全 文 ：本题为全军医药卫生科研基金资助项目(后科 85-01673)
作者单位:524023　湛江 , 广东医学院肿瘤研究所生理教研室
(黄培春 、邓惠华 、赵明伦);第一军医大学中西医结合研究室(于留
荣 、黄添友)
·论著·
中药复方“冬夏丸”体外抑制 Epstein-Barr
病毒抗原表达的研究
黄培春　邓惠华　赵明伦　于留荣　黄添友
　　【摘要】　目的　研究中药复方“冬夏丸”体外对 Epstein-Barr病毒(EBV)抗原表达的影响。方法应
用细胞培养和间接免疫酶技术。结果　20～ 80μg/ml中药复方“冬夏丸”与靶细胞共培养能显著的抑
制巴豆油和正丁酸联合诱发 Raji细胞的 EBV早期抗原(EBV-EA)和 B95-8 细胞的 EBV 壳抗原(EBV-
VCA)表达及 B95-8细胞的 EBV-VCA 自然表达 , 抑制率分别是 19.31%～ 49.84%, 34.63%～ 45.61%和
21.67%～ 47.78%。用该药预处理 Raji和 B95-8 细胞亦能显著地抑制巴豆油和正丁酸联合诱发 EBV-
EA和 VCA的表达。结论　中药复方“冬夏丸”具有明显抑制 EBV抗原表达的作用 , 有可能用于 EBV
相关疾病的防治。
【主题词】　疱疹病毒 4型 , 人;　抗原 , 病毒;　中草药;　冬夏丸
Inhibition of the expression of Epstein-Barr virus antigens in vitro by Chinese medicine compound“Dongxia
wan” 　HUANGPeichun , DEN Huihua , ZHAO Minglun , et al.Institute of Oncology , Guangdong Medical Col-
lege , Zhanjiang 524023 , China
【Abstract】　Objective　To investigate the effect of Chinese medicine “ Dongxia wan” on the expression of
Epstein-Barr virus (EBV)antigens in vitro.Methods　Cell culture and indirect immunoenzyme methods were
used.Results　When Raji and B95-8 cells were cultured with 20-80 μg/ml of “ Dongxia wan” , the expression of
EBV early antigen(EBV-EA)and EBV capsid antigen(EBV-VCA)induced by croton oil and n-butyric acid and
the natural expression of EBV-VCA were all inhibited significantly.The inhibition rates were 19.3%-49.84%,
34.63%-45.61% and 21.67%-47.78% respectively.When Raji and B95-8 cells were pretreated with
“ Dongxia wan” the expression of EBV-EA and EBV-VCA were also inhibited obviously.Conclusion　Chinese
medicine “ Dongxia wan” can inhibit the expression of EBV antigens in target cells , it may be used to the preven-
tion and treatment of EBV-related diseases.
