全 文 ：收稿日期:2013－04－04．
基金项目:湖北省自然科学基金创新群体项目(2009CDA115) ;湖北省研究与开发计划项目(2011BBB061)．
作者简介:肖浩(1986－ ) ，男，硕士研究生，主要从事野生植物资源保护与利用的研究;* 通信作者:郑小江(1958－ ) ，男，教授，硕士生导师，主
要从事野生植物资源保护与利用．
响应面法优化发酵藤茶黄酮和多糖的提取工艺
肖 浩1，2，郑小江2*
( 1．湖北省恩施州农业科学院，湖北 恩施 445000;
2．湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)
摘要:根据单因素试验的结果，采用响应面分析法优化藤茶黄酮和多糖的提取工艺．结果表明:最佳提取工艺条件为
提取温度 96℃，时间 1．6 h，料液比 1 ∶ 21．在此优化工艺条件下，总黄酮和多糖的提取得率分别为 22．94%和 2．13%．
藤茶黄酮和多糖的优化提取工艺有利于藤茶资源的综合开发利用．
关键词:发酵藤茶;黄酮;多糖;响应面;优化提取
中图分类号:Q539 文献标志码:A 文章编号:1008－8423(2013)02－0132－06
Optimization of Extraction Process for Flavonoids and Polysaccharides
from Fermented Ampelopsis grossedentata
XIAO Hao1，2，ZHENG Xiao－jiang2*
(1．Academy of Agricultural Sciences of Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture，Enshi 445000，China;
2．School of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China)
Abstract:On the basis of single－factor tests，response surface analysis (ＲSA)was used to optimize the
extraction process of flavonoids and polysaccharides from fermented Ampelopsis grossedentata． The optimal
conditions were as follows:extraction temperature was 96℃，extraction time was 1．6 h and solid－liquid
ratio was 1 ∶ 21．Under these optimal conditions，the extraction rates of total flavonoids and polysaccha-
rides were 22．49% and 2. 03%，respectively．This optimal extraction process for total flavonoids and poly-
saccharides from fermented Ampelopsis grossedentata will benefit the comprehensive development and utili-
zation of Ampelopsis grossedentata．
Key words:fermented Ampelopsis grossedentata;flavonoids;polysaccharides;response surface analysis;
optimal extraction
藤茶为葡萄科(Vitaceae)蛇葡萄属(Ampelopsis Michaux)显齿蛇葡萄，学名为 Ampelopsis grossedentata
(Hand－Mazz)W．T． Wang，是一种野生木质攀援藤本植物，俗称山甜茶、白茶、甘露茶、白毛猴、龙须茶、茅岩
莓茶等，主要分布于我国长江流域的湖南、湖北、云南、贵州、广东、广西、福建等地［1－4］．研究表明，藤茶中含有
黄酮、多糖、多酚、蛋白质、氨基酸等多种活性成分，其中最主要的活性成分是以二氢杨梅素为主的黄酮类物
质［5－7］．经大量药理学试验证明，二氢杨梅素具有消炎镇痛、祛痰止咳、降血脂、抗氧化、保肝护肝、增强免疫
力、抗癌等药理功效［8－16］．同时藤茶多糖也具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等功能，具有较高的开发利用价
值［17－19］．近年来，已有许多学者开展了从藤茶中提取黄酮和多糖的研究，通常是以有机溶剂提取藤茶黄酮，
如乙醇、甲醇等［20］．这种方法提取成本高，回收溶剂的能耗高，还存在费时、重现性差、对设备要求高等不足
之处．而且所用溶剂通常有毒或易燃易爆，易对环境和操作人员造成危害．超临界萃取藤茶黄酮虽具有节省
试剂，无污染等优点，但为了获得超临界条件，设备一次性投资较大，运行成本高，回收率较差．此外，还有大
