全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2013，25:759-761，791
文章编号:1001-6880(2013)6-0759-04
收稿日期:2013-02-28 接受日期:2013-05-08
* 通讯作者 Tel:86-20-61648591;E-mail:qiuyuchang2013@ 163． com
石参总黄酮对一氧化氮致大鼠胰岛细胞损伤的保护作用
吴伟斌，庞建新，曹 莹，谢宝平，丘玉昌*
南方医科大学药学院新药评价中心，广州 510515
摘 要:采用硝普钠为 NO供体，造成大鼠胰岛 β细胞 RIN-m的损伤，通过检测细胞活力、细胞内丙二醛(MAD)
含量、总谷胱甘肽(GSH)含量和总超氧化物歧化酶(SOD)活性，探讨石参总黄酮的保护作用和机制。结果显
示，石参总黄酮能明显提高损伤细胞的活力，降低细胞内 MDA的含量、提高总 GSH含量和 SOD活力，表明石参
总黄酮对 NO所致 RIN-m细胞的损伤具有保护作用，其机制可能与提高细胞内 GSH含量与 SOD活力有关。
关键词:石参;黄酮;胰岛细胞;一氧化氮
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A
Protective Effect of Total Flavonoids from Urariacrinita Root against Injury
of Rat Pancreatic Islet Cells Caused by Nitric Oxide
WU Wei-bin，PANG Jian-xin，CAO Ying，XIE Bao-ping，QIU Yu-chang*
Center of Drug Evaluation and Research，School of Pharmaceutical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou510515，China
Abstract:RIN-m cells were injured by sodium nitroprusside (SNP) ，adonator of NO． The objective of this study was to
evaluate the protective effect of total flavonoids from Urariacrinitaroot (UCRFs)on RIN-m cell． The cell viability，intra-
cellular content of malondiadehyde (MAD)and total glutathione (GSH) ，as well as total activity of superoxide dis-
mutase (SOD)were measured． The experimental results showed that UCRFs significantly improved the viability of RIN-
m cells injured by SNP，as well as ameliorated the intracellular oxidative stress，which was confirmed by the reduction of
intracellular content of MAD． Furthermore，UCRFs increased anti-oxidative ability in INS-1E cells by elevating intracel-
lular GSH content and up-regulating the activity of intracellular SOD． Hence，it was concluded that UCRFs exhibited pro-
tective effect against injury caused by NO in RIN-m cells，possibly through the up-regulation of intrinsic anti-oxidative
activityof cells．
Key words:Urariacrinita;flavonoids;isletcells;nitric oxide
近年来的研究表明，NO 引起的氧化应激损伤
是引起糖尿病的重要环节［1］，相对于机体其他组织
细胞，胰岛 β细胞更容易受到 NO 的攻击，导致功能