【Key words】　Herpesvirus 4 , human;　Antigens , viral;　Chinese herbal medicine;　Dongxia wan
　　大量研究已表明 , EB 病毒与鼻咽癌(Nasopha-
ryngeal carcinoma , NPC)关系密切 ,因此人们已开始
探讨通过抗 EBV的途径对 NPC 进行综合防治[ 1 , 2] 。
我们过去的研究发现一些具有抑制 NPC细胞生长
和EBV早期抗原(EBV-EA)表达的中草药和海洋生
物[ 3 ,4] 。在此基础上 ,将这些中草药和海洋生物与
能增强机体免疫功能的中草药制成复方制剂“冬夏
丸” ,拟用于 NPC 的防治。我们选用携带 EBV 基因
组的两种类淋巴母细胞株 Raji和 B95-8细胞为靶细
胞 ,探讨中药复方“冬夏丸”对 EBV 抗原表达的影
响 ,为该药进一步用于 NPC的临床防治提供依据。
1　材料和方法
1.1　药物　中药复方“冬夏丸”由冬夏草 、山豆根 、
板兰根 、黄芪等十多种中草药和海洋生物组成 ,经酒
精和水提取法提取出水溶性有效成分 ,每6 g生药提
取出有效成分1 g 。实验前用生理盐水将有效成分配
制成10 mg/ml溶液 ,过滤除菌 ,置 4℃冰箱备用 。
1.2　EBV抗原激发剂　采用巴豆油和正丁酸作为
EBV抗原表达的激发剂。巴豆油溶于无水乙醇配成
100 mg/ml ,再用 RPMI 1640 液配成 5×104 ng/ml巴
豆油液 ,置 4℃冰箱备用 。80 mmol/L正丁酸溶液系
用 RPMI 1640液配制 ,过滤除菌后分装置-20℃备
用 。
1.3　细胞　携带 EBV基因组的 Raji和 B95-8细胞
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株作为药物作用于病毒的靶细胞 ,在无激发剂作用
时 ,Raji细胞的 EBV基因不表达早期抗原(EA)和壳
抗原(VCA),B95-8细胞仅表达少量 CVA ,但在激发
剂作用下 , Raji和 B95-8细胞可分别大量表达 EA 和
VCA 。两种细胞均用含 15%灭活小牛血清(杭州四
季青生物工程材料研究所产品)和青 、链霉素的 RP-
MI 1640(GIBCO 公司产品)常规培养 , 末次传代后
24 h检查活细胞达 90%以上时用于实验 。
1.4　实验方法　将细胞用培养液调整细胞浓度为
6×105/ml ,按下述各组实验要求与不同浓度药物作
用 ,置 37℃培养 ,并按实验要求取样检测 。每组实
验均设空白对照 ,重复 6 ～ 8次 ,取平均值。
1.4.1　细胞毒性实验　将 Raji 和 B95-8细胞分别
与不同浓度药物共同培养48 h ,用台盼蓝染料排斥
法 ,计算死活细胞数 ,求得细胞存活百分率 ,以确定
无细胞毒性的药物浓度。
1.4.2　药物共培养实验　分别将不同浓度(均为无
细胞毒性浓度)药物加入 2种细胞中 ,并分别加入巴
豆油和正丁酸溶液 ,最终浓度分别为 5×102 ng/ml
和4 mmol/L ,培养48 h , 收获细胞检测 EBV 抗原表
达。由于 B95-8细胞不经激发剂激发也有少数细胞
表达VCA ,故另设一不加巴豆油和正丁酸组。
1.4.3　药物预处理实验　先将不同浓度药物加入
细胞中培养24 h ,离心去上清 ,再用培养液洗细胞一
次以去除药物 ,再加入巴豆油和正丁酸溶液 , 培养
48 h ,收获细胞检测 EBV抗原表达 。
1.4.4　EBV抗原表达的检测　收获药物共培养和
预处理的各组实验细胞涂片 ,冷丙酮固定 。选用 EA
-IgA≥1∶40 ,VCA-IgA≥1∶160的多个 NPC血清混
合作为抗 EBV 抗原的抗体 ,用间接免疫酶法检测
Raji细胞的EA和B95-8细胞的VCA阳性细胞 ,每份
标本计数 400个细胞 ,计算抗原阳性细胞百分率及
抗原表达抑制率 。
1.5　统计分析　采用电脑 POMS系统方差分析。
2　结果
2.1　中药复方“冬夏丸”对 Raji 和 B95-8细胞的无
细胞毒性浓度测定　从表 1 可见 ,中药复方“冬夏
丸”浓度≤160μg/ml和≤80μg/ml时分别对 Raji和
B95-8细胞48 h的生长无明显影响 ,故以低于此浓度
作为无细胞毒性浓度进行该两种细胞的 EBV 抗原
