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蝙蝠葛碱对人膀胱癌T-24细胞株生长增殖的抑制作用



全 文 :论著 文章编号:1000-5404(2006)18-1860-04
蝙蝠葛碱对人膀胱癌 T-24细胞株生长增殖的抑制作用
李 铭 1 ,梁文杰 2 ,曾亚平 3 ,贾涵真 2  (河北医科大学:1第四医院泌尿外科 , 2中西医结合学院内科教研室 , 石家庄
050011;3河北科技出版社 ,石家庄 050051)
  提 要:目的 探讨中药北豆根提取物蝙蝠葛碱(dauricine, Dau)对人膀胱癌 T-24细胞株的增殖抑制作用及其作用
机制。方法 应用 MTT法测定了蝙蝠葛碱对泌尿系肿瘤细胞增殖反应的影响;采用流式细胞技术 、荧光染色法 、琼脂糖
凝胶电泳等技术测定和观察了蝙蝠葛碱对诱导肿瘤细胞凋亡的影响。结果 蝙蝠葛碱对膀胱癌 T-24细胞株的增殖有较
强的抑制作用 , 具有浓度依赖性特点。 T-24细胞 DNA琼脂糖凝胶电泳呈现凋亡特征性梯形条带。流式细胞分析 , 浓度
为 5 ~ 30μg /m l的蝙蝠葛碱具有诱导人膀胱癌细胞凋亡的作用 ,且随着药物作用时间延长凋亡率逐渐增加 ,随药物浓度的
增高细胞周期被阻滞在 G
0
/G
1
期。 T-24细胞的 bcl-2基因表达受抑 , 而 bax基因的表达上调。结论 蝙蝠葛碱可有效抑制
人膀胱癌 T-24细胞株的生长增殖 ,阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡可能起重要作用。
  关键词:蝙蝠葛碱;膀胱癌;细胞凋亡;增殖抑制
  中图法分类号:R285. 5;R73-351;R737. 14 文献标识码:A
Inh ib itory effect of dauricine on growth of human b ladder cancer T-24 cell line
LIM ing
1 , LIANGW en-jie2 , ZENG Ya-ping3 , JIA H an-zhen2(1Departm ent o fU rinary Su rgery, The Fourth Hospita l, 2Depa rtm en t
o fM edicine, Integ ra ted T raditiona lCh inese andW este rnM edical Co llege, H ebe iM edical Unive rsity, Sh ijiazhuang 050011;3H ebe i Techno l-
ogy Pub lishing C om pany, Shijiazhuang 050051, China)
  Abstract:Object ive To investigate the inhibitory effect of dau ricine on the g row th of hum an b ladder
cancer T-24 ce ll and itsmechanism. Methods The T-24 ce lls we re treated w ith dau ricine (Dau) at differen t
concentrations. The pro liferation of T-24 cells was assayed w ithM TT co lorime tricmethod. The apoptosis o fT-24
ce lls induced by Dau w as studied by fluo rescent stain ing, flow cytome try (FCM) and DNA agarose gel electro-
phoresis. Results Dau e ffectively inhibited the pro liferation o f T-24 ce lls in a concentration dependentman-
ner. A characteristic DNA ladderw as observed in Dau treated groups. Dau at the concen tration of 5 - 30μg /m l
induced the apoptosis o fT-24 ce lls and the apoptosis rate increased in a time-dependeu tmanner. Ce ll cyclew as
arrested a tG0 /G1 phase. The expression o f bcl-2 w as inhibited and the expression o f bax was up-regula ted.
Conclusion Dauricine sign ificantly inhibits the grow th o f bladder cance r ce lls. Ce ll cy cle arrest and apop tosis
m igh t be the functiona lmechan isms.
