全 文 ：收稿日期:2014-08-28; 修订日期:2015-03-05
基金项目:国家自然科学基金(No． 81301726)
作者简介:王 冰(1978-)，男(汉族)，河南驻马店人，河南中医学院第一
附属医院主治医师，硕士学位，主要从事中西医结合治疗恶性肿瘤和血液
系统疾病的工作．
* 通讯作者简介:臧文巧(1979-)，女(汉族)，河南郑州人，郑州大学基础
医学院副教授，硕士学位，主要从事肿瘤基础与临床研究工作．
基于藤梨根提取物调控 miＲ-21
干预食管癌细胞 Ec9706cDDP的研究
王 冰1，关徐涛1，2，王 涛1，臧文巧3*
(1．河南中医学院第一附属医院，河南 郑州 450000; 2．山东中医药大学，山东 济南 250000;
3．郑州大学基础医学院，河南 郑州 450000)
摘要:目的 运用现代技术观察藤梨根提取物能否降低耐药细胞株 miＲ － 21 基因的表达水平逆转食管癌细胞的多药耐
药。方法 用 MTT法检测藤梨根提取物(ＲAE)无明显细胞毒剂量，并用无细胞毒性的剂量进行逆转耐药试验;将加 ＲAE
与不加 ＲAE所得两组数据进行线性回归的统计方法分别计算出各组的抑制一半时抑制剂的浓度也就是 IC50，计算逆转
倍数 =对照组 IC50 /实验组 IC50。结果 对照组的 90% miＲ － 21 基因呈高水平表达，只有 10%呈低水平表达;实验组的 10
个样本中有 20% miＲ － 21 基因呈高水平表达，其余 80%呈低水平表达。应用统计学系统分析后显示 miＲ － 21 基因在实
验组和对照组的表达程度上有显著性差异(P ＜ 0． 05)。结论 当剂量浓度为 10μg /ml 时，使用藤梨根提取物对其作用
48h以后，实验用细胞对顺铂的耐药达到了部分逆转，其倍数为 1． 68。且实验的基因测定显示:目的基因 miＲ － 21 的表
达的水平下调，可能是其实现逆转的分子基础。
关键词:藤梨根提取物; 食管癌; Ec9706cDDP细胞; miＲ － 21
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 06． 096
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)06-1512-03
食管癌是临床较为常见的恶性肿瘤［1］。食管癌主要有两大
病理类型:食管鳞癌以及食管腺癌，由于流行病学的不同，食管腺
癌主要发生于西方国家，在近 20 年中发病率明显增加，但是具体
原因并不完全清楚［2］。食管鳞癌主要发生于发展中国家［3］，全
球每年新确诊 30 万例是食管鳞癌患者，一半以上发生在我国，其
中以我国北部太行山区发病率最高［4，5］。肿瘤多发现于中晚期，
根治性手术治疗已难以实现，早期发现难度较大，而中晚期的病
人五年生存率较低且复发转移率较高，放疗亦有相当的局限性。
基于这些，化疗仍是临床最常采用的手段。随着近些年来各种新
型药物的投入使用以及各种联合化疗方案的临床总结优化，肿瘤
患者的近期控制效果有所提升。顺铂具有细胞毒性，主要作用靶
点为 DNA，与之结合引发 DNA链间或者链内交链，与 DNA 结合
形成 DDP － DNA复合物，阻碍肿瘤遗传物质的扩增，阻滞其生长
进程并加速其死亡［6］。中医作为中国发展数千年的传统医药文
化，中药抗癌的经验也十分丰富。
miＲ － 21 属单基因编码，其编码基因位于 17q23，长度为 22
个核苷酸，参与了细胞的增殖、分化和凋亡，研究发现 miＲ － 21
与大多数的肿瘤有关［7］。通过对肿瘤组织或癌细胞株中 miＲ-
NAs表达谱的研究发现，miＲ － 21 在肝癌、肠癌、胃癌、胆管癌等
多种肿瘤中比癌旁正常组织表达明显增高［8 ～ 10］。而且 miＲ － 21
在肿瘤的浸润和转移中也有十分重要的作用。近期越来越多的
研究表明 miＲ － 21 在消化道肿瘤的关系更为密切。
现代肿瘤耐药研究主要借助于实验室诱导的各种耐药肿瘤
细胞株。郑州大学李敏等［11］采用间歇冲击法，用顺铂诱导产生
