全 文 ：miRNA 介导的转录后基因调控机制在调控植
物生长发育、 激素信号、 应答外界胁迫等方面具有
举足轻重的作用 [1]， 更是在植物开花期调控及花器
官发育过程中也起着不可替代的作用 [2]。 因此， 开
展植物开花过程中 miRNAs 鉴定的研究是十分必要
的。 植物物种能够得以维持延续的一个基本要求就
是离不开开花结果。 植物 miRNAs 及其对其靶基因
的调控已经成为当今植物分子生物学研究的重要课
题之一。 miRNAs 在植物花发育过程中所起的作用
已有一定的研究 [3, 4]。 获得部分 miRNA， 并对其在
植物开花发育中的功能与调控作用有所了解， 如
miR172 在拟南芥中通过调控 APETALA2 （AP2）-
like 转录因子的表达， 控制开花时间和花器官的形
成， 但这些研究主要集中在模式植物上。 由于拟南
芥属于长日照植物， 其开花诱导模型并不能完全解
释短日照植物开花诱导机理 [5]， 说明短日照和长日
热带作物学报 2011， 32（7）： 1296-1303
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期： 2011-05-23 修回日期： 2011-07-03
基金项目： 国家科技支撑计划项目（No. 2007BAD07B03）。
作者简介： 刘生财(1980年—)， 男， 博士， 讲师。 研究方向： 园艺植物生物技术与遗传资源研究。 *通讯作者： 赖钟雄， E-mail： Laizx01@163.com。
利用 Solexa测序技术鉴定苋菜试管
开花过程中的miRNAs
刘生财， 林玉玲， 陈晓东， 赖钟雄 *
福建农林大学园艺植物生物工程研究所， 福建福州 350002
摘 要 利用 Solexa 测序技术对苋菜试管开花过程中的 miRNAs 进行筛选和鉴定， 使用 GO 数据库和 KEGG 代
谢途径数据库对靶基因进行功能注释和分类。 结果显示： 共得到 sRNA Unique 序列 5 457 486 条， 其中与拟南
芥基因组完全匹配有 27 596 条， 仅仅占 0.51％； miRNA 主要分布在 18 nt~25 nt 之间， 其中长度为 24 nt 序列数
量最多； 苋菜试管开花过程中 miRNA 的表达丰度存在明显差异， 主要低丰度表达； 总共鉴定了 235 个已知的
苋菜 miRNA， 构成 20 个家族， 不同家族间成员数量存在巨大差异； 苋菜保守 miRNA 的长度主要集中在 21 nt
和 20 nt； 另外总共获得 14 个候选的新 miRNA， 其中有 8 个 miRNA 含单个基因座， 另 6 个 miRNA 具备多个基
因座； 11 个候选的 miRNA 预测到了靶基因， 总共对应着约 46 个基因符合靶标特征。 这些靶标参与植物生物体
的各个发育进程， 在苋菜试管开花过程中对生物过程、 细胞组分及分子功能起到重要作用。
关键词 苋菜； 试管开花； miRNA； solexa 测序
中图分类号 S636.4 文献标识码 A
Novel and Conserved miRNAs Identification during in vitro
Flowering of Amaranthus by Solexa Sequencing
LIU Shengcai， LIN Yuling， CHEN Xiaodong， LAI Zhongxiong
Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China
Abstract In this study, novel and conserved miRNAs were filtered and identificated by Solexa sequencing during
in vitro flowering of amaranthus, and a further target function analysis based on the GO database and the KEGG
pathway database were made. The results showed that: there were 5 457 486 unique sequences， and 27 596（0.51
%）of the unique sequences were distributed across different chromosomes of Arabidopsis thaliana. The length of
sRNAs was mainly distributed ranging from 18 nt to 25 nt, and 24 nt being the predominant. The expression
patterns of different unique sRNAs varied drastically, and most of them were at the low levels; 235 conserved
miRNAs had been identified, which consisted of 20 families. The number of the members varied drastically among
different families. The length of most conserved miRNAs was 21 nt and 20 nt. Moreover, 14 novel miRNAs were
predicted, 8 of them with single locus and the rest with multiple loci. About 46 targets of 11 novel miRNAs were
also predicted. These targets provided insights into miRNA biogenesis and expression during plant development,
and played an important role in biological process， cell component， and molecular function during in vitro
flowering of Amaranthus.
