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藤梨根中乌苏烷三萜化合物A对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响



全 文 :[收稿日期] 20150408(026)
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81360627) ;江西省自然科学基金项目(20132BAB205088) ;湖南省研究生科研创新项目
(CX2014B358)
[第一作者] 程齐来,博士,副教授,从事中药资源开发与利用研究,Tel:18970786158,E-mail:cql_57@ 126. com
[通讯作者] * 刘塔斯,博士生导师,教授,从事中药资源开发与利用研究,Tel:13036794420,E-mail:liutasi@ 126. com
藤梨根中乌苏烷三萜化合物 A对
宫颈癌 HeLa细胞增殖的影响
程齐来1,2,喻亚飞1,李映辰1,黄志勤2,刘塔斯1*
(1. 湖南中医药大学,长沙 410208;2. 赣南医学院 药学院,江西 赣州 341000)
[摘要] 目的:从赣南藤梨根中提取分离得到乌苏烷三萜化合物 A(2β,3β,23-三羟基-12-烯-28-乌苏酸,ursolic compound
A) ,研究其对人宫颈癌 HeLa细胞株的增殖抑制作用。方法:应用 E-MEM培养基建立宫颈癌 HeLa细胞体外培养体系,将 4 种
不同浓度(0. 5,1. 0,2. 0,4. 0 μmol·L -1)的 ursolic compound A作用后的宫颈癌细胞(每孔含2 000细胞)在 96 孔细胞培养板上
培养 24,48 h;细胞活力采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测,乳酸脱氢酶(LDH)活性用噻唑蓝(MTT)法测定,肿瘤细胞增殖情
况采用免疫比色法检测。结果:与对照组相比,用 0. 5 ~ 4. 0 μmol·L -1 ursolic compound A 处理过的 HeLa 细胞,其乳酸脱氢酶
释放率随着剂量增大和时间延长而增加 (P < 0. 05,P < 0. 01) ;CCK-8 和 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)检测结果表明,化合物 A
比对照药物抗宫颈癌活性相对较强,作用效果呈浓度与时间依赖性,宫颈癌细胞的活性也相应不断下降,同时该化合物对宫
颈癌细胞株的增殖抑制作用也较明显(P < 0. 05,P < 0. 01)。结论:Ursolic compound A对 HeLa细胞增殖有一定抑制作用。
[关键词] 乌苏烷三萜化合物 A;增殖抑制;人宫颈癌 HeLa细胞株
[中图分类号] R285. 5 [文献标识码] A [文章编号] 1005-9903(2015)24-0084-04
[doi] 10. 13422 / j. cnki. syfjx. 2015240084
Effect of Ursolic Compound A from Root of Actinidia chinensis on Proliferation of Cervical Cancer HeLa
Cells CHENG Qi-lai1,2,YU Ya-fei1,LI Ying-chen1,HUANG Zhi-qin2,LIU Ta-si1* (1. Hunan University of
Chinese Medicine,Changsha 410208,China;2. School of Pharmacy,Gannan Medical University,Ganzhou
341000,China)
[Abstract] Objective:To investigate the effect of 2β,3β,23-trihydroxy-urs-12-en-28-olic acid (ursolic
compound A)from the root of Actinidia chinensis on the proliferation of cervical cancer HeLa cells. Method:HeLa
cells (2 × 103cells /well) treated by ursolic compound A of different concentrations (0. 5,1. 0,2. 0,4. 0
μmol·L -1)were cultured in 96-well plates for 24,48 h after the cervical cancer HeLa cell lines in vitro culture
system was established by Essential Medium-Eagle (E-MEM)medium;the viability of HeLa cells was detected by
cell counting kit-8 (CCK-8). The activity of lactic dehydrogenase (LDH) was measured by methyl
thiazolyltetrazolium (MTT)assay. Immune colorimetry was used to test the proliferation of HeLa cells. Result:
Compared with the control group,for HeLa cells treated by ursolic compound A of different concentrations,the
release rate of LDH was increased in a dosage and time dependent manner (P <0. 05,P <0. 01). Results of BrdU
and CCK-8 showed that,the inhibitory effect of ursolic compound A to HeLa cell was stronger than control drugs,
and its inhibitory effect was in a dosage and time dependent manner. The activity of cervical cancer cells would be
decreased accordingly,and at the same time,the compound had significant inhibition effect on the proliferation of
cervical cancer cells (P < 0. 05,P < 0. 01). Conclusion:Ursolic compound A has an inhibitory effect on the
proliferation of HeLa cells.
