全 文 ：第 24卷第 4期　　　　 　　　　　　　　　湖北民族学院学报(自然科学版)　　　　　　　　　 　　　　Vo.l 24　No. 4
2006年 12月　　 　　　　　　 Journa l o fHubei Institute fo rNationalities(Na tura l Science Edition)　　 　 　　　　　Dec. 2006
收稿日期:2006 - 08 - 04.
基金项目:湖北省自然科学基金项目(2006ABA036);湖北省 “十五 ”重点科技攻关项目资助(2001AA204A03).
作者简介:罗祖友(1963 - ),女 ,博士 ,副教授 ,主要从事天然产物与功能食品化学的研究.
藤茶多糖组分 AGP - 3的体外抗氧化活性研究
罗祖友 1 ,严奉伟2 ,胡筱波 3 ,吴谋成 3
(1.湖北民族学院生物科学与技术学院 ,湖北 恩施 445000;
2.长江大学 生命科学学院 ,湖北 荆州 434025;
3.华中农业大学 食品科技学院 ,湖北 武汉 430070)
摘要:研究了藤茶多糖组分 AGP - 3的体外抗氧化活性. 用 K3 [ Fe(CN)6 ]模型测定多糖的还原能力 , 用试剂
盒方法测定丙二醛(MDA)及活性氧(ROS)含量 ,用分光光度法测定小鼠红细胞溶血和小鼠肝线粒体肿胀度 .结果
表明 , AGP - 3在化学模拟体系具有一定的还原能力和清除活性氧能力 ,一定浓度范围内具有体外清除小鼠血清活
性氧的作用 , 并能减少小鼠肝组织及肝线粒体 MDA的生成 , 可抑制小鼠红细胞溶血和肝线粒体肿胀.
关键词:藤茶;多糖;抗氧化;活性氧;MDA;体外
中图分类号:Q539 文献标识码:A 文章编号:1008 -8423(2006)04 - 0313 -05
许多植物多糖具有广泛的生物活性 ,近年来关于植物活性多糖抗氧化的研究报道较多 ,而抗氧化作用是
一些多糖抗衰老 、降血脂 、降血糖的作用机制之一[ 1 ～ 3] . 许多植物多糖 ,特别是一些中药植物多糖 ,对物理的 、
化学的及生物来源的多种活性氧 (Reactive oxygen species, ROS)具有清除作用 ,通过抑制脂质过氧化产物丙
二醛(MDA)的生成等多方面显示抗氧化能力 [ 4, 5] .
藤茶 ,学名显齿蛇葡萄 Ampelopsis grosseden ta ta(H and -M azz)W. T. W ang,是我国特有的药食两用野生植
物 ,其黄酮类成分具有抗氧化 、降血糖 、降血脂等活性[ 6, 7] ,有关藤茶多糖的研究报道不多. 本课题首次从藤
茶中提取藤茶多糖并进行分离纯化 ,前期研究表明 ,藤茶总多糖具有一定的抗氧化活性 [ 8] ,本文报道藤茶多
糖分离纯化组分 AGP -3的体外抗氧化效果.
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　藤茶多糖 AGP - 3(自制)　由藤茶 (鄂西藤茶公司提供 )提取水溶性总多糖 AGP[ 9] ,再进行 DEAE—
Sephadex A - 25和 Sephadex G - 200两级分离纯化 ,获得主要组分之一 AGP -3.
1. 1. 2　主要试剂　MDA测定及活性氧测定试剂盒 ,南京建成生物工程研究所;VE(1 028 I. U /g),购自 Sigma
公司;牛血清白蛋白(BR生物试剂 ),北京双旋微生物培养基制品厂;亚油酸 (生化试剂 ),北京石景山化工
厂;其它为国产分析纯试剂.
1. 1. 3　主要仪器　UV -265 Shim adzu紫外可见分光光度计;低温高速离心机;恒温水浴锅;玻璃组织匀浆
器等.