Key words Amaranthus; in vitro flowering; miRNA; Solexa sequencing
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2011.07.022
第 7 期
照植物开花诱导途径有不同之处。 因此， 对短日照
植物开花诱导机制的研究将有助于人们更加深入了
解开花诱导之谜。 苋菜（Amaranthus mangostanus L.）
是短日照植物， 本身就是研究植物开花的好材料。
由于试管开花技术操作简单、 生长条件相对可控，
重复性强， 组织培养的周期短， 因而为研究植物营
养生长向生殖发育的转变以及开花机理， 提供了更
精准的研究手段和良好的实验系统。 本研究所现已
建立了稳定的苋菜试管开花体系， 为研究植物开花
机理的研究提供良好的试验平台。 同时， miRNA
在苋菜上的研究尚未见报道。 本研究采用 Solexa
测序技术结合生物信息学分析方法， 鉴定短日照植
物苋菜试管开花过程中的 miRNA并预测其靶基因，
探讨其可能参与的过程， 推测苋菜 miRNA 及其靶
基因在开花过程中所起的作用， 为进一步完善植物
开花理论提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
苋菜试管苗由福建农林大学园艺植物生物工程
研究所培养、 保存并提供。 取试管苗开花过程中的
花芽分化期、 始花期和盛花期的花器官， 用于小分
子 RNA的提取及后续试验。
1.2 方法
1.2.1 苋菜试管开花过程中 Small RNA 文库构建
和 Solexa 测序 参照 TRIZOL 试剂（Invitrogen）说
明书提取上述 3 个时期材料的花器官总 RNA。 使
用 Cary50 紫外分光光度法检测 RNA 样品的纯度，
以 1.0％的非变性琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
按照相同比例将苋菜试管苗 3 个时期材料的总
RNA 进行混合， 再使用 15％的变性聚丙烯酰胺凝
胶 （TBE）分离获得 16～30 nt 的 Small RNA。 利用
T4RNA 连接酶（T4 RNA ligase， TaKaRa）在纯化的
Small RNA 上加一个 5′RNA接头（5′-GUUCAGAG
UUCUACAGUCCGACGAUC-3′）， 再在其另一端加
一个 3RNA接头（5′-pUCGUAUGCCGUCUUCUGCU
UGidT -3′ ; p, phosphate; idT, inverted deoxy -
thymidine）。 以 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACG-
3′为反转录引物 ， 利用 Superscript II 反转录酶
（Invitrogen）将上述经过 Poly（A）加尾并连接有 RNA
接头的 Small RNA 进行 cDNA 文库合成。 以上述
cDNA为模板， 进行 PCR扩增。 最后利用高通量测
序技术 Solexa 对苋菜试管开花过程中花器官混合
样进行 Small RNA 测序。
1.2.2 苋菜试管开花过程中 Small RNA 的生物信
息学分析 对 Solexa 测序所得的原始数据进行生
物信息学分析 ， 以筛选出保守或特异的苋菜
miRNA。 测序所得的 35 nt序列， 首先通过去接头、
去低质量、 去污染、 去载体序列和包含 polyA 的序
列及去除小于 18 nt 的小片段等过程完成数据处理
得到干净序列（clean reads）， 并统计其序列长度分
布情况与数量。 然后， 将所得到的干净序列通过与
Rfam（9.1）数据库以及 Genbank 进行比对并分类注
释， 鉴定 rRNA、 tRNA、 snRNA 和 snoRNA 等非编
码 Small RNA； 并通过对重复序列、 外显子和内含
子进行比对 ， 鉴定与重复序列相关的 sRNA 和
mRNA降解片段。
1.2.3 苋菜试管开花过程中 miRNA 的预测与功能
分析 对 Solexa 测序所得的 miRNA 与 miRNA 数
据库（miRBase15.0）中所有植物的成熟 miRNA 或其
前体序列进行同源性比对分析， 鉴定苋菜样品中已
知的 miRNA， 并对已知 miRNA 进行家族分析和表
达谱分析， 并利用 Mireap 软件对未能注释的 Small
RNA 进行苋菜开花过程中特异 miRNA 的预测。 最
后利用 KO 和 GO 方法对这些已知 miRNA 进行功
能分类和分析。
1.2.4 苋菜试管开花过程中 miRNA靶基因的预测