  Key words:dau ricine;bladder cance r;apop tosis;flow cy tometry
  中药北豆根即蝙蝠葛根 , 为防己科植物蝙蝠葛
(menispermum dauricum)的干燥根茎 ,其性味苦寒 , 有
清热解毒 , 祛风止痛之功效 , 具有抑菌 、降压 、抗心率
失常等作用。近年来发现北豆根提取物也有抗癌作
用 。单保恩等[ 1]研究发现 ,北豆根提取物具有较强的
  基金项目:河北省科技厅攻关计划项目(052761853)
Supported by the Research P ro ject o f Sci& Tech Department o fH ebei
P rov ince(052761853)
  作者简介:李 铭(1967 -),男 ,山东省莱州市人 ,博士 ,副主任医师 ,主要从
事泌尿外科肿瘤的临床研究 , 发表论文 21篇。电话:(0311)
86033941-364
  收稿日期:2005-03-01;修回日期:2006-06-14
抗肿瘤作用 ,并提取了北豆根抗肿瘤的有效成分。为
此 ,我们利用北豆根纯化物蝙蝠葛碱(dauricine, D au)
研究其对膀胱癌细胞株的作用 ,为今后的药物开发和
临床治疗提供依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验瘤株及培养  人膀胱移行细胞癌 T-24细胞株
由武汉大学典型培养物保藏中心提供。复苏后培养在 RP-
M I1640培养液(含 10% ~ 20%胎牛血清 , 青霉素和链霉素各
100 U /m l及 0. 03%谷氨酰胺)中 , 置于 37 ℃, 饱和湿度 , 5%
CO
2
的培养箱中 , 细胞进入对数生长期后 , 收集细胞 , 调节成相
1860
第 28卷第 18期
2006年 9月    
第 三 军 医 大 学 学 报
ACTA ACADEM IAE MED IC INAE M IL ITARIS TERTIAE   
Vo .l 28, No. 18
Sep. 2006
DOI牶牨牥牣牨牰牥牨牰牤j牣牨牥牥牥牠牭牬牥牬牣牪牥牥牰牣牨牳牣牥牨牨
第 18期  李 铭 ,等. 蝙蝠葛碱对人膀胱癌 T-24细胞株生长增殖的抑制作用  
应浓度备用。
1. 1. 2 受试物  Dau由华北制药集团新药研究开发中心提
纯 , 经河北医科大学药学院鉴定。 该药为淡黄色粉末 , 熔点 98
~ 100℃(氯仿-环己烷 ), 相对分子质量 624. 7, 纯度 99. 8%。
用前以 1 mo l /L盐酸溶液溶解 , 氢氧化钠溶液调节为 pH 6. 0,
以生理盐水补充至所需体积。一次性滤器过滤 ,调节浓度为 0.
6 m g /m l, 4℃保存备用。
1. 1. 3 主要试剂  胎牛血清 , 杭州四季青生物工程材料公
司;RPM I1640和胰蛋白酶 , 美国 G ibco公司;四氮唑蓝 (MTT),
美国 S igm a公司;琼脂糖 , 美国 P rom ega公司;SDS, 美国 Bio tec
公司;T risbase, 北京化工厂;蛋白酶 K及溴化乙锭 , 华美公司产
品。
1. 1. 4 主要仪器  CO2培养箱 TC2323型 , 美国 SHELDON
公司;倒置相差显微镜 IMT-2型 , 日本 OLYM PUS;荧光显微镜
UFX-Ⅱ型 , 日本尼康;酶标仪 HT2型 , 奥地利 Antho s公司;薄层
层析板 S ilica ge l 60 F254型 ,美国 M erk公司产;EPICS-XL型流
式细胞仪为 Coulter Co. Hea leah, FL产品;FoToDYNE凝胶成像
系统 , 美国 Im age公司;SCR20B低温高速离心机 , 日本 H ITA-
CH I公司;DF-Cu电泳仪 ,北京六一仪器厂产品。
1. 2 方法
1. 2. 1 体外抑瘤实验  将肿瘤细胞株悬液接种于 96孔培
养板 , 每孔 100 μl(含 1 ×104个细胞) , 分别加入阴性对照磷