了该药耐药食管癌细胞系，命名为 Ec9706 /cDDP，进一步测定了
该细胞系耐药指数，达到 15． 7。本课题将藤梨根打碎阴干制成
藤梨根提取物，主要含三萜类化合物，并以体外培养的 Ec9706 /
cDDP细胞作为研究对象，对细胞进行分组，分为对照组和实验
组，实验组经过藤梨根提取物的处理，用 MTT的方法来检测藤梨
根提取物的细胞的毒性作用，来找到无毒的浓度进行细胞的逆转
的耐药试验。
1 材料与仪器
1． 1 材料 藤梨根(购自河南中医学院第一附属医院中药房)1
kg阴干并粉碎备用，青霉素、链霉素双抗培养液，正丁醇、AMV
(逆转录酶)、Taq酶、PCＲMarker、琼脂糖、随机六聚体引物等。
1． 2 主要仪器 PCＲ 仪、流式细胞仪、高速台式离心机、比色仪、
凝胶成像系统、电子分析天平、凝胶成像系统等。
2 方法
2． 1 Ec9706 /cDDP细胞的培养［6］ 用胎牛血清的含量为 10%的
编号为 ＲPMI － 1640 的培养基(内含青霉素 100 U /ml，链霉素
100U /ml，谷氨酰胺 110μg /ml 来培养 Ec9706 /cDDP 细胞系培在
其中加入 0． 5μg /ml浓度的顺铂溶液。在温度为 37 ℃，二氧化碳
浓度为 5%湿度达到饱和湿度的培养箱中培养，本研究所进行的
实验于停止加入顺铂 2 周后，于细胞数增长于对数生长期进行实
验研究。
2． 2 藤梨根提取物的制备［12］ 将藤梨根(购自河南中医学院第
一附属医院中药房)1 kg 阴干并粉碎备用。用 2000ml 正丁醇浸
泡藤梨根 500g 24h;加热并回流提取 1h，过滤;经过反复多次的
加热回流提取得到原液(500ml，1g /ml，pH = 3． 8)。分别将原液
用 ＲPMI － 1640 培养液进行稀释得到 1，5，10，100，1000μg /ml 五
个浓度置于冰箱进行备用。
2． 3 MTT法检测藤梨根提取物细胞毒性作用［13］ 取对数生长期
的细胞(经过胰蛋白酶消化后)，将 Ec9706 /cDDP 的细胞悬液 2
× 105 /ml，接种于 96 孔板中。每孔加入细胞 100μl，其作用浓度
分别为 1，5，10，100，1000μg /ml 的藤梨根提取物，再加入培养基
至其总量为 200μl，各个浓度分别均设 3 个平行复孔为空白对照
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组，MTT溶液 (5g /L)20μl分别加入每孔中，继续培养 4h后终止
培养，应用平板离心机离心后弃上清液，每孔分别加入 DMSO(二
甲基亚砜)150μl使得中止反应，振荡 10min 后比色，在电子显微
镜下观察结晶完全溶解，选择 570nm于酶标仪上测定吸光度(OD
值)实验分别重复 3 次，以空白对照孔调零，以 OD值直接反应存
活细胞数量，记录结果计算各个浓度藤梨根提取物对细胞的抑制
率(IＲ)其计算公式如下抑制率(%)=(对照孔 OD 值 －用药孔
OD值)/对照孔 OD值 × 100%
应用统计学处理藤梨根提取物的浓度与抑制率之间的线性
回归关系。
2． 4 耐药逆转实验 MTT法检测(同前)，取调整细胞浓度为 2 ×
105 /ml(经过胰蛋白酶消化后)，在实验组和对照组中分别加入
DDP 浓度为 1，5，10，20，40，80μg /ml，其中在实验组中加入
ＲAE10 μg /ml，设空白对照组，每种实验浓度分别设有 3 个平行
复孔进行对照。药物作用 24h后，根据两组数据应用统计学线性
回归分析并计算出各组半数抑制浓度(IC50)，计算逆转倍数 =对
照组 IC50 /试验组 IC50。
2． 5 ＲT － PCＲ法检测 miＲ － 21 的表达水平［14］
2． 5． 1 实验分组 继续按照以上方法处理细胞，取正处于对数生
长期细胞 106 个 /ml(经过胰蛋白酶消化后)，实验分两组:①
Ec9706 /cDDP + ＲPMI － 1640;② Ec9706 /cDDP + ＲAE(10μg /
ml)，将实验组和对照组分别设有 10 个样本。