对 Mireap 预测出的 miRNA 进行靶基因预测 ，
得到可预测出靶基因的 miRNA 数量以及这些
miRNA 的预测靶基因数量 。 参照 Allen 等 [6]及
Schwab 等 [7]的方法， 按如下规则进行 miRNA 的靶
基因预测： （1）sRNA 与靶基因间的错配不得超过 4
个（G-U 配对认为 0.5 个错配）； （2）在 miRNA/靶基
因复合体中不得有超过 2 处发生相邻位点的错配；
（3）在 miRNA/靶基因复合体中， 从 miRNA 的 5′端
起第 2～12 个位点不得有相邻位点都发生错配 ；
（4）miRNA/靶基因复合体的第 10～11 个位点不得发
生错配； （5）在 miRNA/靶基因复合体中， 从 miRNA
的 5′端起第 1～12 个位点不得有超过 2.5 个错配；
（6）miRNA/靶基因复合体的最低自由能（MFE）应不
小于该 miRNA 与其最佳互补体结合时 MFE 的
75％。
2 结果与分析
2.1 苋菜试管开花过程中 Small RNA 种类分布及
数量
采用高通量 Solexa测序技术对苋菜试管开花过
程中的 Small RNA文库进行测序， 共获得 16 248 316
条原始序列， 其中高质量序列为 16 010 279条， 共得
到大于 18 nt的干净序列（Total sRNA）15 776 659条，
刘生财等： 利用 Solexa测序技术鉴定苋菜试管开花过程中的 miRNAs 1297- -
第 32 卷热 带 作 物 学 报
3 000 000
2 500 000
2 000 000
1 500 000
1 000 000
500 000
0
1.02％ 2.18％
3.71％
7.23％ 9.02％
22.63％
52.03％
1.51％ 0.31％ 0.19％ 0.10％ 0.04％ 0.02％
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
长度/nt
图 1 sloexa 测序结果 unique 序列长度分布图
分类 单一小RNA 百分比/％ 总小RNA 百分比/％
微小RNA(miRNA) 235 0.00 540 386 3.43
核糖体RNA(rRNA) 77 658 1.42 986 293 6.25
干涉小RNA(siRNA) 204 124 3.74 981 395 6.22
核小RNA(snRNA) 1 585 0.03 5 896 0.04
核仁小RNA(snoRNA) 836 0.02 2 678 0.02
转运RNA(tRNA) 13 970 0.26 967 247 6.13
未注释的小RNA 5 157 360 94.50 12 288 442 77.89
总计 5 457 486 100.00 15 776 659 100.00
表 1 苋菜试管开花过程中 sRNA 种类分布统计
其中 Unique sRNA 5 457 486 条。 然后统计干净序
列中 Small RNA 种类分布与数量。 其中， 与已知
miRNAs 比对上的 Unique sRNA 序列非常少， 只有
235 条 ； 其 它 类 型 的 sRNA （rRNA、 siRNA、
snRNA、 snoRNA 和 tRNA）数量也是很少， 仅占总
量的 5.47％； 而绝大多数是功能未注释的 Unique
sRNA 序列（5 157 360 条）， 占总量的 94.50％， 因
此可以推断， 在苋菜试管开花过程中有大量新的
small RNA 起着调控作用； 同时， 也表明已经构建
的苋菜 small RNA 文库还有很多信息值得去挖掘，
进一步明确苋菜试管开花过程。 不同类型的 sRNA
分布及数量具体见表 1。
2.2 苋菜试管开花过程中 unique 序列的长度分布
与表达丰度
从图 1 中可以看出， 苋菜 sRNA 序列长度分布
比例差异很大， 主要分布在 18~25 nt 之间， 其中
长度为 24 nt 序列数量最多（52.03％）， 这与多数被
子植物的研究结果一致 [1, 8, 9]； 其次是长度为 23 nt
（22.63％）、 22 nt（9.02％）、 21 nt（7.23％）、 20 nt
（3.71％）、 19 nt（2.18％）和 25 nt（1.51％）序列。 植
物中存在不同长度的 miRNA 序列， 可能与其相应
的功能和调控靶基因的方式具有对应关系[10]。
从Solexa 测序结果可以看出， 在苋菜试管开花
过程中 Unique sRNA 的表达丰度存在着较大差异。
84.63％的单一序列仅在文库中出现一次， 14.46％
的序列重复读取次数为大于等于 2次但小于 10次，
剩余的 0.91％的序列重复读数超过 10 次， 其中仅