酸盐缓冲液( PBS)、阳性对照顺铂(DDP) 126 μg /m l和羟基喜
树碱(HCPT) 4. 2 μg /m l以及不同浓度 Dau各 10 μl, 4复孔。
置于饱和湿度 、37 ℃、 5% CO2培养箱中培养 72 h。结束前 4
h,各培养孔加入 5 mg /m lMTT 10 μl。培养结束后 , 离心 , 弃去
上清 , 每孔加入 15% SDS 100 μl, 过夜。次日用酶联免疫检测
仪检测各孔吸光度 A值 , 测定波长 λ=570 nm , 重复 3次并计
算抑制率。抑制率(C I) = (对照组 A值-实验组 A值) /对照
组 A值 ×100%。药物敏感实验判断标准:C I≥50%为敏感 ,
30 %≤C I<50%为中度敏感 , C I<30%为不敏感。
1. 2. 2 荧光染色实验  调节对数生长期的 T-24细胞浓度
为 1×105个 /m l, 与 30μg /m l和 0μg /m l的 Dau于 37℃培养 48
h,收集细胞 ,用磷酸盐缓冲液洗涤并重新悬浮 , 取 100 μl受检
细胞悬液 , 加 4μl吖锭橙(acridine o range, AO) / EB(浓度各为
100μg /m l)双荧光染色液 , 用滴管轻请吹打 , 在 37 ℃孵育 15
m in,取悬液 1滴滴于洁净玻片 , 加盖玻片 ,立即在 300 ~ 500 nm
波长下 , 用 ×400荧光显微镜进行凋亡形态学观察。
1. 2. 3 DNA提取及琼脂糖凝胶电泳  同上收集细胞 , 按文
献 [ 2]的方法提取 DNA, 溶于 20 μl TE 缓冲液中 (10 mo l /L
T ris-HC l, 0. 1 mo l /L EDTANa2 , pH 8. 0),将提取的基因组 DNA,
在 1. 8%琼脂糖凝胶中电泳(电压 80 V, 电泳缓冲液 1 ×TBE),
30 m in后移凝胶至凝胶成像系统进行观察。
1. 2. 4 流式细胞仪分析  调节肿瘤细胞浓度为 1×105个 /
m l, 与 30、 5、1 μg /m l和 0 μg /m l的 Dau于 37 ℃培养 24、 48、
72 h, 收集细胞 , 用磷酸盐缓冲液洗涤并重新悬浮 , 70%乙醇于
4 ℃固定 2 h, RNA酶 37 ℃处理 1 h, 与 P I(p ropid ium iod ide)室
温反应 10 m in,用流式细胞仪每个样品检测 10 000细胞事件 ,
重复 3次。 C ellfit分析软件测定细胞周期 DNA变化 , 计算出细
胞凋亡率。
1. 2. 5 bcl-2和 bax基因表达的检测  50 m l培养瓶接种 1×
106细胞 , 37 ℃培养 24 h后 , 加入和不加 (对照组 )30 μg /m l
Dau,作用 24 h胰酶消化收获细胞 , PBS洗 2次 , PBS稀释细胞
浓度 (2 ~ 5) ×104 /200 μl。 1∶50稀释 bcl-2 和 bax一抗 , 去
20 μl二抗加入 200 μl细胞温浴 30 m in,上流式细胞仪检测。
1. 3 统计学处理
  两组间数据用 t检验 ,多组间数据用单因素方差分析。应
用 SPSS 11. 5 统计软件计算。 采用改良 Karbe r公式计算
IC
50
[ 3] 。
2 结果
2. 1 Dau对 T-24细胞株增殖作用的影响
  表 1结果显示 , 与阴性对照比较 , 浓度为 3. 75 μg /m l以上
的 Dau对 T-24肿瘤细胞有较强的抑制作用 , 敏感的最低药物
浓度为:1. 88 μg /m l。并有良好的量效关系 , 随着药物浓度的
升高抑制率逐渐升高 。但其作用无明显的时间依赖性 , 随着时
间延长抑制率总体逐渐升高 ,在低浓度时随着时间延长抑制率
反有降低。 24、48、72 h时 IC50分别为 6. 9、7. 7、5. 1 μg /m l。
表 1 Dau对 T-24肿瘤细胞增殖作用的影响( x±s, %)
吸光度值药物组别
24 h 48 h 72 h
