全 文 ：［收稿日期］ 20120718(005)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(81060357)
［第一作者］ 曾春晖，硕士，副教授，硕士研究生导师，从事中草药抗菌作用及其机制和中药炮制药理研究，Tel:0771-2219854，E-mail:
chhzeng@ 163. com
广西藤茶总黄酮对金黄色葡萄球菌抗菌机制研究
曾春晖1，杨柯2，徐明光2，陈益清2，吴光2，钟振国2
( 1. 广西医科大学药学院，南宁 530021; 2. 广西中医药大学药学院，南宁 530001)
［摘要］ 目的:研究广西藤茶总黄酮(TF)抗金黄色葡萄球菌(SA)作用机制，从而初步明确其作用靶位。方法:使用不同
终质量浓度 TF(310 ～ 38. 75 mg·L －1)处理 SA，另设不经药物处理的 SA为对照，采用扫描电镜法观察 155 mg·L －1 TF对菌体的
超微形态结构，微生物粘着碳氢化合物法测定 155 mg·L －1 TF对菌体表面疏水性，电导率法测定 77. 5，155，310 mg·L －1 TF对
菌体通透性及比色法测定 38. 75，77. 5，155，310 mg·L －1 TF对细菌脱氢酶活性的影响。结果:随着药物浓度增加，作用时间
延长，细菌菌体超微形态有明显改变，表现为菌体表面粗糙不平，产生瘤状突起，细胞间界限模糊不清，细胞直径变大等;与不
经药物处理的 SA比较，TF作用 SA 4，8，16 h后，能明显降低细菌细胞表面疏水性(P ＜ 0. 01) ;明显增加细菌细胞通透性;明显
抑制细菌脱氢酶的活性。结论:广西藤茶总黄酮可能通过降低细菌表面疏水性，增加细菌通透性使细菌形态发生改变，并通
过抑制细菌脱氢酶活性发挥抗菌作用。
［关键词］ 金黄色葡萄球菌;超微结构;疏水性;通透性;脱氢酶;广西藤茶总黄酮
［中图分类号］ Ｒ285． 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)10-0249-04
［doi］ 10． 11653 /syfj2013100249
Antibacterial Mechanisms of Total Flavonoids from
Ampelopsis grossedentata on Staphylococcus aureus
ZENG Chun-hui1，YANG Ke2，XU Ming-guang2，CHEN Yi-qing2，WU Guang2，ZHONG Zhen-guo2
(1. School of Pharmaceutical Sciences，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China;
2. Pharmacy School，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China)
［Abstract］ Objective:To investigate the antibacterial mechanisms of total flavonoids (TF) from
Ampelopsis grossedentata on Staphylococcus aureus． Method:The antibacterial mechanisms were studied by
scanning electron microscope for ultrastructural morphology of TF (155 mg·L －1)． Microbial adhesion method was
used for determination the effect of TF (155 mg·L －1)on cell-surface hydrophobicity of hydrocarbons． Cell
permeability and conductivity colorimetric method were employed for the determination of dehydrogenase activity of
S． aureus after being treated by different concentrations of total flavone (310-38. 75 mg·L －1) from Ampelopsis
grossedentata of Guangxi． Ｒesult:As the concentration increased and time prolonged，bacterial cell ultrastructural
change was evident，characterized by cell surface uneven，warty protrusions，intercellular boundaries blurred，cell