1. 2　方法
1. 2. 1　AGP - 3还原能力的测定　参考 Oyaizu[ 10]的方法略作改进. 除 VE用 40%(v /v)乙醇溶解外 ,其它样
品均用蒸馏水溶解.试验用蒸馏水作为无还原能力的样品对照 , VE及 VC作为有还原能力的样品对照.
操作步骤:1mL的样品溶液 +0. 2mL 0. 2mol /L PBS pH 6. 6 +0.5mL 1%K3 [ Fe(CN)6 ]于试管中混匀 ,
50℃水浴中反应 20m in→流水速冷 ,加入 1mL 10%三氯乙酸 ,混匀→以 3 000 rpm离心 10m in→取 1.5mL上
清液 ,加 0.2mL1%FeC l3和 3mL蒸馏水摇匀 ,放置 5m in→以蒸馏水调零 ,测定 A 700. A 700越大 ,表示还原能力
越强.
1. 2. 2　AGP - 3在化学模拟体系中的抗活性氧能力　参照活性氧测定试剂盒说明书 ,测定反应体系 A550并
计算抗活性氧单位.定义:每 mL样品液在 37℃下反应 1m in,使反应体系中 H2O2浓度降低 1mmo l /L为一个
抗活性氧单位(U).
1. 2. 3　AGP - 3对小鼠血清抗活性氧能力的影响　小鼠眼眶取血 ,分离血清. 参考李云蜂 [ 11]的方法 ,取 0.1
mL稀释 20倍的小鼠血清 +0.1mL样品溶液混匀于 37℃温育 3 h后 ,再按活性氧试剂盒说明书方法测定
A 550(同上),血清对照以 0.1mL生理盐水代替样品溶液.
1. 2. 4　AGP - 3对小鼠肝匀浆体外生成 MDA的影响　参照文献 [ 12 , 13]的方法 ,取新鲜的小鼠肝组织以冰
冷的生理盐水洗净血渍 ,以滤纸吸干水分后称重 ,按 1∶9取相应体积的冷生理盐水于冰浴中分步将肝组织剪
碎 、在玻璃组织匀浆器中匀浆制成匀浆液 ,以 3500 rpm离心 20m in,上清液即为 10%肝组织匀浆液.
AGP -3(样品 )对小鼠肝匀浆 MDA生成的影响　取 0. 2mL 10%肝匀浆液 +0. 1mL样品溶液于试管中
混匀→37℃温育 1 h(对照以等体积生理盐水代替样品溶液)后 ,冰浴冷却→再按 MDA测定试剂盒方法操
作 ,测定 A532并计算 MDA含量 (nmo l /mg pr). 以牛血清白蛋白为标准 ,采用考马斯亮蓝法测定肝匀浆蛋白
质 (pr)含量[ 14] .
样品对诱导体系小鼠肝匀浆 MDA生成的影响相应取另两组试管 ,分别测定样品对 FeSO4与 H2O2诱导
小鼠肝匀浆产生 MDA的影响.一组试管加 0.1mL的 1mmo l /L FeSO 4 ,一组加 0.1mL的 1mmol /LH2O2→然
后各管加 0.1mL的 10%肝匀浆液及 0.1mL的相应浓度的样品溶液 ,混匀于 37℃温育 1 h(对照以等体积生
理盐水代替样品溶液 ),其余步骤同前 ,测定 A532并计算 MDA含量.