阴性对照组 0. 43±0. 02 0. 92±0. 06 1. 11±0. 02
顺铂 0. 26±0. 01a 0. 31±0. 03a 0. 26±0. 04a
羟基喜树碱 0. 30±0. 02a 0. 41±0. 02a 0. 27±0. 01a
蝙蝠葛碱 (μg /m l)
    60 0. 07±0. 01a 0. 07±0. 01a 0. 09±0. 01a
    30 0. 12±0. 01a 0. 12±0. 01a 0. 11±0. 01a
    15 0. 16±0. 01a 0. 22±0. 03a 0. 19±0. 01a
     7. 5 0. 18±0. 01a 0. 40±0. 03a 0. 47±0. 01a
     3. 75 0. 24±0. 02a 0. 72±0. 02b 0. 70±0. 02a
     1. 88 0. 33±0. 02b 0. 80±0. 01 0. 84±0. 02b
     0. 94 0. 36±0. 02 0. 90±0. 02 0. 95±0. 02
     0. 47 0. 42±0. 02 0. 90±0. 03 1. 04±0. 06
a:P <0. 01,与阴性对照组比较;b:P <0. 05,与阴性对照组比较
2. 2 荧光显微镜细胞形态观察
  AO / EB染色后, 30μg /m l Dau处理 48 h的人膀胱移行细胞
癌细胞株 T-24呈现出凋亡细胞形态:体积缩小 ,细胞质浓缩 ,细胞
核 DNA发出橙色荧光, 细胞核边缘不规则, 出现核固缩 、核碎裂
等 ,呈大小不等 、形态不规则的碎片状;而对照组细胞核近圆形 ,边
缘清晰 ,染色均匀,未见有明显凋亡细胞形态特征。见图 1。
A:0μg /m l组正常细胞;B:30μg /m l组核固缩;C:30μg /m l
组 核裂解
图 1 Dau处理前后的 T-24细胞核形态变化 (荧光显微镜 ×400)
1861  
2. 3 凋亡细胞的 DNA凝胶电泳
  对照组细胞 DNA凝胶电泳后 , 在加样孔附近有一条清晰
的条带 , 而 30 μg /m l Dau处理 72 h的细胞 DNA凝胶电泳后 ,
则出现较典型的梯状电泳模式。如图 2。
1:未处理的 T-24细胞;2:30 μg /m l Dau处理 72 h后的 T-24细
胞;3:5μg /m l Dau处理 72 h后的 T-24细胞;M:标准
图 2 T-24细胞 DNA凝胶电泳
2. 4 Dau对 T-24细胞凋亡率的影响
  经流式细胞仪分析 ,随 Dau剂量的增加 , 凋亡细胞数明显
增加 , 呈剂量依赖关系。低浓度 Dau(1 μg /m l)作用于 T-24细
胞 24、 48、 72 h的细胞凋亡率与空白对照无显著差异 (P >
0. 05)。中浓度 Dau(5μg /m l)作用于细胞 72 h,细胞凋亡率显
著增加(P <0. 01)。高浓度 Dau(30μg /m l)作用于细胞 24 h即
可使细胞凋亡率增加 , 随时间的延长 , 凋亡率进一步增加 , 可达
34. 66%, 但高浓度组 72 h比 48 h略有下降 , 但无显著差异(P
>0. 05)。见表 2。
表 2 不同浓度 Dau处理后的 T-24细胞凋亡率( x±s, %)
Dau浓度(μg /m l)组别
0 1 5 30
24 h 2. 52±1. 05 2. 94±0. 12 5. 04±1. 25a 11. 07±1. 53a
48 h 2. 66±0. 96 2. 53±0. 64 4. 72±1. 68a 34. 66±0. 35a
72 h 1. 81±0. 06 2. 58±0. 58 16. 63±1. 04a 32. 72±1. 83a
a:P <0. 01,与 0μg /m l组比较
2. 5 Dau对 T-24细胞周期的作用
  Dau作用 72 h后 ,经流式细胞仪分析 ,未经药物作用的对
照组 G 0 /G 1期 、S期 和 G2 M/ 期细胞分别为 46. 9% 、40. 2%、