[Key words] ursolic compound A;inhibitory proliferation;cervical cancer HeLa cells
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藤梨根即猕猴桃根,系猕猴桃科植物猕猴桃
Actinidia chinensis的根,有清解热毒,活血,祛风湿等
功效,主要用于治疗肝炎;血痢;热淋;风湿湿热;无
名肿毒等[1]。藤梨根作为一种民间使用的中药,在
江西赣南地区具有悠久的应用历史,特别是在赣州
市的崇义县、信丰县、定南县、龙南县等地,广泛应用
藤梨根治疗肺癌,胃癌,肝癌,鼻咽癌,结肠癌等。猕
猴桃种质资源在我国分布也极为广泛,主要分布于
江西、四川、广西、和湖北。本课题组 2008 ~ 2014 年
对江西赣南地区中草药资源调查结果也进一步证
实,在赣南野生猕猴桃中药资源非常丰富,因此研究
开发猕猴桃属植物,特别是研究其抗癌作用,有着显
著的社会效益和经济效益。
尽管藤梨根民间应用较多,但目前国内外对藤
梨根大部分研究主要集中于化学成分提取分离鉴
定、提取物(水煎液、乙酸乙酯有效部位、正丁醇有
效部位等)的抗肿瘤作用及含藤梨根复方抗肿瘤作
用等,对从藤梨根中提取分离得到的抗肿瘤活性成
分特别是乌苏酸类的研究相对较少。以往研究表
明,猕猴桃科植物根里面的主要化学成分是五环三
萜类、黄酮类、蒽醌、酚类等[2]。本课题组通过前期
的研究,已经从其中分离鉴定得到一些三萜类化合
物,其中的一个乌苏烷三萜化合物 A(compound
A) ,又名 2β,3β,23-三羟基-12-烯-28-乌苏酸(2β,
3β,3-trihydroxy-urs-12-en-28-olic acid) ,属于乌苏烷
型三萜类,而现代研究表明一些三萜和三萜皂苷特
别是具有羧基的该类化合物具有一定的抗肿瘤活
性[3-4],乌苏烷型三萜大多是乌苏酸(熊果酸)的衍
生物。在前期研究基础上,本项目主要研究
compound A对人宫颈癌细胞增殖的抑制作用,进一
步探讨藤梨根抗肿瘤作用的药效物质基础,以期为
赣南中草药藤梨根的深入研发提供技术支持。
1 材料
1. 1 药物及试剂 采用溶剂提取法和多种柱色谱
的方法对藤梨根进行分离,利用理化分析和波谱技
术对所得到的化合物进行鉴定,最终得到乌苏烷型
compound A,采用 Agilent110 HPLC,DAD检测器,面
积归一法测定其纯度,结果含量 > 97%;实验前用
水-二甲基亚砜(DMSO)20 ∶ 1溶解;E-MEM 培养基
(Sigma 公 司,批 号 S130405 ) ,DMSO (批 号
S140107) ,细胞计数试剂(CCK-8)试剂盒(批号
S131102) ,四唑盐(MTT,批号 S140101) ,乳酸脱氢
酶(LDH)试剂盒(批号 S140209) ,均为 Sigma 公司,
5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU,Sigma 公司,批号
S131002)。
1. 2 细胞株 HeLa 细胞株,赣南医学院科研中心
惠赠。
1. 3 仪器 BB15 型 CO2 培养箱(德国 Heraeus 公
司) ,354 型酶标仪(美国 Thermo公司)。
2 方法[5-7]
2. 1 细胞培养 将 HeLa细胞接种于含 2 mmol·L -1
L-谷氨酰胺,10%胎牛血清,100 U·mL -1的青霉素和
链霉素 100 mg·L -1的 E-MEM 培养基中,在 37 ℃,
5%CO2,95%饱和湿度的恒温密闭培养箱中进行一
般培养。每天检查细胞增殖状况,2 ~ 3 d传代 1 次。
后续实验都采用对数生长期的 HeLa细胞。
2. 2 细胞活力检测 细胞活力使用 CCK-8 检测分
析。将不同浓度(0. 5,1. 0,2. 0,4. 0 μmol·L -1)的