1. 2. 5　AGP - 3对 H 2O 2诱导小鼠红细胞氧化溶血的影响　参照文献 [ 15, 16]的方法 ,以小鼠眼眶取血 ,加
入 A lseve r抗凝剂后 ,以 3 000×g离心 10m in ,分离得到红细胞 ,冷生理盐水洗涤红细胞三次 ,再以生理盐水
制备成 0. 5%小鼠红细胞悬浮液 ,备用.样品组:取 1mL红细胞悬浮液 ,加入 0. 2mL样品溶液混匀→加 0. 1
mL100mmol /LH2O 2溶液 ,混匀→37℃温育 1 h后 ,以生理盐水稀释 6倍 , 1 000×g离心 10m in ,取上清液 ,以
生理盐水调零 ,于 415 nm处比色测定吸光度. 正常对照组 (CK):以等体积生理盐水代替样品液和 H2O2溶
液 ,其余同样品组. H2O2诱导对照组 (CK +H2O2):以等体积生理盐水代替样品溶液 ,其余同样品组. 分别以
吸光度计算溶血度和抑制率.
1. 2. 6　AGP - 3对小鼠肝线粒体脂质过氧化的影响　参照文献 [ 17 , 18]的方法. 取新鲜的小鼠肝组织以冷
的生理盐水洗净血渍吸干表面水分后 ,按 1∶9的比例加冰冷的 pH7. 4等渗 PBS(5mmo l /L PBS, pH7.4,含
0.15mo l /LNaC l)剪碎后用玻璃匀浆器在冰浴中匀浆制成 10%肝组织匀浆液→4℃下以 1 000 ×g离心 15
m in,收集上清液→再以 10000×g离心 15m in,收集沉淀并以等渗 PBS液洗涤沉淀 2次→再以等渗 PBS将沉
淀分散制成肝线粒体悬液 ,用考马斯亮蓝法测定该悬浮液的蛋白质含量 ,调整蛋白质含量为 0.5mg /mL的线
粒体悬浮液 ,备用.
1. 2. 7　小鼠肝线粒体肿胀度的测定　样品组 , 0. 4mL样品溶液 +3. 0mL线粒体悬浮液 +0. 4mL0. 5mmo l /L
FeSO4 +0.4mL 0. 5mmo l /LVc溶液 ,迅速混匀后 ,以 PBS溶液调零 ,测定 0、10、20、30m in时的 A 520 ,用吸光度
的降低幅度表示线粒体的肿胀度.正常(对照)组:以等体积 PBS代替样品溶液 、FeSO4和 Vc液 ,其它同样品
组. (诱导)对照组:以等体积 PBS代替样品溶液 ,其它同样品组.
1. 2. 8　小鼠肝线粒体脂质过氧化生成 MDA的测定　样品组 , 1. 0mL线粒体悬浮液 +0. 4mL样品溶液 +
0. 4mL0. 5mmo l /LFeSO 4 +0. 4mL0. 5mmol /LV c溶液;正常组:以等体积 PBS代替样品及 FeSO 4和 V c液;对
照组:以等体积 PBS代替样品溶液.各管混匀 ,于 37℃温育 1 h ,对应取 0. 1mL温育后的各管溶液→按 MDA
试剂盒方法测定 A 532并计算 MDA含量.
1. 2. 9　统计学分析
用 X ±S表示测定结果 , 采用 SAS软件进行 t检验.
2　结果与分析
2. 1　藤茶多糖 AGP - 3的还原能力
如图 1所示 ,藤茶多糖 AGP -3在低浓度范围内的还原能力表现出随浓度增加而增加的量效关系 ,达到
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一定浓度则表现为下降的趋势 ,但与 2μl /mLVE和 30μg /mLVc体系的还原能力作参比 , 0.005 ～ 2.00μmg /
mL范围内 AGP -3的还原能力明显低于 VE和 V c的还原能力. 结果显示 , AGP - 3具有表现抗氧化作用的
可能性 (注:文中所有样品浓度均指加入反应体系的样品初始浓度 ,下同 ).