12. 9%;30 μg /m lDau处理 72 h的人膀胱移行细胞癌细胞 ,在
G0 /G 1期 、 S期 和 G 2 M/ 期的细胞分别为 60. 9%、 29. 2%、
9. 9%。与对照组比较 , 差异显著 (P <0. 01)。可见在高浓度
Dau作用下 , G
0
/G
1
期细胞明显增多 , S期细胞比率下降 , 多数
细胞阻滞在 G 0 /G1期。
2. 6 Dau对 T-24细胞 bcl-2和 bax基因的表达的影响
  用流式细胞仪测定了 Dau处理 T-24细胞 72 h后的 bcl-2
和 bax基因的表达量。未经药物作用的细胞 bcl-2基因表达量
为 20. 8±0. 23, 而 5μg /m l以及 30 μg /m lDau处理的细胞 bcl-
2基因表达量分别 7. 7±0. 25和 6. 8±0. 17, 表达量下降 , 与未
处理组比较 , 两浓度组均有非常显著性差异(P <0.01);未经药
物作用的细胞 bax基因表达量为 1. 0±0. 32, 而 5 μg /m l以及
30 μg /m l Dau处理 72 h的 T-24细胞 bax基因表达量分别为 5. 1
±0. 29和 6. 6±0. 31, 表达量明显增加 ,与未处理组比较 ,两浓度
组均有非常显著性差异(P <0.01)。
3 讨论
  北豆根始载于《中国药植志》,主要作用是抑菌消
炎 、镇咳祛痰 、肌松和抗心率失常等。可用于治疗气管
炎等 ,现已有成药北豆根片问世。各书籍杂志多述及
北豆根的抑菌作用 、降压作用及抗心率失常作用等。
近年有北豆根抗肿瘤作用报道[ 4] ,以及北豆根的有效
成分之一 Dau的逆转肿瘤多药耐药的 [ 2, 5]相关报道 ,
但数量较少。本研究首先使用膀胱移行细胞癌 T-24
细胞株对 Dau进行体外抑瘤实验 ,结果表明 Dau有明
显的抑制细胞株增殖反应的作用 ,具有明显的量效关
系 , 24、48、72 h时 IC50分别为 6. 9、7. 7、5. 1 μg /m l,说
明 Dau对 T-24细胞具有较强的体外增殖抑制作用。
  细胞凋亡对于肿瘤的发生和生长有负调控作用 ,
对肿瘤细胞凋亡的诱导率已成为评价抗肿瘤药物疗效
的指标 [ 6] 。我们利用不同方法对 Dau作用后细胞的
形态学改变进行了观察 ,荧光显微镜可见到明显的细
胞凋亡形态变化:胞体缩小 ,细胞质浓缩 ,核固缩 ,核碎
裂以及荧光亢进等。细胞凋亡是从细胞核开始的 ,当
细胞凋亡时 ,细胞核内限制性内切酶活化 ,活化了的内
切核酸酶将 DNA链在核小体之间切口 ,使核内 DNA
断裂 ,形成 180 ~ 200 bp整倍数的核酸片段 ,从而使琼
脂糖凝胶电泳呈现的凋亡梯形图 。提示 Dau的抗肿
瘤作用可能与细胞凋亡有关。
  我们用流式细胞仪测定了 Dau对细胞凋亡率及
对细胞周期的影响 , DNA直方图上可见 G1期峰前显
现明显的细胞凋亡峰亚 G1期峰。流式细胞仪计数显
示 30 μg /m lDau处理 72 h诱导膀胱癌细胞凋亡率可
达 32. 72%。G 1期又称 DNA复制前期 ,可产生 rRNA、
mRNA及 tRNA核蛋白体 [ 7] ,同时为细胞进入 S期做
各种准备 ,如合成 DNA合成诱导物以及 DNA复制所
需的各种前体和酶等 ,本实验表明 D au能明显抑制 T-
24细胞的周期转换 ,高浓度 Dau使细胞大量堆积在
G 0 /G 1期 ,抑制 DNA合成 ,进而抑制癌细胞的增殖 ,这
是其抗肿瘤的又一机制。
  bcl-2基因家族是细胞凋亡的关键性调节者 ,作为
抑制凋亡基因的 bcl-2高表达 ,可提高细胞凋亡阈值 ,
抑制细胞凋亡 ,延长细胞存活;而 bax具有相反的作
用 。本研究结果显示 , Dau作用于 T-24细胞 ,使 bcl-2
表达受抑 ,而上调 bax基因的表达 ,提示 Dau影响了细
1862              第 三  军 医 大  学 学 报             第 28卷
胞相关基因的表达。