11条单一序列在文库中出现超过 1万次。
2.3 苋菜试管开花过程中保守 miRNAs的鉴定
将 Solexa 测序获得的 Unique sRNA 序列与
miRBase15.0 数据库中所有植物的 miRNAs 序列进
行同源比对分析， 鉴定苋菜试管开花过程中保守的
miRNA， 总共有 13 151条单一序列与其他植物的已
知 miRNA同源。 通过进一步比对和分析， 总共鉴定
了 235个已知的苋菜 miRNA， 构成 20个家族。 不同
家族中的 miRNA成员变化很大， 只有 3个家族存在
1个成员， 另外 17个家族由多成员构成。 鉴定的家
族中成员最多的是 miR166家族， 由 39个成员构成；
1298- -
第 7 期
MIR156 MIR159 MIR160 MIR162_1 MIR164 MIR166 MIR167_1 MIR168 MIR169_2 MIR171_1
拟南芥 + + + + + + + + + +
水稻 + + + - + + + + + +
玉米 + + + - + + + + + +
高粱 + + + - + + + + + +
苜蓿 + + + + + + + + + +
甘蔗 + + - - - - - + - -
大豆 + + + + + + + + + +
杨树 + + + + + + + + + +
小立碗藓 + + + - - + - - - +
陆地棉 + - - + + + + - - -
衣藻 - - - - - - - - - -
油菜 + + + - + + + + + +
松树 + + - - - + - - - -
卷柏 + + + - - + - - - +
小麦 - + + - + - + - - +
番木瓜 - - - + - - - - - -
葡萄 + + + + + + + + + +
马铃薯 + + + + - + + - + +
莲花 - - - - - - + - - -
豇豆 - - - - - - - - - -
苹果 - - - - - - - - - -
四季豆 - + - - - + - - - -
短柄草 + - - - - + + - + +
耧斗菜 + + + - - + - - + +
柑橘 + + + + + + + + - +
蓖麻 + + + + + + + + + +
花生 + + + - - - + - - -
表 2 苋菜保守 miRNAs 与其它物种匹配情况
随后是 miR156/157（37 个成员） 和 miR159（23 个成
员）家族。 在本研究中获得的苋菜保守 miRNAs在不
同物种中具有高度保守性（见表 2）。
由于 miRNA 长度影响其调控作用， 本研究统
计了已鉴定的苋菜保守 miRNA 的长度分布范围
（18~24 nt）。 其中， miRNA 长度为 21 nt 和 20 nt 所
占的比例最高， 分别为 29.36％和 21.70％； 24 nt
所占的比例最低， 为 1.70％。
Solexa 测序还可以准确分析 miRNAs 表达水
平。 本研究利用 Solexa 测序读取次数分析已鉴定
的保守 miRNAs 的表达丰度， 发现不同家族甚至同
一家族不同成员之间的表达丰度存在很大差异， 且
以低丰度表达为主。 其中已知 miRNA 重复读取次
数少于 1 000 次的高达 94.04％， 而小于 10次就有
62.13％； 更是有 28.09％ miRNA 读取次数只有 1
次。 相对于低丰度表达的 miRNA 家族， 本研究还
鉴定到少量表达丰度高的 miRNA 家族。 miR156 家
族重复读取次数最高， 可达 355 930 次； miR166
家族也高达 131 220 次。 对于同一家族不同成员的
miRNA 表达丰度也存在很大差异， 如 miR156家族，
不同成员重复读取次数从 1~222 062不等， 说明高丰
度表达的 miRNA家族也包括低丰度表达成员。
2.4 苋菜试管开花过程中新 miRNAs的预测
利用软件 Mireap 对苋菜特异 miRNA 进行预测
分析， 总共获得 14 个候选的 miRNA。 将这些新的
miRNA 候选者分成 2 类 ： ①只有单个基因座的
miRNA（表 3）； ②具备多个基因座的 miRNA（表
4）。 其中有 8 个 miRNA 只有单个基因座； 另外 6
个 miRNA 具备多个基因座， 对应着 2 个家族。 从
表达丰度来看， 这些新预测的 miRNA 的表达量存
在很大差别， 其中 ama-miR6 表达量较高， 达到
315 次； ama-miR1 和 ama-miR2 表达量最低， 仅
有 5 次。 另外， 这些新鉴定的 miRNA 长度分别为