2. 2　藤茶多糖 AGP - 3在化学模拟体系中的抗活性氧能力
表 2　藤茶多糖 AGP -3对小鼠血清体外抗活性氧
能力的影响 (X ±S , n=3)
Tab. 2　The scavenging e ffec t o f AGP -3 from Am pe lopsis
G rossedentata on ROS of m ice se rum in v itro(X ±S , n=3)
Samp le
Concentration
/mg mL - 1 A 550 Anti- ROS unit/U m L- 1
Control — 0. 828±0. 015 104. 4
AGP - 3 0. 50 0. 899±0. 010b - 19. 1
AGP - 3 2. 00 0. 695±0. 007b 335. 9
AGP - 3 10. 00 0. 354±0. 015b 929. 4
　　C om pared w ith con trol:b P<0. 01
图 1　藤茶多糖 AGP -3的还原能力
F ig. 1　The deox idization of AGP - 3
1. H2 0;2. 0. 005mg /mL AGP - 3;
3. 0. 05mg /mL AGP - 3;4. 0. 1mg /mL AGP - 3;
5. 0. 5mg /mL AGP - 3;6. 2. 0mg /mL AGP - 3;
7. 30μg /m LV c AGP - 3;8. 2μl /m LVE
表 1　藤茶多糖 AGP - 3在化学模拟
体系中的抗活性氧能力(X ±S , n =3)
Tab. 1　The scaveng ing effect of AGP - 3 from Ampe lopsis
G ro ssedenta ta on reactive oxygen species(ROS) in
modified chem ica l system s(X ±S , n=3)
Samp le
Concentration
/mg m L- 1 A 550 Anti -ROS unit/U m L -1
Contro l — 0. 532±0. 010 —
AGP - 3 0. 05 0. 727±0. 059b -38. 9
AGP - 3 0. 50 0. 701±0. 017b -33. 7
AGP - 3 2. 00 0. 489±0. 018a 8. 6
AGP - 3 10. 00 0. 342±0. 015b 37. 9
　　C om pared w ith con trol:aP<0. 05, b P<0. 01
藤茶多糖 AGP - 3在化学模拟体系中的抗活性氧能力如表 1所示. 结果表明 ,低浓度 (0. 05mg /mL和
0. 50mg /mL)抗活性氧单位为负值 ,显示它不仅没有抗活性氧能力 ,甚至还有助氧化作用 , 2.00和 10.00mg /
mL浓度表现出一定的抗活性氧能力 ,与对照相比 ,差异达到显著和极显著水平.说明 AGP - 3具有一定的抗
活性氧能力 ,但最适宜的浓度还有待进一步摸索.
2. 3　藤茶多糖 AGP - 3对小鼠血清体外抗活性氧能
力的影响
在化学模拟体系测定的基础上 ,考察有效浓度的
藤茶多糖 AGP - 3对小鼠血清抗活性氧能力的影响
(表 2).与对照相比 ,相似于化学模拟体系中的表现 ,
低浓度 AGP -3(0. 50mg /mL)有降低血清抗活性氧能
力的作用 , 2. 00和 10. 00mg /mL浓度具有提高体外小
鼠血清抗活性氧的能力 ,差异极显著.
2. 4　藤茶多糖 AGP - 3对 H2O2诱导的小鼠红细胞
(RBC)溶血的影响
红细胞在体外因自身氧化或因 H 2O 2诱导氧化而发生溶血[ 15] . 表 3显示 ,与 H2O 2诱导的对照组相比 , 4
种浓度的 AGP - 3对 H 2O 2诱导的小鼠红细胞溶血均显示出一定的抑制效果 ,但没有明显的剂量 -效应关
系.
