全 文 ：收稿日期:2008-08-09;　修订日期:2008-12-30
基金项目:湖北省自然科学基金(No.2006ABA036);
国家民委部分资助项目(No.08HB04)
作者简介:罗祖友(1963-),女(苗族),湖北恩施人 ,现任湖北民族学院副
教授 ,博士学位 ,主要从事天然产物与功能食品化学研究工作.
藤茶多糖 AGP-3的分离纯化与结构的初步鉴定
罗祖友 1, 2 ,陈根洪2 ,郑小江 1 ,吴谋成 3
(1.湖北民族学院湖北省生物资源保护与利用重点实验室 ,湖北 恩施　445000;
2.湖北民族学院生物科学与技术学院 ,湖北 恩施　445000;
3.华中农业大学食品科技学院 ,湖北 武汉 430070)
摘要:目的 对藤茶水溶性多糖进行分离纯化得到 AGP-3组分 ,并对其结构进行初步的鉴定 ,为藤茶多糖结构与生物活
性关系的研究奠定基础。方法 采用 DEAE-SephadexA-25、SephadexG-200和 HPLC对藤茶多糖分离纯化 , 并通过
IR、GC、1HNMR和 13CNMR分析对藤茶多糖 AGP-3组分的结构进行了初步鉴定。结果 AGP-3重均分子量(Mw)为
1.02×105 Da, 含中性糖质量分数 57.6%、糖醛酸 32.3%、蛋白质 3.5%。结论 藤茶多糖分离组分 AGP-3为一种含蛋白
质的复合多糖。
关键词:藤茶;　多糖;　分离纯化;　结构鉴定
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)07-1707-03
IsolationandPurificationandPreliminaryStructureIdentificationofPolysaccharide
FractionAGP-3 fromAmpelopsisgrossedentata
LUOZu-you1, 2 , CHENGen-hong2 , ZHENGXiao-jiang1 , WUMou-cheng3
(1.KeyLaboratoryofBiologicalResources, ProtectionandUtilizationofHubeiProvince, HubeiInstituteforNa-
tionalities, Enshi445000, China;2.SchoolofBiologicalScienceandTechnology, HubeiInstituteforNationali-
ties, Enshi445000, China;3.ColegeofFoodScienceandTechnology, HuazhongAgriculturalUniversity, Wu-
han430070, China)
Abstract:ObjectiveToprovideabasisfortheresearchabouttherelationbetweenthestructureanditsbioactivitiesofpolysac-
charidesfromAmpelopsisgrossedentata.ThepolysaccharidefractionAGP-3 wasobtainedandanalyzedpreliminarilyafterwater-
solublepolysaccharidesfromAmpelopsisgrossedentatabeingisolatedandpurified.MethodsThewater-solublepolysaccharides
fromAmpelopsisgrossedentatawereisolatedandpurifiedwithDEAE-SephadexA-25, SephadexG-200 andHPLC, andthe
structureofAGP-3 wasanalyzedpreliminarilybyIR, GC, 1HNMRand13CNMR.ResultsThemolecularaverage-weight
(MW)ofAGP-3was1.02×105 Da, containing57.6% neutralsugar, 32.3%uronicacidand3.5%protein.ConclusionThe
polysaccharidefractionAGP-3fromAmpelopsisgrossedentataisakindofconjugatedpolysaccharidecontainingprotein.