20 nt、 21 nt和 23 nt， 其中以 21 nt为主， 占新鉴定
刘生财等： 利用 Solexa测序技术鉴定苋菜试管开花过程中的 miRNAs 1299- -
第 32 卷热 带 作 物 学 报
miRNA 家族 序列 数量 长度/nt 最低自由能/(kcal/mol) 5′/3′
ama-miR1 TTCTTTTCTGGATGCATTGTT 5 21 -38.20 3prime
ama-miR2 AGGATATGGAGAGGGAAGGAA 5 21 -190.40 5prime
ama-miR3 CTGACAGAAGAGAGAGAGCAC 114 21 -112.20 3prime
ama-miR4 ACATGGGGATGTAGCTCAGATGG 54 23 -63.50 5prime
ama-miR5 CCATTGGGATACTTCGAATAA 5 21 -157.42 3prime
ama-miR6 CGTTCCCCACAGACGGCGCCA 315 21 -180.36 5prime
ama-miR7 TATGTTATATATAGAGGTGGACA 11 23 -121.42 5prime
ama-miR8 AGAACAAACAACAATGAGCAT 6 21 -89.13 3prime
表 3 预测的单基因 miRNA
miRNA 家族 成员 序列 数量 长度/nt 最低自由能/(kcal/mol) 5′/3′
ama-miR9
ama-miR9a TTGACAGAAGAGAGAGAGCAC 111 21 -139.28 3prime
ama-miR9b TTGACAGAAGAGAGAGAGCAC 111 21 -159.10 3prime
ama-miR9c TTGACAGAAGAGAGAGAGCAC 111 21 -102.25 3prime
ama-miR10
ama-miR10a TGACAGAAGAGAGAGAGCAC 6 20 -75.50 3prime
ama-miR10b TGACAGAAGAGAGAGAGCAC 6 20 -75.50 3prime
ama-miR9d TTGACAGAAGAGAGAGAGCAC 111 21 -65.24 5prime
表 4 预测的多基因座 miRNA
MIR172 MIR169_1 MIR390 MIR393 MIR394 MIR396 MIR397 MIR398 MIR399 MIR408
拟南芥 + + + + + + + + + +
水稻 + + + + + + + + + +
玉米 + + + + + + - - + +
高粱 + + + + + + + - + +
苜蓿 + - + + - + - + + -
甘蔗 - - - - - + - - - +
大豆 + - + + - + - + - -
杨树 + + + + + + + + + +
小立碗藓 - - + - - - - - - -
陆地棉 + + + + + + - + + -
衣藻 - - - - - - - - - -
芸薹属 + + + + - + + + + -
松树 - - + - - + - + - -
卷柏 - - - - - + - - - -
小麦 - - - - - - - - + +
番木瓜 - - - - - - - - - -
葡萄 + + + + + + + + + +
马铃薯 + + - - - - + - - -
莲花 - - - - - + - - - -
豇豆 - - - - - - - - - -
苹果 - - - - - - - - - -
四季豆 - - - - - - - - + -
短柄草 - - - - - - + - + -
耧斗菜 + + - - - + - + + -
柑橘 + - + - - + - + - -
蓖麻 + - + + - + + + + +
花生 - - - - - - - + - +
续表 2 苋菜保守 miRNAs 与其它物种匹配情况
1300- -
第 7 期
# 路径
有路径注释
的靶基因数
有路径注释的
物种全部基因数
P 值 Q 值 路径ID
1 植物-病原物互作 5(35.71％) 1 359(8.6％) 0.004 835 608 0.087 040 94 ko04626
2 戊糖-葡糖醛酸相互转化 2(14.29％) 209(1.32％) 0.014 274 48 0.128 470 32 ko00040
3 硫代谢 1(7.14％) 63(0.4％) 0.054 423 98 0.228 216 66 ko00920
4 含硒氨基酸代谢 1(7.14％) 72(0.46％) 0.061 970 34 0.228 216 66 ko00450