表 3　藤茶多糖 AGP - 3对 H2O2诱导的体外小鼠红细胞溶血的影响(X ±S , n =3)
Tab. 3　E ffect o fAGP - 3 from Ampe lopsis G rosseden ta ta on hem olysis o fm ice
red b lood ce ll(RBC) induced by H2O2 in vitro (X ±S , n=3)
G roup
Concentration
/mg mL - 1 A 415 Hemo lysis/% Inhib ition rate/%
Norm a l(CK) — 0. 303±0. 013b 54. 6 —
H2O2 +CK — 0. 555±0. 020 100 　 —
H2O2 +AGP - 3 0. 05 0. 348±0. 008b 62. 7 37. 3
H2O2 +AGP - 3 0. 50 0. 411±0. 014b 74. 1 25. 9
H2O2 +AGP - 3 2. 00 0. 279±0. 011b 50. 3 49. 7
H2O2 +AGP - 3 10. 00 0. 252±0. 006b 45. 4 54. 6
　　C om pared w ith (H2O2 +CK) group:bP<0. 01
2. 5　藤茶多糖 AGP - 3对体外小鼠肝组织匀浆 MDA生成的影响
亚铁离子 Fe2 +和 H 2O 2均是产生自由基的强诱导剂.表 4说明 , 0. 50 ～ 10. 00mg /mL的藤茶多糖 AGP -3
315第 4期　　　　　　　　　　　　罗祖友等:藤茶多糖组分 AGP - 3的体外抗氧化活性研究　　　　　　　　　　　　　　
对无诱导剂 、有 Fe2+和 H 2O 2诱导的 3种体系温育情况下的小鼠肝组织匀浆 MDA的生成有抑制作用 ,但无
明显的剂量 -效应关系;整体上对 H2O 2诱导组 MDA形成的抑制作用强于同浓度下的 Fe2+诱导组和无诱导
组 ,而 Fe2+诱导组内与对照间差异不显著. AGP - 3与藤茶总多糖 AGP的表现趋势基本一致 [ 8] ,其原因有待
进一步分析.
表 4　藤茶多糖 AGP - 3对体外小鼠肝组织匀浆 MDA生成的影响(X ±S , n =3)
Tab. 4　Effect of AGP - 3 from Ampe lopsisG ro ssedenta ta on MDA fo rm a tion in m ice liver homogena te in vitro(X ±S , n =3)
Samp le
C oncentration
m g mL - 1
Incubation w ithout inducem ent
MDA
nm o l /mg pr Inh ibito ryra te /%
Incuba tion w ith Fe2+
MDA
nm o l /m g pr Inhibito ryrate /%
Incubation w ith H
2
O
2
MDA
nm o l /m g pr Inh ib itoryra te /%
CK( -) 2. 92±0. 16 - 8. 94±0. 22 - 3. 92±0. 25 -
AGP - 3(0. 05) 3. 97±0. 09b -36. 09 9. 89±0. 79 -10. 62 4. 24±0. 36 - 8. 08
AGP - 3(0. 50) 2. 46±0. 03b 15. 92 8. 66±0. 20 3. 18 2. 48±0. 15b 36. 79
AGP - 3(2. 00) 2. 35±0. 06b 19. 44 8. 76±0. 11 2. 03 2. 58±0. 10b 34. 16
AGP -3(10. 00) 2. 50±0. 03a 14. 35 8. 61±0. 29 3. 69 2. 52±0. 03b 35. 62
　　C om pared w ith con trol:aP<0. 05 , b P<0. 01
2. 6　藤茶多糖 AGP - 3对体外小鼠肝线粒体脂质过氧化的影响
2. 6. 1　AGP - 3对小鼠肝线粒体肿胀度的抑制作用　由图 2可见 ,包括正常对照和诱导对照组在内的各反
应体系 A 520随时间延长而下降 ,说明肝组织线粒体因膜氧化损伤而肿胀. 由于各体系因加样浓度不同而导致
起始吸光度值(A 520)不同 ,这一点与同类抗氧化能力测定中的表现不同 [ 19] .比较 30m in各体系 A 520下降率 ,
以诱导对照组最大 (8.9%),正常对照组 (5.1%), AGP - 3由低浓度到高浓度的下降率分别为 7. 8%、
7.6%、6. 9%、4. 0%,相对于诱导对照组 , AGP - 3均表现出一定的对小鼠肝线粒体肿胀度的抑制效果.