缺陷［2］。因此，阻断 NO引起的胰岛细胞损伤，成为
防治糖尿病的重要途径。
石参(Urariacrinita)是豆科(Leguminosae)植物
猫尾射(Uraria crinite Desv．)的干燥根，据《广西中
药志》记载，其味甘，气香，性温无毒;有行气止痛，
逐饮化痰，治心胃气痛，痰饮咳嗽之功效［3］。以往
对于石参药理作用的研究少有报道。我们前期研究
表明，石参的提取液具有降低 II 型糖尿病小鼠的空
腹血糖、改善糖耐量、促进胰岛素分泌的作用［4］;来
源于石参的总黄酮具有较强的抗氧化能力［5］。本
实验中，我们采用 SNP作为 NO供体，观察石参总黄
酮对 NO引起的胰岛 β 细胞损伤的保护作用，并探
讨可能的作用机制，为进一步开发利用石参打下基
础。
1 材料与方法
1． 1 石参总黄酮的制备
石参总黄酮的制备参见文献［5］。
1． 2 细胞
大鼠胰岛 β细胞株 RIN-m，购自美国 ATCC。
1． 3 试剂
1640 基础培养基(Hyclone) ;胎牛血清(FBS)
(杭州四季青) ;青链霉素(北京吉诺) ;3-(4，5-二甲
基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT) (sigma) ;
硝普钠(Sodium Nitroprusside，SNP) (国药集团化学
试剂有限公司) ;DMSO(广州化学试剂厂) ;总谷胱
DOI:10.16333/j.1001-6880.2013.06.005
甘肽、总 SOD 活性、丙二醛(MDA)检测试剂盒(碧
云天生物技术研究所)。
1． 4 仪器
二氧化碳培养箱(Thermo) ;恒温水浴箱(上海
一恒) ;恒温培养箱(Shel Lab) ;高速低温离心机
(Sigma) ;连续波长紫外分光光度计(Bio-Rad) ;
1． 5 RIN-m细胞 SNP损伤模型的构建
RIN-m细胞用含 10% FBS、1%青链霉素的 1640
完全培养基培养，对数生长期细胞按 1 × 104 /孔的
细胞量铺入 96 孔板中，培养过夜后，加入不同浓度
的 SNP(5、8、10、15、20 mmol /L) ，分别培养 3 h 和 4
h。培养结束后，吸弃培养基，每孔加入 100 μL的新
鲜培养基和 10 μL的含 5 mg /mL MTT的 PBS溶液，
继续培养 4 h，吸弃培养基，每孔加入 DMSO100 μL，
于 570 nm波长处读数。每组 3 个复孔。
1． 6 石参总黄酮对细胞活力的影响
对数生长期 RIN-m细胞按 1 × 104 /孔的细胞量
铺入 96 孔板中。把含有梯度浓度的石参总黄酮的
完全培养基加入孔板，培养 4 h 后，更换培养基为含
10 mmol /LSNP 的完全培养基，再培养 3 h 后，吸弃
培养基，及后每孔加入 100 μL 的新鲜培养基和 10
μL的含 5 mg /mL MTT的 PBS溶液;培养 4 h 后，吸
弃培养基，每孔加入 DMSO100 μL，于 570 nm 波长
处读数。实验分为空白组、模型组、给药组(分别含
石参总黄酮 0． 01、0． 05、0． 1、0． 2、0． 3 mg /mL)。每
组 3 个复孔。
1． 7 石参总黄酮对细胞内 MAD 含量和总 SOD 活
性的影响
对数生长期 RIN-m细胞按 1 × 104 /孔的细胞量
铺入 96 孔板中。把含有梯度浓度的石参总黄酮的
完全培养基加入孔板，培养 4 h 后，更换培养基为含
10 mmol /L SNP的完全培养基，再培养 3 h 后，吸弃
上清，孔板置于冰上，以预冷的 PBS 荡洗细胞两次，
完全吸去 PBS后，每孔加入细胞裂解液 200 μL，冰
浴中裂解 90 min，后用低温高速离心机 4 ℃下以
1600 g离心 10 min，取上清。按照试剂盒的步骤检
测细胞内丙二醛(MDA)的含量和总 SOD 活性。实
验分为空白组、模型组、给药组(分别含石参总黄酮
0． 01、0． 05、0． 1、0． 2、0． 3 mg /mL)。每组 3 个复孔。
1． 8 石参总黄酮对细胞内总谷胱甘肽含量的影响
对数生长期 RIN-m细胞按 1 × 104 /孔的细胞量
铺入 96 孔板中。把含有梯度浓度的石参总黄酮的
完全培养基加入孔板，培养 4 h 后，更换培养基为含
10 mmol /L SNP的完全培养基，再培养 3 h 后，吸弃
上清，孔板置于冰上，以预冷的 PBS 荡洗细胞两次，
完全吸去 PBS 后，按试剂盒要求，每孔加入蛋白去
除试剂 S100 μL，冰浴中用细胞刮子刮下细胞，收集
于 EP管中，并在液氮和 37 ℃温水中进行两次反复