2． 5． 2 用 Trizol提取细胞总 ＲNA
①由于 Ec9706 /cDDP细胞是贴壁细胞所以可以用 Trizol 法
将其进行裂解，放置 EP管。
②将 EP管中的溶液放置 30min，加入新开瓶氯仿 0． 2ml /Tr-
izol 振荡充分混匀，高速离心 l0min然后取出。可见 EP管中液体
分为上中下三层。
③ 将上层液体转移于另一个新的无菌 Ep管中，加入异丙醇
(500μl / 1ml Trizol)，高速冷冻离心 l0min，即可见 ＲNA沉于管底
侧壁。
④将上清液弃去用 75%乙醇(1ml /1ml Trizol)高速冷冻离心
5min，再弃去上清液。重复此操作两次，将乙醇吸附干净后将 Ep
管口朝下，室温干燥 20min，得到自然干燥的沉淀。
2． 5． 3 ＲNA定量 由于 ＲNA在紫光区 260nm处读数为吸收峰。
测量 260nm 的光密度值来判断 ＲNA 的浓度(OD260)，取适量
ＲNA溶液，并将其稀释 50 倍，按照下列公式计算 ＲNA浓度:
ＲNA(μg /ml) = 40 × OD260 × 50(稀释倍数)
计算取 2μg ＲNA所需各标本体积
2． 5． 4 逆转录实验(总体系 30μl) ＲNA 模板 2μg、4 × dNTP
(2． 5mmol /L)5． 0mmpol、随机引物六聚体 50pmol、AMV(10U /
μl)10μ、10 ×逆转录反应缓冲液 3μL、超纯水加至 30ml。
2． 5． 5 引物设计 根据茎环引物设计原则，查阅相关文献并由生
物公司合成。
ＲT － primer:5 ＇ － GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-
TCGCACTGGATACGAC ATCGAAT － 3＇
Forward primer:5＇－ TCCGA AGTTGTAGTCAGACT － 3＇
Ｒeverse primer:5＇－ GTGCAGGGTCCGAGGT － 3＇
2． 5． 6 PCＲ反应 反应条件:94℃，3min;94℃，20sec，40 个循环;
62℃，40sec，40 个循环。见表 1。
2． 5． 7 琼脂糖凝胶 PCＲ产物定量 秤取 0． 4g琼糖浆，加入 20ml
的 TAE中，使其溶解得更好放置沸水浴中，用滤纸将瓶口封好，
冷却至 60℃左右，加入溴化乙锭使终浓度为 0． 5μg /ml，制胶并在
其边缘加少量琼脂糖，凝固后防止胶从旁漏出，使胶厚 0． 3 ～ 0．
5cm，安插梳子，30 ～ 40min后，待胶自然凝固后去除梳子，去除胶
布，放置电泳槽中。取 8μl 扩增产物与适量溴酚蓝混匀后点样，
在电压 70V下电泳 20 ～ 30min。进行琼脂糖凝胶电泳。
表 1 PCＲ反应体系
成分 终浓度 /用量
4 × dNTP 0． 2mmol /L
TaqDNA聚合酶 2μl
PCＲ Master Mix(2 ×) 各 0． 5μm
PCＲ Enzyme Mix 各 0． 2μm
10 × Buffer 3μl
cDNA 3μl
去离子水 加至 30μl
2． 6 统计学分析 全部数据均用 SPSS17． 0 统计软件进行统计学
的分析处理，实验数据以均 珋x ± s表示，IC50计算采用线性回归，两
组样本比较采用 t检验。
3 结果
3． 1 MTT法测定藤梨根提取物的细胞毒性 ＲAE对 Ec9706 /cD-
DP细胞存在细胞毒性作用，但与 ＲAE 浓度有关。1，5，10μg /ml
组与对照组抑制率无统计学差异(P ＞ 0． 05)，ＲAE100μg /ml 和
1mg /ml两组抑制率分别为 19． 3%、31． 0%，与对照组比较有显著
意义(P ＜ 0． 05)，见表 2。故选用无毒藤梨根提取物并且浓度为
10μg /ml作为最理想的逆转实验浓度。
表 2 MTT法测定 ＲAE的细胞毒性(OD值)
组别
浓度 /
μg·ml － 1
OD值
1 孔 2 孔 3 孔 珋x ± s
抑制率 /%
空白组 0． 559 0． 568 0． 546 0． 556 ± 0． 007