Keywords:Ampelopsisgrossedentata;　Polysaccharide;　Isolationandpurification;　Structureidentification
　　藤茶 Ampelopsisgrossedentata(Hand-Mazz)W.T.Wang,属于
我国特有的类茶植物 ,具有悠久的民间药用历史 [ 1] 。据记载 ,藤
茶入药性味甘淡 、清热解毒 , 主治黄疸型肝炎等 [ 2] , 现代研究证
实藤茶富含黄酮等重要的生物活性成分 [ 1 , 3] 。大量研究表明 ,植
物多糖 , 尤其是从中药材中提取的水溶性多糖 , 如枸杞多糖 、银杏
多糖等具有免疫调节 、抗氧化 、降血糖 、抗肿瘤等多种生物活
性 [ 4, 5] 。实验对藤茶水溶性多糖组分 AGP-3的提取 、分离和结
构进行研究 , 为考察藤茶多糖结构与生物活性的关系奠定基础。
1　材料与仪器
藤茶由鄂西藤茶公司提供;DEAE-SephadexA-25和
SephadexG-200, Pharmacia(USA)产品;牛血清白蛋白 , 中科院
新疆化学所生化试剂厂;葡萄糖醛酸 , Sigma产品;多糖标准品为
Pululan系列 , 日本东京化成公司产品;其它均为国产分析纯
试剂。
日本岛津 UV-265 FW紫外可见分光光度计;旋转蒸发仪 ,
BuchiRE111, Switzerland;气相色谱分析仪 , GC-9AShimadzu, Ja-
pan(浙大智达 N2000气相色谱工作站);高压液相色谱仪(RI检
测器), Agilent1100, USA;红外光谱仪 , ThermoNicoletNexusFT-
IR, USA;核磁共振仪 , Mercury600 NMR, VarianInc.USA。
2　方法
2.1　藤茶多糖的提取 、纯化工艺路线 藤茶※粗粉※石油醚脱脂
脱色※残渣※热水提取※浓缩※醇沉※收集沉淀 、复溶 、醇沉※
复溶※Sevag法脱蛋白※冷冻干燥※DEAE-SephadexA-25柱
分离※透析※浓缩※冷冻干燥※SephadexG-200柱层析纯化※
冷冻干燥※藤茶多糖 AGP-3。
2.2　藤茶多糖的提取 称取一定量的原料粗粉 , 用石油醚浸泡 、
回流脱脂脱色 ,回收残渣 , 挥干溶剂 , 以 1∶25料水比于 95℃水
浴提取两次 ,每次 4h,得到多糖提取液 , 真空浓缩后 , 加入浓缩液
3倍体积的 95%EtOH, 静置 2 h, 收集沉淀 -复溶 -醇沉 , 再复
溶 、Sevag法 [ 6]处理 3次 , 冷冻干燥得到藤茶多糖 AGP(polysac-
charidesfromAmpelopsisGrossedentata, AGP)。
2.3　藤茶多糖的分离与纯化 称取一定量的藤茶多糖AGP, 溶于
少量蒸馏水中 ,上 DEAE-SephadexA-25柱(19 mm×55 cm),
以 0 ～ 0.5mol· L-1NaCl溶液阶段洗脱 , 流速 0.5ml/min, 分部收
集 , 10 min/管。硫酸苯酚法和紫外吸收法分别检测多糖(A490)和
蛋白质(A280)。合并 0.3mol· L-1 NaCl溶液洗脱的多糖高峰部
分 , 透析脱盐 、减压浓缩 、冷冻干燥。干燥样品进一步溶于小体积
蒸馏水 ,上 SephadexG-200柱(19 mm×55cm), 蒸馏水洗脱 , 流
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速 10 ml/h, 分部收集 , 3 ml/管 , 同上方法跟踪检测多糖和蛋白
质。合并多糖高峰部分 , 浓缩 、冷冻干燥得白色絮状固体 AGP
-3。
2.4　藤茶多糖的纯度鉴定与理化性质分析
2.4.1　纯度鉴定 [ 7 ～ 9] 常压凝胶柱层析(SephadexG-200)10
mg多糖样品溶于小体积双蒸水中 , 上 SephadexG-200柱(19
mm×55 cm),用双蒸水洗脱 , 流速 6 ml/h, 分部收集 , 3 ml/管。
同上法跟踪检测 , 并绘制洗脱曲线图。
高效凝胶柱色谱(HPLC)Agilent1100 HPLC;Plaquagel-OH
MIXED柱;示差检测器;洗脱剂为醋酸盐缓冲液(0.2 mol· L-1