表达抑制实验。
2.2　中药复方“冬夏丸”对 Raji细胞 EBV-EA 表达
的抑制作用　20 ～ 80μg/ml中药复方“冬夏丸”与
Raji细胞共培养48 h能明显地抑制巴豆油与正丁酸
联合诱发 Raji细胞表达 EBV-EA ,预处理24 h后去除
药物再培养对 EBV-EA诱发表达的抑制作用似乎更
强 ,抑制效果均随药物浓度的增加而加强(表 2)。
2.3　中药复方“冬夏丸”对 B95-8 细胞 EBV-VCA表
达的抑制作用　表 3所示 , 20 ～ 80μg/ml中药复方
“冬夏丸”与 B95-8细胞共培养或预处理均可明显地
抑制巴豆油和正丁酸联合诱发 B95-8细胞的 EBV-
VCA表达 ,与 B95-8细胞共培养48 h也能明显地抑
制 EBV-VCA 的自然表达 ,三种情况下的抑制率相
似 ,且抑制率均随药物浓度的增加而增高 。
3　讨论
Raji和 B95-8细胞株均为带 EBV基因组的类淋
巴母细胞株 。Raji细胞来源于 Burkitt淋巴瘤 ,在自
然状态下 ,仅表达 EBV核抗原(EBNA),只有在促癌
物或致癌物激发下才表达 EBV-EA 。B95-8 细胞为
产转化性 EBV的细胞株 ,自然状态下只有少数细胞
表达VCA ,但在激发剂作用下 ,可大量产生 EBV及
表达VCA等病毒抗原 。本实验结果表明 ,无细胞毒
性浓度的中药复方“冬夏丸”与细胞共培养48 h ,能
有效地降低促癌物巴豆油及正丁酸联合激发下的
表 1　中药复方“冬夏丸”对 Raji和 B95-8细胞的无毒性浓度测定
Tab.1　Test of non-cytotoxic doses of Chinese medicine compound “Dongxia wan” to Raji and B95-8 cells
细胞
Cell
药物不同浓度(μg/ml)下的细胞存活率( x±s)
Cell survived under the different concentrations(μg/ml)of the “Dongxia wan”( x ±s)
对照
Control
20 40 80 160 320
Raji(n=6) 86.50±1.95 86.58±4.20＊ 84.92±2.54＊ 82.33±3.40＊ 74.17±4.65＊＊
B95-8(n=8) 92.5±1.77 92.88±2.36＊ 91.13±2.70＊ 90.37±4.10＊ 81.34±9.23＊＊
　　注:与对照组比较 , ＊ P>0.05;＊＊ P<0.01
　　Notes:Compared with the control group , ＊ P>0.05;＊＊ P<0.01
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表 2　中药复方“冬夏丸”对 Raji细胞 EBV-EA表达的抑制作用(n=6)
Tab.2　The inhibitive effect of Chinese medicine compound “ Dongxia wan” on expression
of EBV-EA in Raji cells( x±s)
组别
Group
药物不同浓度(μg/ml)下的 EBV-EA阳性率( x±s)
The positive rate of EBV-EA( x±s)under different concentration of the medicine(μg/ml)
对照
Control
20 40 80
共培养(Co-culture) 16.05±1.27 12.95±2.12＊(19.31) 10.78±0.79＊＊(32.83) 8.05±2.24＊＊(49.84)
预处理(Pret reatment) 13.47±1.68 8.58±1.02＊＊(36.30) 6.17±0.68＊＊(54.19) 5.83±1.17＊＊(56.71)
　　注:与对照组比较(Compared with control group), ＊P<0.05 , ＊＊P<0.01
表 3　中药复方“冬夏丸”对 B95-8 细胞 EBV-VCA表达的抑制作用(n=6)
Tab.3　The inhibitive effect of Chinese medicine compound “ Dongxia wan” on expression of EBV-VCA in B95-8 cells