ＲAE组 1 0． 568 0． 545 0． 554 0． 556 ± 0． 009 0△
5 0． 558 0． 547 0． 51 0． 552 ± 0． 008 0． 7△
10 0． 551 0． 533 0． 549 0． 543 ± 0． 004 2． 3△
100 0． 456 0． 447 0． 453 0． 448 ± 0． 005 19． 3☆
100 0． 373 0． 379 0． 397 0． 385 ± 0． 010 31． 0☆
与对照组比较无统计学差异，△P ＞0． 05;与对照组比较有统计学差异，☆P ＜ 0．
05
3． 2 MTT法测定细胞药敏性 顺铂单独作用于细胞系，DDP 对
Ec9706 /cDDP的 IC50为 42． 42μg /ml，顺铂与非细胞毒性剂量
10μg /ml的 ＲAE 共同作用，DDP 对 Ec9706 /cDDP 的 IC50降低为
25． 27 μg /ml，其逆转倍数为 1． 68。见表 3，由表 3 求出相关直线
(P ＜ 0． 05)，求出 IC50。
表 3 MTT法测定 Ec9706 /cDDP细胞药敏性
组别
浓度 /
μg·ml － 1
OD值
1 孔 2 孔 3 孔 珋x ± s
抑制率
/%
空白组 0． 685 0． 712 0． 696 0． 697 ± 0． 010
DDP组 5 0． 632 0． 629 0． 624 0． 628 ± 0． 005 10． 5
10 0． 588 0． 597 0． 577 0． 581 ± 0． 015 16． 9
20 0． 504 0． 485 0． 497 0． 496 ± 0． 018 30． 0
40 0． 390 0． 369 0． 381 0． 382 ± 0． 009 45． 5
80 0． 202 0． 198 0． 228 0． 208 ± 0． 018 69． 0
ＲAE 5 0． 580 0． 579 0． 572 0． 576 ± 0． 009 17． 7
+ DDP组 10 0． 513 0． 524 0． 515 0． 517 ± 0． 006 25． 9
20 0． 418 0． 405 0． 422 0． 415 ± 0． 009 41． 3
40 0． 281 0． 305 0． 292 0． 289 ± 0． 015 56． 8
80 0． 126 0． 106 0． 098 0． 109 ± 0． 015 84． 8
相关直线:Y = 49． 37X － 29． 89(Y 表示抑制率，X 表示 DDP
浓度取对数)，t 检验，t = 7． 396，0． 0025 ＜ P ＜ 0． 005 求出 IC50 =
42． 42μg /ml
相关直线:Y = 55． 45X － 26． 74(Y 表示抑制率，X 表示 DDP
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 6 时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 6 期
浓度取对数)，t 检验，t = 8． 86，0． 0025 ＜ P ＜ 0． 005 求出 IC50 =
25． 27μg /ml
逆转倍数 =对照组 IC50 /试验组 IC50 = 1． 68
3． 3 实验组和对照组 miＲ － 21 基因的表达 对照组的 90% miＲ
－ 21 基因呈高水平表达，只有 10%呈低水平表达;实验组的 10
个样本中有 20% miＲ － 21 基因呈高水平表达，其余 80%呈低水
平表达。应用统计学系统分析后显示 miＲ － 21 基因在实验组和
对照组的表达程度上有显著性差异(P ＜ 0． 05)。
4 讨论
当今对于恶性肿瘤治疗最棘手的问题是多药耐药现象，恶性
肿瘤的耐药形成机制，往往是多种复杂的机制与肿瘤细胞相结
合，而且不同机制间往往是单独或者协同并且相互影响。miＲ －
21 在人类乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌中明显