NaAc-0.2 mol· L-1 HAc, pH 6.0);流速 1.0 ml/min;柱温
25℃;保留时间 12 min。样品浓度 1.0mg· ml-1 , 进样 50μl。记
录样品色谱曲线。
2.4.2　基本理化性质 [ 8, 9] 用 KI-I2反应检测淀粉 , 斐林试剂反
应检测还原糖 , 苯酚 -硫酸法测定中性糖 , 硫酸 -咔唑反应检测
糖醛酸 , 考马斯亮蓝 G-250反应测定蛋白质含量。
2.5　藤茶多糖的结构分析
2.5.1　分子量测定 HPLC法(同上)。
2.5.2　单糖组成分析 采用糖腈乙酰酯衍生物气相色谱法 [ 10] 。
色谱条件:OV-1701石英毛细管柱(0.32 mm×30 m), 内径
0.32 μm;N2为载气 ,流速 50 ml/min,分流比为 1∶50;氢火焰离
子化检测器 , H
2
0.6 kg/cm2 , 空气 0.5 kg/cm2;进样口温度
250℃;柱温为程序升温 , 0 ～ 5 min升为 190℃,再以 20℃/min的
速率升至 230℃。
2.5.3　红外光谱分析 约 20 mg多糖固态样品 ,通过红外光谱仪
采样器直接采样 、压片 、扫描 , 记录红外光谱。
2.5.4　核磁共振 1HNMR和 13CNMR分析 多糖样品溶于重水
(D2O)中 , 样品浓度 50 mg· ml-1 , 温度 25℃, 在 Mercury600NMR仪上分析其波谱特征。
3　结果与分析
3.1　藤茶多糖的分离纯化 藤茶多糖 AGP上 DEAE-Sephadex
A-25柱 , 用不同离子强度的 NaCl溶液洗脱 , 可将吸附于交换剂
上的酸性多糖分离出来。收集 0.3mol· L-1NaCl洗脱出的高峰
部分 , 得率 28.0%;再经 SephadexG-200凝胶柱纯化 , 得到分子
量相对集中的纯化组分 AGP-3,得率 67%。
3.2　纯度鉴定 常压凝胶(SephadexG-200)柱层析结果如图 1
所示。 AGP-3洗脱曲线为单一对称峰 , 洗脱液的 A280曲线与多
糖 A490曲线基本保持一致的变化趋势 , 说明该多糖组分的分子量
分布相对均一 , 并含有蛋白质。
高效液相色谱法(HPLC)检测 AGP-3, 结果如图 2所示。
两种层析检测结果表明 , 藤茶多糖组分 AGP-3为相对均一的
多糖。
3.3　AGP-3的基本性质 藤茶多糖 AGP经两次分离分级纯化
得到多糖组分 AGP-3, 其冷冻干燥产品为白色絮状固体 , 溶于
水 , 不溶于乙醇 、丙酮等有机溶剂;KI-I2反应阴性 ,属非淀粉多
糖;不与斐林试剂反应 , 即不含单糖;苯酚 -硫酸反应 、硫酸 -咔
唑反应 、考马斯亮蓝 G-250反应均呈阳性 , 表明该多糖含有糖
醛酸 、蛋白质。经测定 , AGP-3含中性糖质量分数 57.6%、糖醛
酸 32.3%、蛋白质 3.5%。
3.4　AGP-3结构的初步分析
3.4.1　分子量测定 HPLC测得藤茶多糖组分 AGP-3重均分子
量(Mw)为 1.02×105 Da。
3.4.2　气相色谱分析 GC分析显示 , 组分 AGP-3的主要单糖
是:半乳糖 、甘露糖 , 其次是葡萄糖 , 说明藤茶多糖 AGP-3为杂
多糖。但 GC分析未能检出己糖醛酸 ,可能是制备糖腈衍生物的
过程中己糖醛酸遭到破坏的缘故 [ 11] 。
关于 GC法分析多糖样品中的单糖组成 , 具体方法的选择及
操作条件的控制极为重要。目前尚未见到关于藤茶多糖研究的
相关报道。本结果仅是对藤茶多糖单糖组成的初步分析 , 更准
确 、更完善的分析方法有待进一步探索。
3.4.3　红外光谱分析 AGP-3的红外光谱如图 3所示。主要结
构特征:3 700 ～ 3 100 cm-1的宽峰是糖类 O-H的伸缩振动(νO
-H), 存在着分子间和分子内的氢键 , 也包括有 -NH2中 N-H
的伸缩振动(νN-H), 提示多糖中含有 -OH、 -NH2或 -NH基
团。 1 740 ～ 1 680 cm-1是 -COOH中 C=O的伸缩振动(ν-
COOH)。 1 605.74cm-1处为羰基中 C=O的伸缩振动(νC=O),
也可能包括酰胺基 H2N-C=OR中 N-H的变角振动。 -NH2、-NH基团 、酰胺基的存在 ,表明可能含有蛋白质。 1 440 ～ 1 395