diameter increase． TF could significantly reduce the bacterial cell-surface hydrophobicity (P ＜ 0. 01)and increase
in permeability of the bacterial cell． Activity of bacterial dehydrogenase was obviously inhibited by TF．
Conclusion:The antibacterial mechanisms of TF from Ampelopsis grossedentata on S． aureus are related with
reducing surface hydrophobicity，increasing permeability of the bacterial and inhibiting dehydrogenase activity of S．
aureus．
［Key words］ staphylococcus aureus; ultrastructural morphology; hydrophobicity; permeability;
dehydrogenase;total flavonoids from Ampelopsis grossedentata of Guangxi
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2013 年 5 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 10
May，2013
金黄色葡萄球菌(SA)可以引起包括常见的肺
组织深部感染、术后感染、毒素休克综合征、全身菌
血症和菌群失调等人类多种感染性疾病。据美国疾
控中心报告，由 SA引起的感染占第 2 位，仅次于大
肠杆菌。多种抗生素因对 SA 具有很好的杀菌作用
曾作为治疗其感染的特效药物广泛用于临床。但随
着抗生素的广泛使用，细菌耐药性，如具有耐多重耐
药性的耐甲氧西林金葡菌(MＲSA)的出现，已经成
为全球性的棘手问题。笔者前期研究结果表明，广
西藤茶黄酮类化合物单体［1-2］(简称 APS)和总黄酮
(简称 TF，另文发表)具有良好的抗 SA 作用，本文
重点探讨 TF抗 SA的作用机制。
1 材料
1. 1 菌株的准备 金黄色葡萄球菌(ATCC29213，
SA) ，由广西中医药大学微生物与免疫学教研室提
供，挑取 1 ～ 2 个 SA 菌落于 20 mL M-H 肉汤培养
基，35 ℃振荡培养过夜，次日 1 500 r·min －1离心
5 min收集菌液，弃去上清液，用灭菌生理盐水校正
浓度至 0. 5 麦氏比浊标准，再用 M-H 肉汤以 1∶ 100
稀释(含菌量约 1 × 106CFU·mL －1)。
1. 2 药物的配制 藤茶植物经广西中医药大学药
用植物教研室韦松基教授鉴定为葡萄科蛇葡萄属植
物显齿蛇葡萄 Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz)
W． T． Wang的嫩茎叶，藤茶总黄酮(TF)由广西中医
药大学中药化学教研室韦建华副教授分离提取，纯
度 ＞ 95%，为淡黄色粉末。取一定量的 TF 用生理
盐水配成最低抑菌质量浓度(MIC) (即 310 mg·
L －1)溶液后，0. 22 μm针式过滤器过滤除菌备用。
1. 3 试剂和仪器 M-H 肉汤培养基(北京陆桥技
术有限责任公司，批号 20100806) ，十六烷(国药集
团化学试剂有限公司，批号 20110816) ，氯化三苯基
四氮唑(TTC，中国华东师范大学化工厂，批号
20101026) ，甲苯(国药集团化学试剂有限公司，批
号 20080921) ，其他试剂均为分析纯。VEGA3 型电
子扫描显微镜(Tescan 公司) ，DDS-11A 型电导率仪
(上海沪粤明科学仪器有限公司) ，UV-1800 型紫外
分光光度计(日本岛津公司) ，AE100 型 1 /万电子分
析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司) ，DNP-
9082 型恒温培养箱(上海恒勒仪器设备有限公司) ，
SHA-B型恒温水浴振荡器(江苏省金坛市环宇科学
仪器厂) ，SW-CJ-1F 型生物安全柜(阿尔泰实验室
设备有限公司)。
2 方法
2. 1 对 SA超微形态结构的影响 取 5 mL 配好的
菌悬液加入 25 mL 锥形瓶中，最终接种菌量约 5 ×
106CFU。随后加入 TF 药液 5 mL，使药物终质量浓
度为 1 /2 MIC(即 155 mg·L －1) ，另设细菌对照组
(加入5 mL生理盐水)。轻轻混匀后，于 35 ℃恒温