增高［15］。最近的报道指出 PTEN、原肌球蛋白 1 和程序性细胞凋
亡因子 4(PDCD4)是 miＲ － 21 的直接作用靶点［16］，miＲ － 21 的
下调表达抑制体内乳腺癌生长和体外细胞生长，这与细胞凋亡能
力的增加和抗凋亡蛋白 Bcl － 2 的下调表达有关［17］。
4． 1 中药抗耐药的研究 安国辉等［18］认为，癌毒的致病特点，可
概括为“劫掠精微，耗伤正气，阻滞气机，凶险难愈，传舍为患”，
对于癌毒的治疗，多主张辨证与辨病相结合的治疗模式，抗癌解
毒为基本大法。肿瘤多药耐药逆转剂和逆转方法，或因大剂量造
成明显的毒副作用，或因高成本、高技术难度，使它们在临床应用
上受到限制。
4． 2 藤梨根的抗肿瘤作用 藤梨根为猕猴桃科猕猴桃属软枣猕
猴桃的根，咸寒、微涩。具有清热解毒、利湿、祛风除痹的作用。
有抗癌作用，尤对胃肠道癌种疗效较佳。民间有单用藤梨根治疗
癌症的报道，有一定的治疗和抑制作用，对胃肠道系统的癌症效
果较好，有开胃止痛作用。朱秀山等［19］根据民间经验，应用藤梨
根复方治疗胃癌结果显示有效率为 33． 13%，与化疗组相近，在
生存质量以及与化疗相比的副作用则大大降低。
4． 3 问题与展望 本实验结果和有关研究表明，剂量和效应存在
着一定的关系，这是否就是说明剂量越大逆转倍数越高，或者说
逆转能力越强?同时是否与作用的时间也呈正比关系，也就是说
作用时间越长，逆转倍数越高，逆转能力也越强?当然这些均是
体外实验的研究结果，但是真正应用于临床上，由于某些药物均
有不同程度的毒性，剂量的大小是否会使得病人中毒，不同病人
的耐受程度不同剂量应当如何选择?大剂量的使用会有什么副
作用?这些问题均是我们在下一步实验中应当考虑的问题。当
然本实验中藤梨根提取物的逆转倍数的大小并不能反映藤梨根
逆转多药耐药的能力强弱，其中的逆转倍数的差异，也许与中药
的品种有关系，藤梨根的产地主要是浙江一带，但是随着经济的
发展，我国多地均有种植，不同产地的藤梨根其提取物是否有差
异?有效成分是否有不同也是值得进一步探讨和研究的。以上
所提到的实验研究和本实验均属于体外实验并没有作用于临床，
对于肿瘤病人的分期不同，那么藤梨根提取物在逆转多药耐药时
是否与病人的分期有关系?这也需要进一步进行大样本的临床
观察和体内实验，本实验所选用的细胞系是耐顺铂的细胞系，而
常用的化疗药物有许多，从有关实验表明藤梨根提取物可以降低
对顺铂的耐药，那么是否可以降低其他种类的化疗药物比如阿霉
素、紫杉醇、等对恶性肿瘤的耐药?以上一系列问题还需要进一
步深入、细致的进行大样本多通路的实验分析。
参考文献:
［1］ 魏矿荣，练秋红，刘 静，等． 食管癌流行概况［J］． 中华内科杂志，
2012，51(2):156．
［2］ Holmes ＲS，Vaughan TL． Epidemiology and pathogenesis of esophageal
cancer［J］． Semin Ｒadiat Oncol，2007，17 (1) :2．
［3］ Brown LM，Devesa SS，Chow WH． Incidence of adenocarcinoma of the
esophagus among white Americans by sex，stage，and age［J］． J Natl
Cancer Inst，2008，100 (16) :1184．
［4］ Kamangar F，Malekzadeh Ｒ，Dawsey SM，et． al． Esophageal cancer in
Northeastern Iran:a review［J］． Arch Iran Med，2007，10 (1) :70．
［5］ Zhang W，Bailey － Wilson JE，Li W，et al． Segregation analysis of esoph-
ageal cancer in a moderately high － incidence area of northern China