  本实验虽然证实诱导凋亡是 Dau抗肿瘤作用的
机制之一。但体外实验 30 μg /m l Dau作用 72 h抑制
率可达 95%,而凋亡率仅为 32. 72%,表明 Dau存在对
药物的直接的细胞毒作用及其他机制 。细胞死亡有两
种形式:坏死和凋亡。坏死多由强烈的外来刺激引起 ,
坏死机制多种多样 ,如胞体内外离子失衡 、细胞器中毒
等 。同其他生物碱相似 , Dau对肿瘤具有较强的细胞
毒作用 [ 8] ,其作用机制有待进一步探讨 。
  在我国 ,膀胱癌是泌尿系统中发病率最高的恶性
肿瘤 ,且极易复发 ,并对大多数的一线化疗药物不敏
感 。作为术后化疗膀胱灌注的有 5-氟尿嘧啶 ,表阿霉
素 ,丝裂霉素 ,喜树碱类等 ,也有卡介苗等生物免疫制
剂 。但不同生物特性的膀胱肿瘤对这些药物有着天然
的及获得的抗药性 ,单一的治疗常不能控制其复发。
因此需要更多的可选择药物 ,尤其是低毒高效的中药
提取物 ,是目前世界上肿瘤治疗的发展趋势 ,也是我国
制药领域的优先发展项目 。北豆根作为抗肿瘤药物有
待进一步开发 ,其作用机制有待进一步研究。
参考文献:
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(编辑 栾 嘉)
文章编号:1000-5404(2006)18-1863-01 个案与短篇
AO微型钢板螺钉与克氏针治疗掌指骨骨折的比较研究
史宗新 ,孟祥才 ,丛云海 ,晋合成 ,林 飞 ,龚子顺  (北京市房山区良乡医院骨科 ,北京 102401)
  掌 、指骨骨折是手部常见损伤 , 收集本科 2003年 2月至
2005年 7月患者 56例 , 采用了 AO微型钢板螺钉内固定治疗 ,
疗效满意 , 现将本组病例与以往克氏针固定的 1组病例进行比
较。
1 资料与方法
1. 1 一般资料
  AO钢板螺钉固定组:56例 78处骨折 , 男性 42例 , 女性 14
例 , 年龄 16 ~ 54岁 ,平均 33. 6岁。闭合性骨折 55处 ,开放性骨
折 23处。克氏针固定组:64例 87处;男性 45例 , 女性 19例 ,
年龄 16~ 71岁 , 平均 36. 5岁。闭合性骨折 33处 , 开放性骨折
54处。
1. 2 研究方法
  术后随访时 , 记录关节功能 、骨折愈合时间及感染 3项指
标。关节功能按 TAFS标准评定 [ 1] 。
  作者简介:史宗新(1966 -),男 ,北京市房山区人 ,副主任医师 ,主要从事骨
科创伤方面的研究 ,发表论文 5篇。电话:(010)69351080-8108
  收稿日期:2005-12-06;修回日期:2006-07-17
2 结果
  AO微型钢板螺钉固定组平均随访 5. 5个月。根据 TAFS
评分 , 优良率 88. 5%。骨折愈合时间平均 5. 2周 。闭合性骨折
无感染 , 开放性骨折 3处感染。
  克氏针固定组随访时间 4 ~ 15个月。按 TAFS评分 , 优良
率为 71. 3%, 平均骨折愈合时间为 8. 1周。闭合性骨折 2例针
道感染 , 开放性骨折中 9处发生感染。
3 讨论
  AO微型钢板螺钉内固定治疗掌 、指骨骨折 ,提供了骨折端
的直接接触 , 牢固固定 ,可缩短骨折愈合时间 , 有利于手部功能
的恢复。生物力学的研究结果表明 [ 2, 3]:AO微型钢板固定手部
骨折在表面刚度 、稳定性和压力方面优于其他固定方法。劳杰
等 [ 4]报道 AO微型钢板内固定治疗手部骨折 ,使骨折愈合时间
比传统的内固定提早 2 ~ 4周。
  1枚克氏针固定骨折防旋作用不够 , 两枚交叉克氏针却倾
向于使骨折断端分离 , 不利于骨折的愈合。克氏针常常于临近
关节两侧穿出 , 阻挡伸指装置的滑动 , 影响关节的活动。
  (下转 1866页)
1863
第 28卷第 18期
2006年 9月    
第 三 军 医 大 学 学 报
ACTA ACADEM IAE MED IC INAE M IL ITARIS TERTIAE   
Vo .l 28, No. 18
Sep. 2006