compound A接触过的宫颈癌细胞(每孔含2 000细
胞)在 96 孔板上培养 24,48 h,用二甲亚砜 DMSO为
对照溶剂,最终浓度≤ 0. 1%。每孔加入 10 μL
CCK-8 溶液,37 ℃恒温培养 4 h,用酶标仪在波长
450 nm处测定每孔的吸光度 A。HeLa 细胞株活性
用 A 处理组 / A 对照组 × 100%表示。每种浓度重复测定
5 次(n = 5)。
2. 3 LDH测定 乳酸脱氢酶活性按照 LDH试剂盒
说明进行测定。取对数生长期的 HeLa 细胞,胰酶
消化为单个细胞,作细胞计数,以 E-MEM 培养液稀
释为终密度为 2 × 104 /mL 的单细胞悬液,每孔
100 μL接种于 96 孔培养板中(接种 4 × 9 = 36 孔) ,
置 37 ℃,5%CO2 培养箱中过夜,待细胞贴壁后进行
试验。每孔分别添加 1%的胎牛血清(FBS)和 4 种
不同浓度 compound A(0. 5,1. 0,2. 0,4. 0 μmol·
L -1) ,持续培养 24 h 或者 48 h,每个浓度设 4 个复
孔,并设只加细胞、不加药液的对照孔和只加培养液
的调零孔。培养结束每孔加乳酸脱氢酶试剂和催化
剂(1∶ 45)50 μL,在室温下培养 30 min,反应通过添
加 50 μL 的停止液来结束,在波长 490 nm 处采用
MTT测定 LDH。Triton X-100 培养液作为作为阳性
对照。结果用 LDH 释放率表示。每种浓度重复测
定 5 次(n = 5)。
2. 4 BrdU检测细胞增殖 使用免疫比色法测定在
DNA合成过程中掺入的 BrdU数目检测细胞增殖情
况,依据试剂盒说明进行检测。将2 000 cells /well 与
不同浓度的 compound A(0. 5,1. 0,2. 0,4. 0 μmol·
L -1)96孔板培养24,48 h,加 BrdU(终浓度100 μmol·
L -1)继续作用 2 h,添加 anti-BrdU-POD 工作液,常
温下细胞固定培养 2 h。于 490 nm处测定免疫复合
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物。其吸光度 A直接与 DNA中的掺入的 BrdU数目
相关,代表细胞增殖状况。每种浓度重复测定 5 次
(n = 5)。
2. 5 不同实验 IC50值的比较 以依托泊苷以及乌
苏酸(UA)为阳性对照药物,在上述 2. 2,2. 3,2. 4 实
验的同时,取对数生长期 HeLa 细胞,制成 1 × 105 /
mL的悬液,按每孔 100 μL 接种于 3 块 96 孔培养
板。24 h后加药,实验设空白组和阴性组及 5 种不
同浓度药物组(etoposide 组,UA 组,compound A
组) ,终浓度分别为 0. 5,1,2,4,8,16 μmol·L -1,每
个浓度设 8 个复孔。分别培养 24,48,72 h,加 MTT
50 μg /孔,继续培养 4 h 后加 DMSO 200 μL /孔,酶
标仪上机检测(震荡 10 min,测单波长 570 nm 处
A)。按(A阴性对照组 - A加药组)/(A阴性对照组 - A空白对照组)
计算 3 种药物对细胞的生长抑制率及 IC50(用 SPSS
17. 0 软件计算)。
2. 6 统计分析 数据以 珋x ± s 来表示。实验数据都
源于超过 3 个独立相同模型的实验。数据采用
SPSS 17. 0 统计软件进行单因素方差分析,随后进
行 Dunnett多重比较分析。P < 0. 05 为差异有统计
学意义。
3 结果
3. 1 细胞毒性 LDH释放和 CCK-8 测定细胞活性
3. 1. 1 LDH释放 2. 0,4. 0 μmol·L -1的 compound
A作用 HeLa 细胞 24,48 h 后,LDH 释放增加,尤其
