全 文 ：土槿皮乙酸 B增加活性氧水平诱导人乳腺癌
MCF-7细胞凋亡和衰老的研究
于静华1 ,张亚宏2 ,刘春禹3 ,张文艳1 ,田代真一4 ,小野寺敏4 ,于晓方1 ,池岛乔5
(1.吉林大学白求恩第一医院艾滋病与病毒研究所 , 吉林长春　130021;
2.河南大学天然药物与免疫工程重点实验室 ,河南开封　475004;
3.吉林省中医院针灸科 ,吉林长春　130021;4.昭和药科大学病态科学教研室 ,东京　194-8543;
5.沈阳药科大学中日医药研究所 , 辽宁沈阳 110016)
摘要:本研究旨在研究土槿皮乙酸 B(PAB)诱导人乳腺癌 MCF-7 细胞凋亡和衰老与活性氧的关系。在相差显微镜下观
察 4 μmo l/ L PAB在 36 h 诱导细胞凋亡小体的出现;LDH 方法显示 PAB 时间依赖性的增加凋亡比率;SA-β-半乳糖苷酶显示
4 μmo l/ L PAB 作用 3 d 后 , 去药再作用5 d , 96%的细胞蓝染 ,细胞变大且扁平;流式细胞仪检测用 DCFH-DA 染色后 4 μmo l/
L PAB 时间依赖性增加细胞内活性氧水平。所以 4 μmol/ L PAB 通过增加细胞内活性氧水平促进细胞凋亡和衰老。
关键词:土槿皮乙酸 B(PAB);凋亡;衰老;人乳腺癌 MCF-7细胞;活性氧
中图分类号:Q255　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1671-7236(2011)07-0063-03
　　土槿皮为松科植物金钱松的干燥根皮或近根树
皮 ,土槿皮乙酸(PAB)是从土槿皮中分离得到的新
型二萜酸化合物。研究结果表明 ,土槿皮乙酸具有
抗真菌(Li等 ,1995)、抗肿瘤(Gong 等 , 2005)、抗血
管生成(Tan等 ,2004)、抗微管(Tong 等 ,2006)等药
理作用。本试验证实了土槿皮乙酸诱导人乳腺癌细
胞 MCF-7细胞凋亡和衰老 ,并增加细胞内活性氧水
平 ,为进一步探讨土槿皮乙酸抗肿瘤作用机制提供
了依据。
1　材料与方法
1.1　药品与试剂　土槿皮乙酸B(pseudolarix acid B)
购于中国药品生物制品检定所;应用时用二甲基亚砜
(DMSO)溶解 ,并使 DMSO的终浓度低于 0.1%。二
甲基亚砜(DMSO)为 Sigma产品;2 ,7-Dichlo rofluo-
rescin Diacetate (DCFH-DA)和衰老检测试剂盒为
Calbiochem 产品 。RPMI 1640培养基(Gibco ,USA),
胎牛血清(北京元亨圣马生物试剂公司)。
修回日期:2011-05-10
作者简介:于静华(1978-),女 ,吉林人 ,博士 , 主要从事肿瘤分
子药理学研究。
通信作者:池岛乔(1947-),男 ,教授 , 博士生导师 ,从事免疫药
理学。 Tel:024-23844463;E-mai l:ik ejim at @ vip.