冻融。然后用低温高速离心机 4 ℃下以 10000 g 离
心 10 min，取上清，按试剂盒步骤检测总谷胱甘肽的
含量。实验分为空白组、模型组、给药组(分别含石
参总黄酮 0． 01、0． 05、0． 1、0． 2、0． 3 mg /mL)。每组
3 个复孔。
1． 9 统计分析
实验数据均以 mean ± SD 表示，使用 SPSS13． 0
统计软件进行单因素方差分析，使用 LSD 进行组间
的两两比较，P ＜ 0． 05 视为有统计学意义。
2 实验结果
2． 1 RIN-m细胞 SNP损伤模型的构建
SNP是外源性 NO供体，在培养液中转变为 NO
而损伤细胞。如图 1 所示，不同浓度的 SNP作用于
067 天然产物研究与开发 Vol. 25
RIN-m细胞后，均使 OD值明显下降，表明细胞受到
NO的损伤。其中 10 mMSNP 作用 3 h，使细胞活力
下降约 50%(与空白对照比) ，因此，后续实验选择
10mMSNP作用 3 h构建损伤模型。
2． 2 石参总黄酮对细胞活力的影响
图 2 显示，石参总黄酮在 0． 05 ～ 0． 3 mg /mL范
围内，能显著提高细胞的活性(P ＜ 0． 05) ，表明石参
总黄酮对受 SNP损伤的 RIN-m细胞具有保护作用，
并呈一定的浓度依赖性(方差不齐)。
2． 3 石参总黄酮对细胞内 MAD含量的影响
从图 3 可以看出，受 NO 损伤后，细胞内 MAD
含量明显升高，石参总黄酮在 0． 05 ～ 0． 3 mg /mL 范
围内，明显降低损伤细胞内 MAD 含量，表明石参总
黄酮能减轻 NO所致的细胞脂质过氧化程度。
图 3 石参总黄酮对细胞内 MDA含量的影响
Fig. 3 Effect of UCRFs on intracellular MDA content
2． 4 石参总黄酮对细胞内总 SOD活性的影响
图 4 显示，受 NO损伤后，细胞内总 SOD活性明
显下降，石参总黄酮在 0． 05mg /mL ～ 0． 3mg /mL 范
围内，明显提高损伤细胞内总 SOD 活性(P ＜
0. 05) ，并呈一定的浓度依赖性。
图 4 石参总黄酮对细胞内 SOD活性的影响
Fig. 4 Effects of UCRFs on intracellular SOD activity
2． 5 石参总黄酮对损伤细胞内总谷胱甘肽含量的
影响
从图 5 可以看出，受 NO损伤后，细胞内总谷胱
甘肽含量明显下降，石参总黄酮在 0． 1 mg /mL ～ 0. 3
mg /mL范围内，显著提高损伤细胞内总谷胱甘肽含
量(P ＜ 0． 05)。
图 5 石参总黄酮对细胞内总谷胱甘肽浓度的影响
Fig. 5 Effects of UCRFs on intracellular total GSH content
3 讨论
本实验中，我们用 SNP 作为 NO 的外源性供体
加入到培养体系，造成 NO 对胰岛 β 细胞的损伤。
一氧化氮(NO)是一种弱自由基，通过多种途径参与
糖尿病的发生发展过程。NO 可直接抑制细胞线粒
体的能量代谢，损伤 DNA，导致胰岛细胞发生凋亡
或坏死［6］;此外，NO还可以与活性氧类中间产物发
生反应，生成过氧亚硝酸盐阴离子(OONO-)等活性
氮(reactive nitrogen species，RNS)和(或)活性氧类
(reactive oxygen species，ROS)物质，进而损伤细
胞［7，8］，最终导致胰岛 β细胞功能障碍。
本实验中，石参总黄酮能明显提高 SNP 损伤后
细胞的活力，降低细胞 MAD 含量，表明石参总黄酮
对受 NO损伤的 RIN-m 细胞具有较好的保护作用。
GSH和 SOD 是细胞内自身存在的重要的对抗 NO
损伤的物质。GSH 可清除细胞内亲电基团，调节
NO平衡［9］;SOD 主要清除细胞代谢产生的超氧阴
离子，在减少过氧亚硝酸根生成的过程中起主要作
用［10］。给予石参总黄酮后，细胞内 GSH 含量和
SOD的活性均显著性上升，提示石参总黄酮可能通
过提高 RIN-m细胞自身的抗氧化能力来抵抗 NO引
起的损伤。
以上结果显示，石参总黄酮对 NO 所致的胰岛
细胞损伤具有较好的保护作用，具有一定的开发价
值。
参考文献
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167Vol. 25 吴伟斌等:石参总黄酮对一氧化氮致大鼠胰岛细胞损伤的保护作用
解成其他化合物后再起作用。
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