2. 6. 2　AGP - 3对小鼠肝线粒体 MDA产生的影响　图 3显示 , AGP - 3对 Fe2+ -V c诱导的小鼠肝线粒体
MDA生成的影响表现为:0. 05 ～ 2.00mg /mL浓度范围内的 AGP - 3具有抑制 Fe2+ -V c诱导的小鼠肝线粒
体 MDA生成的作用 ,但抑制效果不显著. 更有效的作用剂量有待进一步研究.
图 2　AGP -3对小鼠线粒体肿胀度的影响　　　　　　　图 3　AGP - 3对小鼠肝线检体 NDA生成的影响　　　　
F ig. 2　Effect o fAGP - 3 on sw e lling o f m ice
live rm itochondria
　　　　　　　　　　F ig. 3　Effe ct of AGP - 3 onMDA fo rm a tion
in m ice live rm ito chondria
　　　　
3　结论与讨论
(1)通过对藤茶多糖 AGP -3的还原能力 、在化学模拟体系中抗活性氧能力的测定 ,从化学本质上证实
了 AGP -3具有一定的抗氧化活性.
(2)AGP - 3在一定浓度范围内可提高体外小鼠血清抗活性氧能力 ,能抑制小鼠红细胞溶血和肝线粒体
肿胀 、减少小鼠肝组织匀浆及肝线粒体 MDA的生成 ,说明 AGP -3具有体外对小鼠细胞器 、细胞及组织 3个
层次的抗氧化作用.最适宜的浓度还需进一步研究.
(3)藤茶作为一种民间保健茶 ,具有良好的药理效果 ,无毒副作用 [ 20, 21] ,前人对其功能成分的研究集中
在藤茶黄酮方面 [ 6, 7] .本课题前期研究报道了藤茶总多糖 AGP的抗氧化活性 ,本文对藤茶多糖组分 AGP - 3
的抗氧化研究进一步表明 ,藤茶多糖也是藤茶的功能成分之一.
316 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　湖北民族学院学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　 　　第 24卷
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Anti- ox idative E ffect of Polysaccharide Fraction AGP - 3
from Ampelopsis Grossedentata in V itro
LUO Zu - you
1 , YAN Feng -w ei2 , HU X iao -bo3 ,WUMou - cheng3
(1. Schoo l of Bio log ica l Sc ience and Techno logy, H ubei Institute fo rNa tiona lities, Ensh i 445000, Ch ina;
2. Co llege o f L ife Science, Yangtze Unive rsity, Jingzhou 434025, China;
3. Co llege o f Food Sc ience and Techno logy, Huazhong Agricultural University, W uhan 430070, China)
Abstract:This paper studied the antiox idation of po lysaccha ride fraction AGP - 3 from Ampe lopsis G rossedentata
in v itro . The deoxidiza tion o fAGP - 3w asmeasured by K3 [ Fe (CN)6 ] method, the conten ts ofma londia ldehyde
(MDA) and reactive oxygen spec ies(ROS)were ana lysed by the reagen t k its , the hemo ly sis of m ice red b lood
ce ll(RBC) and the sw e lling o fm ice liverm itochondria w ere observed by spectropho tometric me thod. The results
show ed thatAGP - 3w ithin a range o f certain concen tration had deox idization effec.t It could scavenge ROS inmod-
ified chem ical sy stems and inm ice serum , decrease the forma tion ofMDA in m ice live rm itochondria and live r ho-
mogenate and inhibit the hemo ly sis o fm ice RBC and the sw e lling o fm ice liverm itochond ria in v itro.
Key words:ampe lopsis grosseden tata;po lysaccharide;antiox idation;reactive oxygen species (ROS);malondialde-
hyde (MDA);in v itro
317第 4期　　　　　　　　　　　　罗祖友等:藤茶多糖组分 AGP - 3的体外抗氧化活性研究