孔树脂吸附法、微波萃取法、逆流法、超声波辅助溶剂提取法等［21－22］，均存在投资成本高、操作复杂等缺点．
本课题组通过对藤茶黄酮的研究发现，二氢杨梅素其中的主要成分，在热水和冷水中的溶解度差别很大，因
此可用热水作为提取剂．同时，用热水提取还可以增加藤茶多糖的溶出，同时得到黄酮和多糖，具有其他方法
无法比拟的优势．本文以发酵型藤茶加工后的边角料为试验材料，采用热水浸提法，优化提取藤茶中的黄酮
第 31卷第 2期 湖北民族学院学报(自然科学版) Vol．31 No．2
2013年 6月 Journal of Hubei University for Nationalities(Natural Science Edition) Jun．2013
和多糖，然后分离纯化，得到黄酮和多糖两类活性成分．该方法工艺简单，成本低，提取得率较高，环保，适合
工业化连续生产，可为藤茶有效成分的综合开发利用提供技术支持．
1 材料与设备
1．1 试验材料
“白露”发酵型藤茶加工后的边角料，于 60℃鼓风干燥箱中烘干，粉碎，过 60 目筛，石油醚脱脂，保存备
用．
1．2 主要仪器与设备
UV1100紫外－可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司) ;GXZ－9140 数显鼓风干燥箱(海博讯实业有
限公司医疗设备厂) ;FA10048B电子天平(上海精密科学仪器有限公司) ;DFY－500 摇摆式高速中药粉碎机
(温岭市林大机械有限公司)．
2 试验方法
2．1 浸提指标测定方法
2．1．1 总黄酮含量测定 标准曲线［23］:称取二氢杨梅素对照品 5 mg，置于 50 mL容量瓶中，用 70%乙醇定容
至 50 mL，配制成 100μg /mL的溶液．吸取上述标准溶液 0、0．5、1．0、1．5、2．0和 2．5 mL，分别置于 10 mL容量瓶
中，用 70%乙醇定容至刻度，在 292 nm下测定吸收度，以对照品的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘
制标准曲线，得标准曲线方程 y= 0．038 3x+0．009 1，Ｒ2 = 0．999 3．样品测定方法同标准曲线．
2．1．2 多糖含量测定 标准曲线［24］:精密称定干燥至恒重的葡萄糖对照品 10 mg，用蒸馏水溶解并定容至
100 mL容量瓶中，配成 0．1 mg /mL的标准溶液．分别吸取标准液 0、0．2、0．4、0．6、0．8和 1．0 mL置 10mL具塞试
管中，各加入蒸馏水补充至 1 mL，加入 0．2%硫酸－蒽酮试液 4 mL摇匀，浸于冰水浴中冷却，然后移至沸水浴
中加热 10 min，取出用冷水冷却至室温，室温放置 10 min左右，于 620 nm处测定吸光度，得标准曲线方程 y =
0. 031 7x－0．001 2，Ｒ2 = 0．999 3．样品测定方法同标准曲线．
2．2 单因素试验
准确称取经石油醚脱脂的藤茶叶粗粉 1．0 g，加入一定量去离子水，在一定温度下于水浴锅内提取一定
时间，离心，将提取液用水定容至 25 mL．然后从中分别取 0．2 mL参与反应，测定其中的黄酮含量．另外从中取
5 mL于离心管中，加入 4倍体积的无水乙醇，静置过夜，离心，将沉淀用水溶解并定容至 100 mL，从中取 1 mL
溶液参与反应，测定其中的多糖含量．以不同的浸提温度(55、65、75、85、95℃)、浸提时间(1．0、1．5、2．0、2．5、
3. 0 h)、料液比(1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30)为单因素，考察各单因素对藤茶总黄酮和多糖提取得率
的影响．
2．3 响应面分析
根据单因素试验结果，采用 Box－behnken设计试验方法对浸提温度、浸提时间、料液比 3个因素(分别以
A、B、C代码表示)的低、中、高三个试验水平分别以－1、0、1进行因素编码，通过响应面分析法对提取条件进
行优化．
3 结果与讨论
3．1 单因素浸提效果分析
3．1．1 浸提温度对提取率的影响 设定料液比 1 ∶ 20，提取时间为 2 h，提取 1次(下同) ，不同浸提温度下的
总黄酮和多糖提取得率如图 1所示．随着提取温度的升高，总黄酮和多糖的提取得率逐渐增加．因提取的温
度越高，溶出的杂质也越多，且 85℃以上的高温对藤茶黄酮的结构和活性有一定的影响，综合考虑提取成本
及黄酮成分的稳定性，选择 85℃为最合适提取温度．
3．1．2 浸提时间对提取率的影响 设定料液比 1 ∶ 20，提取温度为 85℃，不同浸提时间下的总黄酮和多糖提
取得率如图 2所示．随着浸提时间的延长而总黄酮与多糖含量增加，但增加的幅度不大．当浸提时间达到 2．5h
后，虽然多糖提取得率增大，但黄酮提取得率开始下降，可能是提取时间的延长增加了杂质的溶出量，或者是黄
酮成分结构发生了变化．另外，提取时间的延长降低了生产的效率．综合考虑，选择 2．5 h为最佳的提取时间．
331第 2期 肖 浩等:响应面法优化发酵藤茶黄酮和多糖的提取工艺
图 1 提取温度对总黄酮与多糖提取得率的影响 图 2 提取时间对总黄酮与多糖提取得率的影响
Fig．1 The effect of extraction temperature on the extraction