5 类固醇生物合成 1(7.14％) 76(0.48％) 0.065 306 3 0.228 216 66 ko00100
6 氨酰-tRNA生物合成 1(7.14％) 89(0.56％) 0.076 072 22 0.228 216 66 ko00970
7 光合生物的碳固定 1(7.14％) 125(0.79％) 0.105 287 6 0.262 477 80 ko00710
8 帕金森综合征 1(7.14％) 175(1.11％) 0.144 443 3 0.262 477 80 ko05012
9 代谢途径 5(35.71％) 3 302(20.9％) 0.149 844 8 0.262 477 80 ko01100
10 半胱氨酸和甲硫氨酸代谢 1(7.14％) 208(1.32％) 0.169 407 8 0.262 477 80 ko00270
11 氧化磷酸化 1(7.14％) 224(1.42％) 0.181 266 8 0.262 477 80 ko00190
12 老年痴呆症 1(7.14％) 266(1.68％) 0.211 652 8 0.262 477 80 ko05010
13 顿氏舞蹈症 1(7.14％) 268(1.7％) 0.213 073 3 0.262 477 80 ko05016
14 黄酮类生物合成 1(7.14％) 273(1.73％) 0.216 614 1 0.262 477 80 ko00941
15 芪类化合物，二芳基庚酸类及姜醇生物合成 1(7.14％) 276(1.75％) 0.218 731 5 0.262 477 80 ko00945
16 苯基类化合物生物合成 1(7.14％) 371(2.35％) 0.283 097 2 0.318 484 35 ko00940
17 淀粉和蔗糖代谢 1(7.14％) 490(3.1％) 0.356 777 8 0.377 764 73 ko00500
18 次生代谢 2(14.29％) 1 907(12.07％) 0.517 529 7 0.517 529 70 ko01110
表 5 新预测的苋菜试管开花靶基因代谢路径注释
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
100
80
60
40
20
0
百
分
率
/％
长度/nt
G
C
A
U
12 894 69
图 2 不同长度 miRNA 首位碱基分布图
的 miRNA的 71.43％。 对不同长度的新鉴定 miRNA
的首位碱基分布进行统计分析结果表明， 不同长度
的 miRNA 首位碱基偏好性不同， 当 miRNA 长度为
20 nt 时， 首位碱基偏向于 U， 21 nt 时偏向于 C 或
U， 23 nt时偏向于A（图 2）。 利用 Mfold软件对新鉴
定的 miRNA前体的最小折叠自由能进行分析， 结果
表明， 最小折叠自由能分布在-38.20～190.4 kcal/mol
之间， 平均为-112.10 kcal/mol。
2.5 苋菜试管开花过程中 miRNAs 及其靶基因的
预测与功能分析
对预测的 14 个 miRNAs 利用 KO 方法进行功
能注释分类， 发现这些靶标参与植物生物体的各个
发育进程（表 5）。 其中靶基因参与植物与病原互作
途径、 代谢途径比例最高， 均为 35.71％； 其次是
参与次生代谢产物生物合成途径、 戊糖与葡萄糖醛
酸酯互换途径， 均为 14.29％； 同时， 众多研究表
明， 1 个靶基因可以参与多条代谢途径。 说明苋菜
试管开花过程中涉及到多种代谢途径， 这些靶基因
如何参与调控还需要进一步分析和验证。
通过利用 GO 对苋菜试管开花过程中相关基因
的功能分类， 苋菜试管开花过程是一个生命活动旺
盛的极其复杂过程。 在苋菜试管开花过程中植株体
内在细胞组份及生物代谢中发生了明显的变化， 许
多具有催化功能和运输功能的分子大量的表达， 大
分子复合体、 细胞组分、 胞外域等相关基因的表
达， 使多细胞器官发育进程、 发育进程和生物调控
水平加强， 最终调控花分生组织转变的时间， 说明
这些基因的表达参与苋菜试管开花过程。 但对于这
刘生财等： 利用 Solexa测序技术鉴定苋菜试管开花过程中的 miRNAs 1301- -
第 32 卷热 带 作 物 学 报
些 miRNA 参与调控途径及调控模式还需要进一步
研究。
为了探讨 miRNAs 在基因表达调控中的作用，
本研究对 miRNAs 的靶基因进行了预测和鉴定。 发
现 11 个 miRNAs 对应着约 46 个基因符合靶标特
征 。 这 些 预 测 的 靶 基 因 包 括 SQUAMOSA
PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE（SPL）、 stru
ctural constituent of ribosome、 dehydration-responsi
ve family protein 等。 一些 miRNA 的靶基因在多数
植物中具有很高保守性。 miR156 预测的靶基因是
转 录 因 子 SQUAMOSA PROMOTER BINDING
PROTEIN LIKE（SPL）。 由于 1 个 miRNA 可同时调
控多个靶标 ； 而 1 个靶标也可能同时受到多个
miRNA 的调控， 例如， 苋菜试管开花过程中预测
的 SPL 家族成员受到多个 miRNA 调控或者 1 个
miRNA 可同时调控 SPL 家族多个成员， 但这预测
还有待于实验的进一步验证。
3 讨论与结论
3.1 苋菜试管开花过程中表达的 miRNAs 数量比
较多
高等植物的开花是植物发育过程中一个重要的
质变过程， 开花转换决定了植物生殖发育的时期和
质量， 此过程非常复杂， 受到大量基因调控。 本研
究就发现苋菜试管开花过程受到数量较多的
miRNA 基因调控， 且获得的 miRNA 中还有很大一
部分未能得到功能注释， 这可能与苋菜 EST 或基
因组等相关数据库信息的不完善有关， 也说明苋菜
试管开花过程中可能还存在大量具有功能特异性的
新 miRNA， 这需要进一步完善苋菜 EST 或基因组
等相关数据库信息， 并验证这些新 miRNA。
苋菜试管开花过程中不同家族中的 miRNA 成
员的数量相差非常大， 此结果与拟南芥研究结果相
一致。 尽管不同 miRNA 家族之间成员数量差异巨
大， 但不同物种间相同家族成员的数量却有一定的
保守性[11]。
3.2 苋菜试管开花过程中绝大部分 miRNA为低丰
度表达
掌握 miRNA 表达规律对探讨其在植物生长发
育过程中所起的作用具有十分重要意义。 苋菜试管
开花过程中， 绝大多数 miRNA家族为低丰度表达，
而仅有非常少的 miRNA 大量表达， 这与其他植物
的研究结果是一致的 [8, 9, 12]。 miRNA 及其调控的靶
基因的表达， 构成了一个非常严密的调控网络， 该
网络的精确运行确保了生物体各种生理过程的正常
运行 [13]。 因此植物的正常发育需要大量的 miRNA
共同协调作用， 这说明低丰度表达但数量巨大的
miRNA 可能在植物的成花进程中或胁迫条件下起
着更关键的作用。
3.3 miRNA 及其靶基因在苋菜试管开花过程中可
能参与的过程或作用
植物在成花过程中涉及到多方面生物过程 ，
miRNA 在植物营养生长向生殖生长转变时起着重
要作用， 因此， 确定苋菜试管开花过程中涉及到的
相关 miRNA基因功能是理解试管开花过程的关键。
miR156 是调控植物生长周期转变的关键基因， 其
靶基因 SPL 通过对 miR172 的表达调节， 控制着幼
年期到成年期的转变 [3， 4]。 在本研究中， 也鉴定到
miR156 和 miR172 家族的基因， 这些基因对苋菜
试管开花过程调控作用还需要进一步研究和验证。
在成花转变过程中， 许多 miRNA对花的形态建
成的调控起重要作用[14]， 参与激素信号转导过程， 其
表达受植物激素的诱导[15, 16]， miRNAs的靶标还包括
多种植物激素的合成运输及信号途径的关键元件[17]，
但是这些 miRNA 如何调控苋菜试管开花还有待进
一步研究。
在本研究中获得的苋菜试管开花相关 miRNA，
并对这些 miRNA的靶基因进行预测， 其包括 WOX
家族基因 、 dehydration-responsive family protein、
ADR1-L1、 SBPASE、 phosphate translocator-related
等。 我们初步推测这些靶基因可能也参与苋菜试管
开花进程， 但是还需要将来试验进一步验证。
MiRNAs 在一个复杂的调控网络中彼此相互协
调或抑制， 最终影响植物开花发育进程。 随着现代
分子生物学技术的发展以及新的发现， 研究者对
miRNA 分子及其靶基因的研究也将是不断的深入。
而且人们发现， 短日照和长日照植物开花诱导途径
有很多不同之处， 拟南芥中的开花诱导模型并不能
完全解释短日照植物中开花诱导的机理， 因此， 对
短日照植物开花诱导机制的研究将有助于人们揭开
开花诱导之谜。 本研究的后续工作将不断地挖掘与
短日照植物苋菜开花相关的 miRNA， 然后对其进
行鉴定和功能验证， 进一步完善植物成花理论。
参考文献
[1] 林玉玲, 赖钟雄. 利用Solexa 测序技术鉴定龙眼体胚发生过程
中的miRNAs[OL/EB]. 中国科技论文在线 . http://www.paper.edu.
