 的
多酚溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加入 3.8、3.6、3.4、
3.2、3.0mL 的 95% 乙醇溶液后混合均匀，在波长
520nm处测吸光度记为空白校正 Aj 值
［14］。以 VC 作
为阳性对照，按下式计算自由基清除率 K。
K(%)=［1－(Ai－Aj)/Ac］× 100%
1.2.6 数据分析 实验数据以 SPSS16 进行统计数
据处理，p ＜ 0.05 差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 多酚标准曲线的制作
以没食子酸为标品制作多酚标准曲线，方程为
y = 8.22629x－0.0087，R2 = 0.9993。
图 1 多酚标准曲线
Fig.1 Standard curve of polyphenol
2.2 单因素实验
由图 2 可知，多酚得率随提取时间的增加而显
著升高，40min 达最大值，其后随提取时间延长其得
率下降，原因可能是提取时间短，提取不完全，而提
取时间过长，则对多酚有一定的氧化分解作用。因
此提取时间以 40min为宜。
由图 3 可知，随着固液比不断加大，多酚得率显
著提高，当固液比为 1∶20(g /mL)左右时多酚得率最
大，考虑到提取液用量过多会给浓缩等后续工作带
来困难，增加提取成本［15］，因此选择 1 ∶20(g /mL)作
为最佳固液比。
由图 4 可知，多酚得率随提取温度的不断上升
而增加，当温度达到 40℃左右时达最大值。温度过
高对多酚稳定性产生影响，其得率随之降低。所以
329
图 2 提取时间对多酚得率的影响
Fig.2 Effects of extraction time on polyphenol yield
图 3 固液比对多酚得率的影响
Fig.3 Effects of solid－to－liquid ratio on polyphenol yield
图 4 提取温度对多酚得率的影响
Fig.4 Effects of extraction temperature on polyphenol yield
本实验的提取温度选择 40℃为宜。
由图 5 可知，多酚得率随乙醇浓度的增大而先
增加后减小，当乙醇浓度为 50%时多酚得率达到最
大，随后其得率明显减少，原因一是当乙醇浓度高于
50%时，溶出较多醇溶性杂质、色素、亲脂性较强的
成分，这些成分与多酚类化合物竞争同一乙醇水分
子［16］，二是多酚均与植物组织中蛋白质、生物碱、花
色苷等物质以氢键和其他疏水键结合在一起，水分
子虽然可以自由通过细胞膜，但对氢键和疏水键无
断裂作用，乙醇作为有机溶剂能有效破坏氢键和疏
水键，所以含水过高或太低均不利于细胞内多酚物
质断裂和扩散［17］，因此本实验选择 50%乙醇。
2.3 正交实验结果分析
正交实验优化苋菜多酚提取工艺结果见表 2，各
因素影响顺序依次为 A ＞ D ＞ C ＞ B，即提取时间对苋
菜多酚得率影响最大，固液比对苋菜多酚得率影响
最小。由表 3 可知，提取时间的 F 值为 23.968，大于
F0. 05(2，2)值 19.00，因此提取时间对苋菜多酚得率有
显著影响;提取温度、固液比的 F 值 3.235 和 7.472 小
于 F0. 05(2，2)值，因此提取温度和固液比对多酚得率的
影响不显著。本实验最佳水平组合为 A2B3C2D2，即优
图 5 乙醇浓度对多酚得率的影响
Fig.5 Effects of ethanol concentration on polyphenol yield
化工艺条件为:提取时间 40min，固液比 1∶25(g /mL) ，
提取温度 40℃，乙醇浓度 50%。在此条件下重复三
次进行验证实验，苋菜多酚得率为 16.04%。
表 2 正交实验设计与结果
Table 2 Design and results of orthogonal experiment
实验号 A B C D 多酚得率(%)
1 1 1 1 1 9.47
2 1 2 2 2 10.86
3 1 3 3 3 10.08
4 2 1 1 3 11.18
5 2 2 3 1 14.03
6 2 3 2 2 13.20
7 3 1 3 2 11.68
8 3 2 1 3 11.86
9 3 3 2 1 12.18
k1 10.14 11.51 11.89 10.78
k2 12.80 11.41 11.91 12.25
k3 11.91 11.91 11.04 11.82
R 2.66 0.50 0.87 1.47
表 3 正交实验方差分析表
Table 3 Variance analysis of orthogonal experimental results
变异来源
偏差
平方和
自由度 均方 F值 显著性
A 11.048 2 5.524 23.968 0.040