［J］． Am J Hum Genet，2000，67(1) :110．
［6］ 丁艳芳，谢 霞，赵瑾瑶，等．苦参碱逆转人白血病 K562A /DM细胞
对陈霉素耐药性的研究［J］．大连医科大学学报，2004，26(4):256．
［7］ Zamore PD，Haley B． Ｒibo － gnome:the big world of small ＲNAs［J］．
Science，2005，309 (5740) :1519．
［8］ Gao W，Xu J，Liu L，et al． A systematic － analysis of predicted miＲ － 21
targets identifies a signature for lung cancer［J］． Biomed Pharmacother，
2012，66(1) :21．
［9］ Schee K，Boye K，Abrahamsen TW，et al． Clinical relevance of microＲ-
NA miＲ － 21，miＲ － 31，miＲ － 92a，miＲ － 101，miＲ － 106a and mir －
145 in colorectal cancer［J］． BMC Cancer，2012，12(1) :505．
［10］ Feber A，Xi L，Luketich JD，et al． MicroＲNA expression profiles of e-
sophageal cancer［J］． J Thorac Cardiovasc Surg，2008，135(2) :255．
［11］ 李 敏． DNA聚合酶 β、GST － π 基因表达的调控对食管癌细胞耐
药性的作用［D］．郑州大学博士学位论文，2007．
［12］ 张 丽，国宏莉，田 林，等．藤梨根提取物对人食管癌细胞生长抑
制作用的研究［J］．中药材，2007，30(5):564．
［13］ 张锡泉．参芪扶正液逆转多药耐药细胞株 K562A /MDM 耐药性研
究［D］．南昌大学硕士学位论文，2006．
［14］ 王 涛． DNA聚合酶 β在食管癌中的表达及意义［D］．郑州大学硕
士学位论文，2004．
［15］ Kimura S，Naganuma S，Susuki D，et al． Expression of microＲNAs in
squamous cell carcinoma of human head and neck and the esophagus:
miＲ － 205 and miＲ － 21 are specific markers for HNSCC and ESCC
［J］． Oncol Ｒep，2010，23(6):1625．
［16］ Li S，Liang Z，Xu L，et al． MicroＲNA －21:a ubiquitously expressed pro
－ survival factor in cancer and other diseases［J］． Mol Cell Biochem，
2012，360(1 － 2) :147．
［17］ Hiyoshi Y，Kamohara H，Karashima Ｒ，et al． MicroＲNA － 21 regulates
the proliferation and invasion in esophageal squamous cell carcinoma
［J］． Clin Cancer Ｒes，2009，15(6) :1915．
［18］ 安国辉，王开成，张士舜．辨识“癌毒”［J］．中国中医药现代远程教
育，2011，9(5):173．
［19］ 朱秀山．壁虎藤梨根治疗胃癌临床及实验研究［J］．中国民间疗法，
1999，(3)∶ 43．
·4151·
时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 6 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 6