培养箱中恒温培养，分别在加入药物前和后 2，8，16
h取样，3 000 r·min －1离心 5 min 收集菌体，实验重
复 3 次。菌团用 PBS洗涤 3 次，戊二醛固定，4 ℃冰
箱保存。扫描电镜样品需脱水处理，方法为:先加入
25%戊二醛水溶液使其终质量浓度为 2. 5%，37 ℃
固定 30 min 后用 PBS 漂洗细菌 2 次;然后沿管壁
小心加入梯度乙醇(30%，50%，70%，80%，90%，无
水乙醇)和叔丁醇(50%，70%，90%，95%，100%)
进行脱水固定，最后将固定好的细菌悬液直接滴到
铝片上，放入 － 20 ℃无霜冰箱干燥 1 h，使叔丁醇挥
发即得到电镜样品。将样品喷金 30 s，上 VEGA3 型
电子扫描显微镜，观察细菌细胞体的超微形态。
2. 2 对 SA表面疏水性的影响［3］ 取配好的菌悬
液，细菌培养及分组、药物终质量浓度同 2. 1。实验
重复 3 次。分别在加入药物前和后 2，8，16 h 取样，
取出2 mL菌液于 5 mL离心管中，5 000 r·min －1离心
10 min，用 0. 1 mol·L －1 KNO3(pH 6. 2)将细菌清洗
2 次，5 000 r·min －1离心 10 min，将沉淀重新悬于
0. 1 mol·L －1 KNO3(pH 6. 2) ，使吸光度 A400 = 0. 4
(A0) (0. 4 左右)。用 pH 7. 4 的 10 mmol·L
－1磷酸
钠缓冲液(NAPB)作为对照。取 4 mL 细菌悬浮液
加入0. 2 mL十六烷，室温下静置 10 min，然后在旋
涡振荡器振荡混合 2 min。待混合物完全两相分离
后移出水相并测其 A400(A1)。以细菌吸附率作为细
菌细胞表面疏水性指标。
细菌吸附率 =(1 － A1 /A0)× 100%
2. 3 对 SA细菌细胞膜通透性的影响［4］ 取 5 mL
配好的菌悬液，5 000 r·min －1离心 5 min，取上清液
2 mL用去离子水稀释 20 倍，测定电导率为 L2;取
5 mL配好的菌悬液和 5 mL 配置好的 TF 高、中、低
药液(终质量浓度为 310，155，7. 5 mg·L －1)作用，
5 000 r·min －1离心 5 min，取上清液 2 mL 用去离子
水稀释 20 倍，测定电导率为 L3;取 5 mL 去离子水
加 5 mL配置好的 TF高、中、低药液(终质量浓度为
310，155，77. 5 mg·L －1) ，5 000 r·min －1离心 5 min，
取上清液2 mL用去离子水稀释 20 倍，测定电导率
为 L1;将 SA 沸水浴煮沸 10 min，冷却后 5 000 r·
min －1离心5 min，取上清液 2 mL用去离子水稀释 20
倍，测定电导率为 L0。相对电导率按以下公式
计算。
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中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 10
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相对电导率 =│(L3 － L2 － L1)/L0│
2. 4 对 SA 细菌脱氢酶的影响［3］ 于 25 mL 的已
灭菌具塞的锥形瓶中加入 20 mL 已灭菌的 M-H 肉
汤和 200 μL 配置好的 SA 菌悬液，培养过夜活化，
待用。在灭菌具塞试管中加入 1 mL 的 SA 菌液后
再依次加入 2 mL 0. 05 mol·L －1的 Tris-HCl缓冲液、
2 mL 0. 1 mol·L －1葡萄糖溶液、2 mL 1 g·L －1的氯化
三苯基四氮唑(TTC)。在各试管中加入 TF 溶液
1 mL，终质量浓度分别为 310，155，77. 5，38. 75 mg·
L －1，另设加 1 mL去离子水管做空白对照，各试管混
匀后放入 37 ℃恒温静置 1 h 后，加入 2 滴浓 H2SO4
终止反应后，用 5 mL 甲苯振荡萃取，取各试管中的
上层有机物层，4 000 r·min －1离心 5 min，以甲苯为
参比，490 nm处比色，记录 A。
2. 5 统计学处理 采用 SPSS 11. 0 软件，数据以
珋x ± s表示，组间比较采用 t 检验，P ＜ 0. 05 为有统计
意义。
3 结果
3. 1 对 SA超微形态结构的影响 正常形态的 SA
呈单个圆球形，密集呈葡萄串状，表面光滑圆润，排
列紧密，细胞界限清晰明显，大小均一，其直径为
0. 55 ～ 0. 70 μm。TF作用 2 h后，大部分 SA细胞都
有变化，细胞表面变得粗糙，有瘤状突起，细胞间界
限变得不明显，少见有正常形态的细胞。细胞的直
径变大，为 0. 8 ～ 1. 3 μm 左右。TF 作用 8 h 后，SA
细胞表面粗糙，瘤状突起变多且明显，细胞间界限不