sina.com
于晓方(1959-),男 ,教授 , 博士生导师 ,从事分子病
毒学和肿瘤学。Tel:0431-88782148;E-mai l:yu xiao
fang@jlu.edu.cn
基金项目:吉林省中医药管理局(2010-pt064);国家中医药三级
实验室免疫与分子生物学;省分子病毒学重点实验
室;省卫生厅重点实验生物治疗与基因诊断实验室。
1.2　细胞培养　人乳腺癌细胞(MCF-7)购自美国
American Type Culture Collection(ATCC)。细胞单
层接种在含 10%胎牛血清 、20 g/ L谷氨酰胺的 RPMI
1640培养液中 ,在 37 ℃,5%CO 2培养箱中培养 。
1.3　试验方法
1.3.1　细胞形态学观察　细胞以每孔 1×105个接
种于 6孔板中 ,培养 12 h后 ,加入 0和 4 μmo l/L 的
PAB于 36 h 用光学显微镜观察拍照 。
1.3.2　LDH 试剂盒显示凋亡比率　将 MCF-7细
胞接种于 96 孔培养板中 , 24 h 后加入 4 μmo l/L
PAB作用 12 、24 、36和 48 h后收集不同状态的细胞
加入 LDH 反应液(pH 8.2 ,0.2 mo l/L T ris-HCl 10
mL ,各组的终浓度分别为:L(+)-乳酸 50 mmol/L ,
IN T 0.66 mmo l/L ,PM S 0.28 mmo l/L ,NAD+ 1.3
mmol/L), 分别测定悬浮细胞中的 LDH 的量
(LDHa),作为凋亡指数;上清液中的 LDH 和培养
板中贴壁细胞中的 LDH 的量 (LDHi)。则凋亡百
分率计算如下:
凋亡率(%)=LDHa/(LDHa+LDHi)100%
1.3.3　细胞衰老检测　将 MCF-7 细胞以 1.5×
105个/孔的密度埋入 24 孔板后培养过夜 , 加入 4
μmo l/L PAB作用 3 d 后换入新鲜的培养液 ,继续
培养5 d 。依照衰老试剂盒的方法 ,将细胞弃去培养
液 ,用 PBS润洗一遍后使用 0.5 mL 固定液于室温
下固定 10 ～ 15 min 。用 PBS润洗两遍后 ,每孔加入
混合好的染色液 500μL(470μL 染色溶液 , 5 μL 染
色补充液和 25 μL DMF 溶解的 X-gal(20 mg/
·63·中国畜牧兽医 　2011 年第 38卷第 7期 生理生化
mL))。在无 CO 2 ,37 ℃的条件下染色过夜后 ,在倒
置显微镜下观察细胞内蓝染情况 ,计算每 100 个细
胞内蓝染数目。
1.3.4　细胞内活性氧检测 　将 DCFH-DA 溶于
DMSO 配成 1 mmol/ L 母液 , -20 ℃保存 。试验时
用 PBS稀释成 5 μmol/L 工作液 ,与收集的细胞 37
℃孵育 30 min ,然后流式细胞仪检测 ,检测激发波
长 513 nm ,发射波长 530 nm 。检测时设 M1 门 ,随
着活性氧水平的增加 ,峰形向 M1门移动。
1.3.5　统计分析　如无特殊提示 ,所有试验结果均
得自 3次独立试验 ,方差表示为 X SD。
2　结果与分析
2.1　PAB诱导MCF-7细胞凋亡　LDH 试验结果显
示 ,4 μmol/L PAB作用不同时间后 ,时间依赖性的增
加 MCF-7细胞的凋亡率(图 1A)。并且在显微镜下
观察到正常阴性对照组细胞形态完整 ,细胞连接紧
密 ,没有细胞死亡(图 1Ba)。而 4 μmol/L PAB 作用
36 h后 ,细胞数目减少 ,有凋亡小体的出现(图 1Bb)。
图 1　PAB 诱导MCF-7 细胞凋亡
注:A , LDH 试验证明 4μmol/ L PAB时间依赖性的增加凋亡率;B ,相差显微镜观察细胞形态 ,其中 a为阴性对照组;b为 4μmol/ L PAB
作用 36 h 促进凋亡小体的出现 ,箭头表示凋亡小体。
2.2　PAB诱导 MCF-7 细胞衰老　用衰老试剂盒
检测阴性对照组没有蓝染 ,证明细胞没有衰老(图
2A)。4μmol/ L PAB作用 3 d后 ,去液培养 5 d ,经
细胞衰老试剂盒检测 96%细胞浆内有蓝染出现 ,并
且细胞变大扁平 ,证明细胞发生衰老(图 2B)。
图 2　PAB 诱导MCF-7 细胞衰老
注:A ,阴性对照组;B , 4μmol/ L PAB作用 3 d后 ,更换新鲜培养液作用 5 d ,用衰老检测试剂盒检测到细胞内有蓝染出现。
2.3　PAB 增加细胞内活性氧水平 　4 μmol/ L
PAB作用 0 h 细胞活性氧水平为 2.85%;而作用
12 、24 、36 、48 h 后活性氧水平分别为 8.09%、
14.32%、25.31%、29.41%(图 3)。
3　讨论与小结
MCF-7是 caspase-3功能性缺失 , p53野生的人