ratesof total flavonoids and polysaccharides
Fig．2 The effect of extraction time on the extraction
rates of total flavonoids and polysaccharides
图 3 液料比对总黄酮与多糖提取得率的影响
Fig．3 The effect of solid－liquid ratio on the
extraction rates of total flavonoids and polysaccharides
表 3 方差分析表—总黄酮提取得率
Tab．3 ANOVA for the content of total flavonoids
方差
来源 平方和
自由
度 均方 F值 P值 显著性
Model 7．10 9 0．79 18．64 0．0025 ＊＊
A 0．090 1 0．090 2．14 0．2038
B 0．22 1 0．22 5．23 0．0710
C 4．93 1 4．93 116．56 0．0001 ＊＊
AB 0．41 1 0．41 9．68 0．0265 *
AC 0．14 1 0．14 3．32 0．1278
BC 0．70 1 0．70 16．48 0．0097 ＊＊
A2 0．34 1 0．34 8．12 0．0358 *
B2 0．021 1 0．021 0．49 0．5147
C2 0．31 1 0．31 7．22 0．0435 *
残差 0．21 5 0．042
失拟项 0．17 3 0．055 2．41 0．3066
纯误差 0．046 2 0．023
总和 7．31 14
相关
系数 0．9711
校正决
定系数 0．9190
变异
系数 0．92
3．1．3 液料比对提取率的影响 设定提取温度为 85℃，提取时
间为 2．5 h，不同液料比下总黄酮和多糖提取得率如图 3 所示．从
图 2－3可以看出，随着液料比的增加，总黄酮和多糖提取得率明
显升高，在液料比为 20 ∶ 1时达到最大值，随后开始下降，故选择
20 ∶ 1为最佳的液料比．
3．2 响应面试验结果分析
3．2．1 设计方案和结果 根据 Box－behnken 的中心组合实验设
计原理，综合单因素实验结果，试验设计方案和结果如表 1、表 2，
方差分析如表 3、表 4．
表 1 Box－behnken试验因素水平及编码
Tab．1 Factors，levels and codes for Box－behnken design
因素与水平 温度 A/℃ 时间 B /h 料液比 C
－1 75 2．0 1 ∶ 15
0 85 2．5 1 ∶ 20
1 95 3．0 1 ∶ 25
表 2 Box－behnken设计方案与试验结果
Tab．2 Design and results of Box－behnken tests
试验号 A B C 总黄酮提取得率 /%
多糖提
取得率 /%
1 －1 －1 0 21．66 1．60
2 1 －1 0 22．48 1．93
3 －1 1 0 22．78 1．67
4 1 1 0 22．32 2．04
5 －1 0 －1 20．88 1．63
6 1 0 －1 21．50 1．89
7 －1 0 1 23．07 1．45
8 1 0 1 22．94 2．14
9 0 －1 －1 21．99 1．66
10 0 1 －1 21．34 2．00
11 0 －1 1 22．84 1．57
12 0 1 1 23．50 1．72
13 0 0 0 22．52 1．58
14 0 0 0 22．74 1．63
15 0 0 0 22．81 1．66
从表 3和表 4的方差分析表中可以看出，模型 P 值均小于 0．01，说明各响应值对该模型是非常显著的，
具有统计学意义．失拟项均为不显著，说明回归方程与试验拟合情况好，试验误差小，可用该回归方程对不同
提取条件下的总黄酮和多糖提取率进行预测．校正决定系数 Ｒ2Adj分别为 0．919 0 和 0．925 2，表明模型能解释
91．90%和 92．52%响应值的变化．
431 湖北民族学院学报(自然科学版) 第 31卷
表 4 方差分析表—多糖提取得率
Tab．4 ANOVA for the polysaccharide content
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
Model 0．49 9 0．055 20．25 0．002 ＊＊
A 0．34 1 0．34 125．65 ＜0．000 1 ＊＊
B 0．017 1 0．017 6．32 0．053 6
C 0．000 1 0．000 0．000 1．000 0
AB 4．000E－004 1 4．000E－004 0．15 0．716 6
AC 0．046 1 0．046 17．07 0．009 1 ＊＊
BC 3．025E－003 1 3．025E－003 1．12 0．338 9
A2 0．084 1 0．084 31．02 0．002 6 ＊＊
B2 4．741E－003 1 4．741－003 1．75 0．243 1