cm-1是 -COOH的 C-O的伸缩振动(νC-O)。 1 320 ～ 1 210
cm-1是 -COOH的 O-H的变角振动(δO-H)。 1 200 ～ 1 000
cm-1是 -COOH中 C-O-H伸缩振动(νC-O-H)和吡喃环的
醚键(C-O-C)伸缩振动(νC-O-C)。 1 023.23 cm-1是 O-H
的变角振动(δO-H)。 974.80 cm-1是糖环的骨架振动;790.64
cm-1是甘露糖苷键的变角振动。 820 ～ 950 cm-1之间是 D-葡萄
糖 、D-半乳糖 、D-甘露糖的特征吸收 ,包括 α-和 β -构型吸收
峰。这与 AGP-3性质和 GC分析的结果基本相符。
图 1　AGP-3的 SephadexG-200柱层析
图 2　AGP-3的高效液相色谱
图 3　藤茶多糖 AGP-3的红外光谱
3.4.4　核磁共振 1HNMR和 13CNMR分析 鉴于以上对藤茶多糖
AGP-3的单糖组成 、红外光谱分析结果 ,进一步对 AGP-3进行
核磁共振分析。 AGP-3的 1HNMR和 13CNMR分析结果如图 4、
图 5所示。
图 41HNMR氢谱中 , 多糖的信号大多数集中在 δ3.0 ～ 5.3
ppm狭小的范围内 , δ3.5 ～ 4.5 ppm为糖环质子信号。一般 α-
构型糖苷的异头碳上氢的共振比 β -构型糖苷向低场位移 0.3 ～
0.5 ppm, α-型吡喃己糖 C1位质子的 δ值 >5.0 ppm, 而 β -构
型一般 δ值 <5.0 ppm[ 7] 。图中 AGP-3多糖在 δ5.0ppm左右
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 7期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.7　
两边都有信号 , 因此 , 存在 α、β 两种糖苷构型 。据文献 , 图中
δ1.1 ～ 3.6 ppm范围的信号为蛋白质中氨基酸残基的 β -H和 γ
-CH3 、-CH2 、-CH上的 1H化学位移信号 [ 12] 。
从图 5的 13CNMR谱中看出 , 异头碳的共振峰均集中在 δ
98.771 ～ 102.692ppm范围内 ,清楚呈现 3个共振信号 ,说明该多
糖主要由 3种不同的单糖残基组成 ,为杂多糖 , 且存在 α, β 两种
糖苷构型。图中最低场处 δ170.785和 174.244 ppm显示有己糖
醛酸存在 , 因为最低场处的信号 δ170 ～ 176 ppm反应己糖醛酸中
羧基的特征信号 [ 13 , 14] 。除糖醛酸外 , GC分析中显示甘露糖 、半
乳糖和葡萄糖 3种单糖组分的糖腈乙酰酯衍生物色谱峰 ,其中葡
萄糖衍生物峰较弱;而 13CNMR谱中仅显示 3种单糖残基的共振
信号 , 可能是由于葡萄糖残基含量少 、其峰较弱被掩盖所致。
图 4　AGP-3的 1HNMR图谱
图 5　AGP-3的 13CNMR图谱
根据葡萄糖中各个碳的化学位移 δC1(102.692), δC6
(61.895), 可以推测其为 β -(1※ 6)连接 , δC6(69.546)为 O-
取代后的化学位移值 , 其余 δ76.077 ～ 77.144 ppm为糖环上非
连接碳 C2, C3, C5的化学位移值。甘露糖各个碳的化学位移 δ
C1 (101.008), δC4(68.864), δC6(61.895), 可以推测其为 β -
(1※ 4), (1※ 6)连接 ,其余化学位移 δ72.451 ～ 78.816 ppm为糖
环上非连接碳 C2, C3, C5的化学位移值。半乳糖各个碳的化学
位移 δC1(98.771), C2(69.546), C3(70.613), C6(61.895)可推
测半乳糖以 α-D-(1※ 6)与甘露糖连接。图谱中 δ59.581 ppm
和 δ52.908ppm为蛋白质氨基酸残基 γ-CH3、 -CH2、 -CH等
的 13C信号 [ 12] 。 AGP-3准确的结构信息 , 尚需进行 GC-MS、多
维 NMR等相关分析。
IR分析和 13CNMR结果显示 , AGP-3中含有较多的己糖醛
酸 , 因为含糖醛酸的多糖样品 IR图谱中 1 700 ～ 1 750 cm-1范围