cn/index. php/default/releasepaper/content/201102-64.
[2] Heike W, Detlef W. Small RNAs in flower development [J].
European Journal of Cell Biology, 2010， 89： 250-257.
[3] Poethig R S. Small RNAs and developmental timing in plants[J].
1302- -
第 7 期
Current Opinion in Genetics & Development, 2009, 19 （4）:
374-378；
[4] Jung J H, Seo Y H, Seo P J, et al. The GIGANTEA-regulated
microRNA172 mediates photoperiodic flowering independent of
CONSTANS in Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2007, 19: 2736-2 748.
[5] 孙昌辉, 邓晓建, 方 军， 等. 高等植物开花诱导研究进展[J].
遗传, 2007, 29（10）: 1 182-1 190.
[6] Allen E, Xie Z, Gustafson A M, et al. MicroRNA-directed
phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants[J]. Cell,
2005, 121（2）: 207-21
[7] Schwab R, Palamik J F, Riester M, et al. Specific effects of
microRNAs on the plant transcriptome. Dev Cell, 2005 （8）:
517-527.
[8] Song C N, Wang C, Zhang C Q, et al. Deep sequencing
discovery of novel and conserved microRNAs in trifoliate
orange（Citrus trifoliata）[J]. BMC Genomics, 2010（11）： 431.
[9] Zhao C Z, Xia H, Frazier T P, et al . Deep sequencing
identifies novel and conserved microRNAs in peanuts （Arachis
hypogaea L.）[J]. BMC Plant Biology, 2010（10）： 3.
[10] Wu L, Zhou H Y, Zhang Q Q, et al. MicroRNA mediates DNA
methylation pathway[J]. Molecular Cell, 2010（38）： 465-475.
[11] Dezulian T, Palatnik J F, Huson D, et al. Conservation and
divergence of microRNA families in plants[J]. Genome biology,
2005（6）： 13.
[12] 陈晓东, 林玉玲, 赖钟雄. 利用Solexa测序技术鉴定 柑 橘 试 管
苗叶片中的miRNAs[OL/EB]. 中国科技论文在线 . http://www.
paper. edu. cn/index.php/default/releasepaper/content/2011 02 -
408.
[13] Alvarez-Garcia I, Miska E A. MicroRNA functions in animal
development and human disease [J]. Development, 2005 （132）：
4 653-4 662.
[14] Zhang X, Henderson I R, Lu C, et al. Role of RNA
polymerase IV in plant small RNA metabolism [J]. Proc Natl
Acad Sci USA, 2007, 104（11）: 4 536-4 541.
[15] Jia X Y, Wang W X, Ren L G, et al . Differential and
dynamic regulation of miR398 in response to ABA and salt
stress in Populus tremula and Arabidopsis thaliana [J]. Plant
Mol Biol, 2009（71）： 51-59.
[16] Liu Q, Chen Y Q. Insights into the mechanism of plant
development: interactions of miRNAs pathway with phytohormone
response[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009（384）： 1-5.
[17] Dharmasiri N, Dharmasiri S, Estelle M. The F-box protein TIR1
is an auxin receptor[J]. Nature, 2005（435）： 441-445.
责任编辑： 古小玲
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