是处理 48 h 后,相对于对照组,在 2. 0,4. 0 μmol·
L -1 LDH 释放显著增加(P < 0. 05,P < 0. 01)。
compound A对 HeLa细胞的毒性表现出了浓度和时
间的依赖性。见表 1。
表 1 Ursouc compound A 对 HeLa 细胞 LDH 释放的影响(珋x ± s,
n = 5)
Table 1 Effects on LDH release of ursouc compound A in HeLa
cell (珋x ± s,n = 5)
组别
浓度
/μmol·L -1
LDH释放率 /%
24 h 48 h
对照 - 2. 48 ± 0. 67 5. 60 ± 1. 05
compound A 0. 5 0. 98 ± 0. 45 1. 25 ± 0. 83
1. 0 3. 27 ± 0. 51 6. 11 ± 1. 00
2. 0 6. 45 ± 0. 462) 8. 23 ± 0. 981)
4. 0 12. 43 ± 1. 132) 12. 52 ± 1. 022)
注:与对照组比较1)P < 0. 05,2)P < 0. 01(表 2 ~ 3 同)。
3. 1. 2 CCK-8 测定细胞活性 在 compound A作用
浓度增加及作用时间延长后,细胞的活性也相应的
随着下降。compound A 于同一浓度 4. 0 μmol·L -1
处理 24,48 h以后,宫颈癌细胞活性由 39. 15%降低
到 18. 12%。见表 2。
表 2 Ursolic compound A对 HeLa细胞活性的影响(CCK-8,珋x ± s,
n = 5)
Table 2 Effects on activity of ursolic compound A in HeLa cell
(CCK-8,珋x ± s,n = 5)
组别
浓度
/μmol·L -1
细胞活性 /%
24 h 48 h
对照 - 100. 00 ± 1. 05 100. 00 ± 2. 24
compound A 0. 5 98. 38 ± 1. 20 98. 45 ± 2. 36
1. 0 90. 65 ± 0. 591) 84. 53 ± 4. 052)
2. 0 71. 07 ± 1. 812) 44. 72 ± 0. 852)
4. 0 39. 15 ± 1. 642) 18. 12 ± 1. 662)
3. 2 BrdU 测定细胞增殖 4 种浓度(0. 5 ~ 4. 0
μmol·L -1)compound A 处理 HeLa 细胞 48 h 后,细
胞增殖分别从 99. 05%下降到 24. 80%。compound
A作用 24 h后对 HeLa细胞增殖的影响呈相同作用
趋势。见表 3。
表 3 Ursolic compound A对 HeLa细胞增殖的影响(珋x ± s,n = 5)
Table 3 Effects on cell proliferation of ursolic compound A in
HeLa cell (珋x ± s,n = 5)
组别
浓度
/μmol·L -1
细胞增殖率 /%
24 h 48 h
对照 - 100. 00 ± 0. 38 100. 00 ± 1. 04
compound A 0. 5 100. 00 ± 1. 12 99. 05 ± 0. 96
1. 0 98. 85 ± 1. 03 85. 76 ± 2. 011)
2. 0 50. 31 ± 1. 152) 48. 42 ± 1. 132)
4. 0 45. 89 ± 0. 882) 24. 80 ± 1. 232)
3. 3 不同实验 IC50的对比 通过检测常用的抗肿
瘤药物依托泊苷和 compound A结构类型相似的 UA
的 IC50来对比药物的细胞毒性,不同试药的 IC50见
表 4。
基于以上 3 种细胞水平的试验中,compound A