C2 4．103E－005 1 4．103E－005 0．015 0．906 8
残差 0．014 5 2．708E－003
失拟项 0．010 3 3．425E－003 2．10 0．339 1
纯误差 3．267E－003 2 1．633E－003
总和 0．51 14
相关系数 0．973 3
校正决定系数 0．925 2
变异系数 3．02
由表 3 可以看出，影响总黄
酮提取得率的主次因素顺序为:
料液比＞时间＞温度．其中 C 为极
显著影响因素，交互项 BC 达到
极显著水平，AB 达到显著水平，
平方项 A2、C2达到显著水平．藤
茶总黄酮提取得率的回归方程:
Y1 = 22．69+0．11A+0．17B+0．79C－
0．32AB－0．19AC+0．42BC－0．3A2
－0．075B2 － 0．29C2．经分析得，在
A= 1． 05，B = － 1． 75 和 C = 0． 21
时，即提取温度为 95．5℃，提取时
间为 1．63h 和料液比为 1:21．05
为藤茶总黄酮提取的最佳工艺条
件，在此最佳的提取条件下，总黄
酮与多糖提取得率预测值分别为
22．49%和 2．03%．
图 4给出了当温度、时间、料
液比其中一个选取固定值时，其他两因素及其交互作用对藤茶黄酮提取得率影响的响应曲面及等高线图．
等高线的形状可以反映出交互效应的强弱，椭圆形表示交互效应显著，而圆形与之相反．从图 4 可以看
出，提取温度和时间的交互作用显著，提取时间与料液比的交互作用显著，对藤茶黄酮提取得率有较大影响．
由表 4可以看出，影响多糖提取得率的主次因素顺序为:温度＞时间＞料液比．其中 A 为极显著影响因
素，交互项 AC达到极显著水平，平方项 A2达到极显著水平．藤茶多糖提取得率的回归方程:Y2 = 1．62+0．21A
+0．046B+0．01AB+0．11AC+0．027BC+0．15A2+0．036B2．
经分析得，在 A=－0．016，B = 0．065，C = －1．87，即提取温度为 84．84℃，提取时间为 2．53 h，料液比为 1 ∶
10．65为提取藤茶多糖的最佳工艺条件，在此优化提取工艺条件下，多糖与总黄酮提取得率预测值分别为
1. 62%和 20．15%．
a料液比= 1 ∶ 21．05
b时间= 1．63 h
531第 2期 肖 浩等:响应面法优化发酵藤茶黄酮和多糖的提取工艺
c温度= 95．5℃
图 4 试验因素及其交互作用对藤茶黄酮提取得率影响的响应曲面及等高线图
Fig．4 Ｒesponse surface and contour plots for the effects of cross－interactions among factors on extraction rate of total flavonoids
图 5给出了当温度、时间、料液比其中一个选取固定值时，其他两因素及其交互作用对藤茶多糖提取得
率影响的响应曲面及等高线图．
a料液比= 1 ∶ 10．55
b时间= 1．53 h
c温度= 84．84℃
图 5 试验因素及其交互作用对藤茶多糖提取得率影响的响应曲面及等高线图
Fig．5 Ｒesponse surface and contour plots for the effects of cross－interactions among factors on extraction rate of polysaccharides
由图 5可以看出，提取温度和料液比的交互作用显著，提取时间与料液比的交互作用显著，对藤茶多糖
提取得率有较大影响．
631 湖北民族学院学报(自然科学版) 第 31卷
综合以上分析，采用提取总黄酮的最佳工艺对黄酮和多糖的提取得率均较高，可作为两者同时提取的最
佳工艺．由此确定，藤茶总黄酮和多糖的最佳提取工艺条件为:浸提温度 95．5℃，提取时间 1．63 h 和料液比
1 ∶ 21．05．
3．2．2 验证试验 结合模型预测的最佳提取工艺条件，根据实际情况调整提取温度为 96℃，时间为 1．6 h，料
液比为 1 ∶ 21，按此工艺进行验证试验，结果总黄酮与多糖提取得率分别为 22．94%和 2. 13%，验证试验结果
与预测值接近，进一步验证了模型与试验结果的可靠性．从结果可以看出，从藤茶中提取得到总黄酮多糖提
取得率比文献报道的偏低，这可能与使用的材料有关系．本试验所用的材料为藤茶叶加工成商品后的边角
料，其中含有较多的杂质．
4 结论
应用响应面分析法优化的藤茶黄酮和多糖的综合提取工艺条件为:浸提温度 95．5℃，时间 1．63 h，料液
比 1 ∶ 21．05．根据实际情况调整提取温度为 96℃，时间为 1．6 h，料液比为 1 ∶ 21．按此模型进行验证试验，其
结果为总黄酮提取得率为 22．94%，多糖提取得率为 2．13%．
从本试验的结论可以看出，藤茶加工后的下脚料中还含有较多的黄酮和多糖，可作为一种开发天然产物
的资源加以充分利用，以减少资源浪费，同时也能提高藤茶的综合经济价值．
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731第 2期 肖 浩等:响应面法优化发酵藤茶黄酮和多糖的提取工艺