B 3.444 2 1.722 7.472 0.118
C 1.491 2 0.746 3.235 0.236
D(误差) 0.461 2 0.230
2.4 抗氧化实验
物质的还原能力被认为是其潜在抗氧化性的重
要表现［18］。由图 6 和图 7 可知，苋菜多酚总还原力
低于 VC，但仍然具有较强的还原力，同时具有明显的
剂量依赖性;由图 8和图 9可知，苋菜多酚对 DPPH自
由基具有极显著的清除作用(p ＜ 0.05)［19－20］，其清除作
用低于 VC，在 0.2～1mg /mL 浓度范围内随浓度的不断
增大，其清除作用逐渐增加，当浓度为 1mg /mL时清除
率为71.58%，苋菜多酚和VC 对DPPH自由基的 IC50分
别为 0.5952、0.0175mg /mL;由图 10 和图 11 可知，在
0.07～0.32mg /mL浓度范围内，苋菜多酚对羟自由基具
有极显著的清除作用(p ＜ 0.05)［21］，当浓度为
0.32mg /mL时清除率为 65.63%，苋菜多酚和 VC 对羟自
由基的 IC50分别为 0.2060、0.0295mg /mL;对超氧阴离
子自由基清除采用 NBT 法测定，NBT 与超氧阴离子
自由基作用有明显的颜色变化，加入的物质能清除
自由基、降低 NBT 的还原程度，颜色变化程度将减
330
弱［22］。由图 12 和图 13 可知，在 0.072～0.322mg /mL
浓度范围内，苋菜多酚对超氧阴离子自由基具有显
著的清除能力(p ＜ 0.05)［23－24］，其清除能力随浓度的
增大不断增强。当浓度为 0.322mg /mL 时清除率为
66.89%。苋菜多酚和 VC 对超氧阴离子自由基的
IC50分别为 0.2419、0.0198mg /mL。
图 6 多酚总还原力实验
Fig.6 Total reduction of polyphenol
图 7 VC 总还原力实验
Fig.7 Total reduction of Vc
图 8 多酚对 DPPH·的清除作用
Fig.8 Scavenging action of polyphenol on DPPH radical
图 9 VC 对 DPPH·的清除作用
Fig.9 Scavenging action of VC on DPPH radical
3 结论
正交实验结果表明，提取温度对苋菜多酚得率
有显著影响，最佳提取工艺为:提取时间 40min，提取
温度 40℃，固液比 1∶25(g /mL) ，乙醇浓度 50%，在此
图 10 多酚对羟自由基的清除作用
Fig.10 Scavenging action of polyphenol on hydroxyl radical
图 11 VC 对羟自由基的清除作用
Fig.11 Scavenging action of Vc on hydroxyl radical
图 12 多酚对超氧阴离子自由基的清除作用
Fig.12 Scavenging action of polyphenol
on superoxide anion radical
图 13 Vc 对超氧阴离子自由基的清除作用
Fig.13 Scavenging action of Vc on superoxide anion radical
条件下重复三次，苋菜多酚得率为 16.04%。抗氧化
实验表明，苋菜多酚对羟自由基、超氧阴离子自由
基、DPPH自由基均具有显著的清除作用(p ＜ 0.05) ，
且清除作用随其浓度增大而增强。
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75－78.
(上接第 326 页)
图 6 pH与萃取率之间的关系
Fig.6 Relationship between extraction yield and pH
取率和分配系数达到该体系下的最大值分别为
99.5%和 186.5。而该点恰好是对应双水相系统没有
加任何酸或碱，以水做参比所得到的。
3 结论
聚乙二醇 /盐双水相体系萃取 L－苯丙氨酸的结
果表明，聚合物的相对分子质量，聚合物的质量分
数，盐的种类及浓度，L－苯丙氨酸的初始浓度和 pH
等对双水相体系的萃取效果影响很大。在聚乙二醇
1000 /磷酸氢二钾双水相体系中，萃取率随着聚乙二
醇质量分数和磷酸氢二钾浓度的增加而增大，随着 L
－苯丙氨酸初始浓度的增加和 pH 的增大先增大后减
小。当聚乙二醇 1000 的质量分数为 27%，磷酸氢二
钾的质量浓度为 0.15g /mL，L－苯丙氨酸的初始浓度
为 10g /L，体系的 pH 为 8.5 时，萃取率最高为
99.5%，分配系数最大为 186.5。因此可以进一步应
用聚乙二醇 /盐双水相体系分离小分子氨基酸等物
质的研究。
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