内会产生吸收 , 13CNMR图谱中在低场 176 ppm附近会有羰
基碳的特征吸收 , 而当糖醛酸残基含量较少时IR谱中 1 700 ～ 1 750
cm-1的吸收峰被掩盖 [ 15] 。这与对 AGP-3的基本性质分析结果
一致。
4　结论与讨论
4.1　首次对藤茶水溶性多糖进行分离 、纯化 ,获得多糖组分 AGP
-3 以热水提取 、乙醇沉淀的藤茶多糖粗品 , 经 Sevag法脱蛋白
3次 、DEAE-SephadexA-25柱层析分离和 SephadexG-200柱
层析纯化获得藤茶多糖组分 AGP-3。
4.2　AGP-3的纯度鉴定与基本性质 经 SephadexG-200
柱层析和 HPLC鉴定 , AGP-3为分子量分布相对均一多糖 。
AGP-3冻干样为白色絮状固体 , 属非淀粉多糖;中性糖 、糖
醛酸和蛋白质质量分数分别为 57.6%、 32.3%和 3.5%。资
料显示 , 以一种单糖作标准测定杂多糖的含量存在误差 , 而己
糖醛酸的存在对苯酚 -硫酸法测定中性糖含量存在干扰 [ 7] ,
更准确的测定糖含量的方法需要根据杂多糖的单糖组成和己
糖醛酸含量加以校正。
4.3　AGP-3的结构分析 HPLC法测得 AGP-3重均分子量为
1.02×105Da。气相色谱 、红外光谱和核磁共振分析对 AGP-3
结构作出初步定性:主要由半乳糖 、甘露糖 、葡萄糖及己糖醛酸组
成 , 包括 β -(1※ 4)、β -(1※6)、α-(1※ 6)几种糖苷键类型 , 并
含有蛋白质 ,为一种复合多糖。
本研究采用红外 、核磁和气相色谱几种物理分析方法 , 获得
了藤茶多糖 AGP-3结构的部分信息 , 还有待通过化学分析并结
合其它物理分析方法 ,以对该多糖进行更准确的结构表征。
参考文献:
[ 1 ] 　张友胜 ,杨伟丽 , 熊浩平.类茶植物显齿蛇葡萄的研究利用现状
[ J] .茶叶通讯 , 2001, 1:19.
[ 2 ] 　侯建军 ,覃红斌 ,胡泽华.野生藤茶的药理作用和临床应用研究进
展 [ J] .湖北民族学院学报(医学版), 2002, 19(4):36.
[ 3 ] 　钟正贤 ,周桂芬 ,陈学芬 ,等.藤茶总黄酮对链脲霉素所致糖尿病大
鼠的降糖作用 [ J] .中药药理与临床 , 2003, 19(5):19.
[ 4 ] 　田庚元.天然多糖的研究和应用(下)[ J].上海化工, 2000, 25
(11):23.
[ 5 ] 　王云普 ,王永峰 ,马君义 ,等.植物多糖的研究概况 [ J] .中华实用中
西医学杂志 , 2003, 3(16):1335.
[ 6 ] 　刘成梅 ,万　茵 ,涂宗财 ,等.百合多糖脱蛋白方法的研究 [ J].食品
科学 , 2002, 23(1):89.
[ 7 ] 　张惟杰.糖复合物生化研究技术(第 2版)[M] .杭州:浙江大学出
版社 , 1999:29, 96, 193, 242.
[ 8 ] 　陈石良 ,马　青 ,谷文英 ,等.灰树花胞外多糖的性质与结构 [ J] .无
锡轻工大学学报 , 2002, 21(3):244.
[ 9 ] 　谭周进 ,谢达平 ,王　征 , 等.蜜环菌多糖分离纯化及性质的研究
[ J] .食品科学 , 2002, 23(9):49.
[ 10]　李小定.灰树花多糖的结构及其生物活性 [ D].武汉:华中农业大
学 , 2002:38.
[ 11]　李　波 ,许时婴.气相色谱法测定多糖中的糖醛酸 [ J] .色谱 , 2004,
22(5):560.
[ 12]　于德泉 , 杨俊山.分析化学手册 [ M] .北京:化学工业出版社 ,
1999:74.
[ 13]　王习达 ,吴国荣 ,陈景耀 ,等.铜绿微囊藻酸性多糖的分离 、纯化与
结构研究 [ J] .中药材 , 2003, 26(12):865.
[ 14]　王　展 ,方积年.高场核磁共振波谱在多糖结构研究中的应用 [ J] .
分析化学 , 2000, 28(2):240.
[ 15]　刘翠平 ,董　群 ,方积年.一种判定多糖中有无糖醛酸残基的简易
新方法 [ J] .中草药 , 2001, 32(5):404.
·1709·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.7 时珍国医国药 2009年第 20卷第 7期