明显，有少部分细胞呈破裂状，未见正常形态的细
胞。细胞的直径变化较大，为 0. 65 ～ 1. 1 μm 左右。
TF作用 16 h后，SA细胞表面粗糙不平，瘤状突起明
显，细胞间界限模糊不清，有很多细胞破裂，有些细
胞成熔融状，且细菌分散，不成串状，未见有正常形
态的细胞。细胞的直径变化较大，大小为 0. 8 ～ 1. 4
μm左右。TF 作用 SA 后，会造成细胞表面粗糙不
平，产生瘤状突起，细胞间界限模糊不清，细胞直径
变大，随作用时间延长，细菌细胞表面受损加重，结
果见图 1。
A. 正常 SA;B. TF作用 2 h;
C. TF作用 8 h;D. TF作用 16 h
图1 155 mg·L －1TF作用不同时间
对 SA超微形态结构的影响
3. 2 对细菌表面疏水性的影响 TF 作用于 SA 4，
8，16 h 后，与不经药物处理细菌比较，药物处理后
细菌吸附率明显降低(P ＜ 0. 01) ，相对不经药物处
理的 SA 分别下降了 28. 0%，24. 0%，35. 6%。见
表 1。
表 1 TF作用不同时间对 SA表面疏水性的影响(珋x ± s，n = 8)
组别
终质量浓度
/mg·L －1
4 h 8 h 16 h
A 吸附率 /% A 吸附率 /% A 吸附率 /%
正常 － 0. 064 5 ± 0. 005 84. 35 0. 058 8 ± 0. 005 85. 29 0. 051 9 ± 0. 003 86. 97
TF 155 0. 156 8 ± 0. 0031) 60. 76 0. 141 0 ± 0. 0051) 64. 81 0. 176 1 ± 0. 0041) 56. 01
注:与正常组比较1)P ＜ 0. 01。
3. 3 对细菌通透性的影响 培养液电导率的改变
可以反映细胞膜渗透性的变化，TF 作用 SA 后电导
率随着作用时间的延长而增大，说明 TF 可使菌体
细胞膜的通透性增加，使菌体细胞质渗漏到细胞外，
不经药物处理细菌的培养液电导率无明显变化，见
图 2。
3. 4 对细菌脱氢酶的影响 结果显示，SA 在加入
低浓度的 TF溶液时仍然有部分 TTC 转化为三苯基
甲脂，随着 TF 浓度增加，脱氢酶活性逐渐减弱，由
此可知，低浓度的 TF 溶液能够影响细菌脱氢酶的
图 2 不同质量浓度 TF作用不同时间对 SA相对电导率的影响
活性从而影响细菌的正常生命代谢，当 TF 达到一
定浓度时，可完全抑制细菌的活性，使其新陈代谢过
·152·
曾春晖，等:广西藤茶总黄酮对金黄色葡萄球菌抗菌机制研究
程终止从而死亡。见图 3。
图 3 不同质量浓度 TF对 SA脱氢酶活性的影响
4 讨论
除支原体外，几乎所有的细菌都有细胞壁。革
兰阳性细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，在生长繁
殖期大量合成，它使得这层壁坚韧并富有弹性。肽
聚糖的合成过程分 3 个连续步骤［5-6］，在细胞的不同
部位进行。第 1 步在细胞质内进行;第 2 步在细胞
质膜上进行;第 3 步在转肽酶参与下，在细胞膜外进
行。细菌细胞壁的主要功能是保护细胞、维持细胞
形状、协助鞭毛运动等，而且还与细菌的抗原性、致
病性和对噬菌体的敏感性有关;细菌表面带有一定
量的负电荷，其表面带的负电荷越多，吸附百分率越
大，细菌的吸附性越强，则其致病可能性越大［7-8］;
细菌培养液电导率的改变可以反映细胞膜渗透性的
变化，通过电导率的测定，可以评价药物对细菌细胞
膜通透性的影响［9-10］;脱氢酶是一类催化物质氧化
还原反应的酶，生物体中绝大多数氧化还原反应都
是在脱氢酶及氧化酶的催化下进行。物质经脱氢酶
催化氧化，最后通过电子传递链而被氧氧化，此时通
过氧化磷酸化作用生成三磷酸腺苷(ATP) ，这是异
养生物体取得能量的主要途径。脱氢酶是细菌呼吸
代谢过程中所必需的酶，以脱氢酶催化氯化三苯基
四氮(TTC)生成三苯基甲脂的量可衡量脱氢酶的活
性，从而反映细菌细胞被破坏的程度［11］。
本实验结果显示，TF 能降低细菌的吸附率，可
能和 TF本身的结构有关，TF带有阳离子基团，能够
中和细菌的表面负电荷，吸引细菌表面带负电荷的
基团趋向表面分布进行重排，导致细菌表面疏水性
下降，从而降低了细菌的吸附率;加入 TF 后，菌液
的电导率增加，说明 TF 可使菌体细胞膜的通透
性增加，使菌体细胞质渗漏到了细胞外，究其原因，
可能是 TF诱导产生了某些降解细胞壁和细胞膜的
酶所致。综上所述，TF抗菌机制与其降低细菌表面
疏水性、增加细菌通透性使细菌细胞壁形态发生缺
失或异常有关，并通过抑制细菌脱氢酶活性，削弱甚
至终止细菌的新陈代谢而发挥抗菌作用。
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［责任编辑 李玉洁］
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