乳腺癌细胞(Janicke等 ,1998),一般 caspase-3主要
参与凋亡过程 ,而 p53 参与衰老过程。土槿皮乙酸
(PAB)具有抗肿瘤作用 ,其抑制肿瘤细胞生长的方
式主要通过凋亡(Cao 等 ,2008;Gong 等 ,2006),但
本研究选用 MCF-7细胞进行凋亡和衰老研究。细
胞凋亡(apoptosis)是特殊的细胞死亡方式 ,是在基
因控制下的主动死亡(Zo rnig 等 , 2001;Johnstone
等 ,2002)。 caspase 家族蛋白和 p53 蛋白等在凋亡
的信号转导中扮演着重要的角色。 caspase 是一组
存在于胞质中的半胱氨酸蛋白酶 ,包括很多成员 ,而
caspase-3在凋亡中起着重要作用 。细胞衰老(cel
lular senescence)是细胞因不同应激而产生的细胞
·64· 生理生化 中国畜牧兽医 　2011 年第 38 卷第 7 期
图 3　PAB增加MCF-7 细胞内活性氧水平
注:流式细胞仪分析显示 4μmol/ L PAB时间依赖性的增加活性氧水平。 a , 0 h;b , 12 h;c , 24 h;d , 36 h;e , 48 h。
周期阻滞程序。导致细胞衰老的因素分为内在因素
和外在因素两方面 ,其中由于过度增殖导致端粒变
短引起的细胞衰老被称为“复制型衰老”(replicative
senescence),而由于 DNA 损伤 、氧化应激 、癌基因 、
营养和生长因子的缺乏 、不恰当的细胞接触及药物
刺激等外界因素引发的被称为“应激引发型衰老”
(stress-induced premature senescence)(Bauvy 等 ,
2001;Perfett ini等 ,2004;It tai等 ,2001)。衰老与凋
亡是机体防止肿瘤发生的两种手段。研究中发现 ,
PAB诱导凋亡的发生 , 而这个过程是不依赖
caspase-3的;同时也发现 PAB 作用后 ,有一部分细
胞存活下来 ,这部分细胞在去药培养后不再增殖 ,且
用细胞衰老特异性半乳糖苷酶染色为阳性 ,说明这
部分细胞已经衰老。活性氧(ROS)水平参与许多生
化过程 ,包括正常的细胞生长 ,细胞状态的调节 ,凋
亡和衰老(Finkel , 2003);发现 PAB 时间依赖性的
增加细胞内活性氧水平 ,说明细胞内活性氧的增加
可能是细胞凋亡和衰老的原因 。
参 考 文 献
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2　Cao B, J iang M C , Lei Z Y , et al.Ef fects of PLAB on apoptosis
and smad signal pathw ay of hypert rophic scar fib roblast s [ J] .J
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·65·中国畜牧兽医 　2011 年第 38卷第 7期 生理生化
黄芪多糖注射液对猪瘟耐热保护剂活疫苗
在兔体内免疫效果的影响
朱辉1 ,2 ,沈志强1 , 2 , 3 ,王振勇1 ,马霞2 ,郭振环2
(1.山东农业大学动物科技学院 ,山东泰安　271000;2.山东省滨州畜牧研究院 ,山东滨州　256600;
3.山东绿都生物科技有限公司 , 山东滨州　256600)
摘要:试验旨在研究黄芪多糖(astrag alus po ly saccharide , APS)注射液作为猪瘟疫苗稀释液及黄芪多糖作为疫苗佐剂提供
数据支持。用 1%的黄芪多糖注射液 、猪瘟疫苗专用稀释液 、生理盐水 3 种不同猪瘟疫苗稀释液稀释兔源猪耐热保护剂活疫
苗免疫兔体 ,比较免疫后不同时间段内血液中的淋巴细胞的活性及血清中的猪瘟抗体 、白介素 2(inte rleukin 2 , IL-2)、白介素 6
(inter leukin 6 , IL-6)、γ干扰素(interfer on γ, IFN-γ)、新蝶呤(neopterin , Npt)水平 ,综合评价 3 种不同猪瘟疫苗稀释液对兔源
猪瘟耐热保护剂活疫苗在兔体内免疫效果的影响。结果表明 ,黄芪多糖能不同程度的提高抗体水平和多种细胞因子的含量。
因此 ,黄芪多糖注射液可以作为猪瘟疫苗稀释液或改良现有猪瘟疫苗稀释液 ,黄芪多糖也可以作为猪瘟疫苗佐剂。
关键词:黄芪多糖;淋巴细胞活性;抗体;白介素;干扰素;新蝶呤
中图分类号:S816.7　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1671-7236(2011)07-0066-05
　　黄芪多糖(ast rag alus po lysaccharide , APS)是
中药黄芪的主要天然生物活性成分 ,具有增强机体