组别
Group
药物不同浓度(μg/ml)下的 EBV-EA阳性率( x ±s)
The positive rate of EBV-EA( x±s)under different concentration of the medicine(μg/ml)
对照
Control
20 40 80
激活共培养(Co-culture) 34.16±3.49 22.33±2.42＊＊(34.63) 20.00±1.41＊＊(41.45) 18.58±2.01＊＊(45.61)
激活预处理(Pretreatment) 25.17±2.50 17.42±3.36＊＊(30.79) 16.33±2.89＊＊(35.12) 14.91±1.43＊＊(40.78)
不激活共培养(Co-culture) 3.83±0.52 3.00±1.30(21.67) 2.23±0.94＊(41.78) 2.00±0.63＊(47.78)
　　注:与对照组比较(Compared with control group), ＊P<0.05 , ＊＊P<0.01
Raji细胞的 EBV-EA和 B95-8细胞的 EBV-VCA的阳
性率 ,表明中药复方“冬夏丸”对激活的 EBV抗原表
达有较强的抑制作用 。用中药复方“冬夏丸”预处理
Raji和 B95-8 细胞24 h ,去除药物后再培养48 h ,同
样的药物浓度对 EBV-EA 和 VCA 的表达同样具有
较强的抑制效应 ,同一药物浓度也能降低 B95-8 细
胞无诱发状态下的 EBV-VCA 表达 ,提示复方“冬夏
丸”对 EBV抗原表达的抑制效应并非通过拮抗诱发
剂起作用 ,而可能是直接抑制 EBV抗原的表达 。
现已清楚 , EBV感染细胞有产病毒性感染和非
产病毒性感染两种类型 ,后者在某些激发剂(巴豆油
等)作用下也产病毒 。细胞内 EBV复制过程中可合
成包括 EA和VCA在内的一系列病毒抗原。病毒一
旦合成 EA后 ,随即进行 DNA复制和VCA 的合成并
释放病毒[ 5] 。因此 ,中药复方“冬夏丸”抑制EBV-EA
和VCA的表达 ,提示其可抑制 EBV 在细胞内的繁
殖。EBV是否是 NPC的原因虽尚不能确定 ,但大量
的研究已证实 EBV 与 NPC关系密切 。NPC 患者血
清中VCA-IgA和EA-IgA滴度增高 ,而血清中EBV相
关抗体增高者的 NPC发病率明显增高 ,这表明体内
EBV繁殖活跃与 NPC 发生发展密切相关[ 6] 。本实
验结果提示中药复方“冬夏丸”有较强的抑制 EBV
繁殖作用 ,我们在另一些研究中也证实该药具有抑
制包括NPC 细胞在内的多种肿瘤细胞的生长和降
低人体内 VCA-IgA 及提高机体细胞免疫功能等作
用[ 7] 。这提示该药很可能在干预 NPC 等 EBV相关
疾病的发生发展中起一定作用 ,值得进一步研究 。
参 考 文 献
1 曾毅 ,周海媚 ,徐世平.维生素甲衍生物对 EB病毒早期抗原诱
发的抑制作用.中国医学科学院学报 , 1982 ,4:251-253.
2 罗慧玲 ,吴荫棠 ,李满枝 ,等.Ge-132抑制 Epstein-Barr病毒抗原表
达的研究.癌症 ,1994 , 13:421-423.
3 赵明伦 ,罗晨美 ,龙发 ,等.人低分化上皮细胞系生长能力检测
和中草药及海洋生物的反应.中华肿瘤杂志 , 1988, 10:98-101.
4 邓惠华 ,赵明伦 ,黄培春.某些中草药和海洋生物对 EB病毒早
期抗原的诱发和抑制作用.湛江医学院学报 , 1990, 8:164-168.
5 李振权 ,潘启超 ,陈剑经 ,主编.鼻咽癌临床与实验研究.广东:
广东科技出版社 , 1983, 99-101.
6 黄培春 ,余忠华 ,赵明伦.粤西地区 EB病毒与鼻咽癌关系的前
瞻性观察.广东医学院学报 , 1994 , 12:187-189.
7 黄培春 ,陈锦 ,赵明伦 ,等.中药复方“冬夏丸”对 EB病毒感染者
的疗效及免疫功能的影响.中国免疫学杂志 , 1995 , 11(增刊):
581-584.
(收稿日期:1999-08-30)
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