呈现出一定的抗肿瘤潜力,发挥了相对较强的抗宫
颈癌细胞作用,IC50各自对应值是 3. 82 μmol·L
-1
(LDH测定) ,1. 43 μmol·L -1(CCK-8 测定) ,1. 57
μmol·L -1(BrdU测定)。
4 讨论
女性常发的恶性肿瘤多为乳腺癌、卵巢癌、宫颈
癌、其中宫颈癌发生率较高,排名第二。各种抗肿瘤药
物的研发也进入刻不容缓的时期,寻找低毒,效率高,
副作用少的药物,一直被视为现阶段科研工作者的研
究重点[8]。中草药抗肿瘤有一定优势,毒副作用低,对
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表 4 不同测定方法下 ursolic compound A 和对照药与肿瘤细胞作
用 48 h的细胞毒性
Table 4 Cytotoxicity of ursolic compound A and contrast drugs at
different cell level measurement method
药名
IC50 /μmol·L -1
LDH CCK-8 BrdU
依托泊苷 13. 24 10. 32 5. 10
乌苏酸 9. 45 5. 72 4. 60
compound A 3. 82 1. 43 1. 57
免疫调节作用显著,可有效延长病人的存活时间。
最近一段时期,中草药由于其安全性和不良反
应少等优点已成为肿瘤医学的研究热点之一。研究
者利用中草药抗肿瘤的优势,结合中医理论对中草
药进行了研究发现如山绿茶、白头翁、山核桃、小白
菊等具有良好的抗肿瘤作用[9-10]。体内动物实验证
实,A. eriantha 根的有机提取物有一定的抗肿瘤作
用[11]。许多细胞实验也证明,不同品种来源的猕猴
桃根,如藤梨根的正丁醇部位,山梨猕猴桃根乙醇部
位对多种肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用[12]。
采取非体内细胞的培育手段实施药效测定与细
胞毒性研究,在当今世界已经作为一般的研究措施,
主要优势是能方便、经济、稳定地开展诸多药物筛
选。本研究 MTT 测定结果表明 compound A 呈时
间-剂量依赖性抑制 HeLa 细胞增殖,24,48,72 h 时
IC50分别为 1. 48,1. 45,1. 42 μmol·L
-1。
本次体外抗肿瘤活性筛选实验研究结果表明,
用不同浓度(0. 5 ~ 4. 0 μmol·L -1)野生猕猴桃植物
根中分离提取的乌苏烷型三萜化合物 A 处理过人
宫颈癌 HeLa细胞后,其 LDH释放增加,并且呈剂量
和时间依赖性;在 CCK-8 和 BrdU 测定过程中,
compound A比依托泊苷以及结构类似物 UA抗宫颈
癌细胞活性相对较强,并且细胞的活性随着化合物
浓度及作用时间的增加而相对应的降低,对宫颈癌
细胞增殖抑制作用也较突出。由此推断 compound
A具有一定的抑制 HeLa 细胞增殖作用,为该类癌
症的防治所需的新的化疗药或其结构相似物的发现
提供了非常有利的理论依据。
依托泊苷为目前临床上常用的抗肿瘤药物之
一,其不良反应较大是制约其临床广泛应用的主要
因素。通过本次实验结果比较,作用于同一人宫颈
癌 HeLa细胞,compound A 的 IC50明显低于依托泊
苷组,但是两者对正常人子宫颈上皮细胞生长的
抑制作用如何,有待进一步深入研究。若能证明在
相同作用浓度下,compound A 对正常人子宫颈上皮
细胞的抑制率明显比依托泊苷低,则可提示
compound A 不良反应更小,可能具有潜在的应用
前景。
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[责任编辑 聂淑琴]
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