免疫功能 、升高白细胞和淋巴细胞数量 、提高淋巴细
收稿日期:2010-12-31
作者简介:朱辉(1983-),男 , 山东人 ,硕士生 , 研究方向:临床
免疫。
通信作者:沈志强 ,研究员 ,博士生导师 ,研究方向:兽医生物制
品研制。 E-mai l:bzshenzq@163.com
王振勇 ,副教授 ,硕士生导师 , 研究方向:动物营养代
谢病。 E-mai l:w zy@sdau.edu.cn
胞转化率和巨噬细胞活性 、诱导干扰素产生等作用
(Qiu等 ,2007);对多种疫苗具有免疫增强的辅助效
果(林树乾等 ,2006)。本试验主要目的是观察 A PS
注射液对兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗在兔体内免疫
效果影响 ,探索 APS 注射液作为一种猪瘟疫苗稀释
液及 APS 作为猪瘟疫苗佐剂的可行性。
1　材料与方法
1.1　主要试剂　猪瘟耐热保护剂活疫苗(兔源)、猪
瘟专用稀释液均由山东某生物科技有限公司提供。
Pseudolaric Acid B Induced Apoptosis and Senescence
Through ROS in MCF-7 Cells
YU Jing-hua1 , ZHANG Ya-hong2 , LIU Chun-yu3 , ZHANG Wen-yan1 , Tashiro Shin-ichi4 ,
Onodera Satoshi4 , YU Xiao-fang 1 , Ikejima Takashi5
(1.Research Institute of H IV and Virus , The F ir st Hospital of Jilin Univer sity , Changchun 130021 , China;
2.Key Labo rato ry o f Natural Medicine and Immuno-Eng ineering , Henan Unive rsity , Kaifeng 475004 , China;
3.Acupunture , The A ffiliated Hospital to Changchun Unive rsity of Chine se Medicine , Changchun 130021 , China;
4.Dept of Clinical and Biomedical Science s , Showa Pha rmaceutical Univer sity , Tokyo 194-8543 , Japan;
5.China-Japan Resear ch Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences , Shenyang Pharmaceutical Univ ersity ,
Shenyang 110016 , China)
Abstract:To study the r elationship o f ROS and pseudo la ric acid B (PAB)-induced MCF-7 ce ll apoptosis and sene scence.
Contrast phase micr oscope w as used to observ e cellula r morphologic alternation;LDH assay was pe rformed to asse ss apopto sis
ratio;galacto sidase staining show ed cell senescence;and flow cytome tric analy sis of DCFH-DA staining de te rmined the level o f
ROS.We found that PAB induced MCF-7 cell apoptosis in time-dependent manner.4μmol/ L PAB treated MCF-7 for 3 d , then
replace PAB with fr esh DM EM fo r 5 d , cell became senescence.PAB increa sed ROS level in time dependent manner.There-
fo re , PAB increa sed ROS level to induce apopto sis and senescence.
Key words:pseudo laric acid B;apoptosis;senescence;MCF-7;ROS
·66· 生理生化 中国畜牧兽医 　2011 年第 38 卷第 7 期