全 文 ：HL P C同时测定万寿菊花中叶黄素及玉米黄素的含t
李 宁 ,张雪霞 ,崔 彦 ,刘刚叁 ,李晓露 , 陈书红 ,李 岳
( 华北制药集团新药研究开发有限责任公 司 , 石 家庄 05 001 5)
〔摘要」 目的 : 建立 一种同时测定万寿菊花中叶黄亲及玉米黄素含 t 的 H P LC 方 法 。 方法 : 采用 D ve el os il C , 。
色谱柱 ( 250 m m x 4 . 6 m m , 5 拜m ) , 流动相为甲醉一 乙猜 ( 4 :9 5 1 ) , 内含 0 . 05 % 三 乙胺 , 流速 1 . 0 m .L im n 一 ’ , 检测波长
45 0
n m
。 结果 : 叶黄亲和玉米黄素分别在 5 . 。 一 8 0 . 。 和 2 . 0 一 32 . 。 料g’ m l , 一 ’ 的浓度 内峰面 积呈 良好的线性关系
(
r 分别为 0 . 999 8 , 0 . 9 99 7 ) . 平均回收率分别为 99 . 2 5% ( R SD 二 2 . 1% , n 二 9 )和 9 9 . 4 1% ( RS D 二 2 . 3% , n 二 9 ) 。 蜻
论 : 本法简便准确 、 重现性好 , 可用于 万寿菊花 中叶黄素及玉米黄素的含 t 测定 。
[关位词」 万寿菊 ; 叶黄素 ;玉米黄素 ; 高效液相色谱
[中口分类号 ] R92 7 . 2 [文献标识码 ] ^ [文章编号 ] 10 3 一 3 734 ( 2 X() 6 ) 一6 一 1 38 1 一 02
D e t e r m i n a it o n o f lu et i n a n d z e a x a n ht i n i n aT g
e 扭5 e er c匆 L . b y H P L C
L l N in g
,
Z H A N G X u e
一 x i a
,
C U I Y a n
,
L IU G a n g
一 s a n , L l X ia o
一
L u
,
C H E N S h u
·
h o n g
,
L l Y u e
( 川喇 D r ug R e : e a cr h & D , l叩。 e n t Co呷 a yn , No r `h e r n Ch i n a P h a mr a e e 。 `交a l
Co , o ar `沁 n , S h红a之h u a鳍 0 5 0 0 15 , Ch i n a )
[ A b s t ar e t ] o bj e e t i
v e : T o e s ta b l i s h a H p L C m e th o d fo r s im u l at n e o u s q u a n t iif e a t i o n o f lu te i n a n d
z e a x a n t h i n i n aT 群`es e er e ` a L . M e t h o d s : T h e H PL C e o n d i ti o n w a s e o n s is t e d o f a D e v e l o s il C 犯 e o l u m n
( 2 5 0 m m x 4
.
6 m m
,
5 拼m ) , a n e lu a t e o f m e t h a n o l 一 a e e t o n i t ir le ( 4 9 : 5 1 ) e o n ta n i n g 0
.
0 5% t r i e th y l a m i n e
w i t h a n o w ar te o r 1
.
0 m L
·
m i n
一 ’ a n d d e t e e t io n a t 4 5 0 n m
.
R e s u l t s : T h e l i n e a r i t y o f l u t e in a n d : e a x a n
-
th i n e o n e e n atr t i
o n s w e er s h o w n i n th e ar n g e o f 5
.
0 一 8 0
.
0 朴 g · m L 一 ’ ( r = o , 9 9 9 8 ) a n d 2 . 0 一 3 2 . 0
林g · m L 一 ’ ( r 二 0
.
9 9 9 7 )
,
er s p e e t i v e ly
.
Th e a v e ar g e er e o v e叮 o f l u te i n a n d z e a x a n th i n w a o 9 9 . 25% w i t h
R SD 二 2
.
1% (
n = 9 )
a n d 9 9
.
4 1% w i t h RS D = 2
.
3% ( n 二 9 )
, r e s p e e t iv e ly
.
C o n e lulB
o n : 仆 e er l i a b le
H P LC m e th o d 15 a p p l ie d t o q u a n ti fy l
u t e i n a n d z e a x a n th i n i n aT 群 r es e er e `a L .
〔K叮 w o dr , ]
( H P LC )
e
cer t
a L
.
; l u te i n ; : e a x a n *h i n ; h ig h p e for mr
a n e e l iq u id e h or m a t o g r a p h y
万寿菊系菊科类 1 年生草本植物 , 其花瓣中富
含天然叶黄素和玉米黄素 。 叶黄素和玉米黄素对人
视觉有保护所用 ,此外它还具有预防 白内障 、预防和
改善老年性 视黄斑变性 ! ’ 1 、 预防动脉硬化 【’ l 、 增 强
免疫力等功效 〔’ ] ,特别是预防癌变的发生 〔` l 。 国内
外目前常采用 AO A C 法检测 万寿菊中叶黄素的含
量 〔’ ] ,其叶黄素柱层析洗脱稳定性差 , 检测误差 较
大 ,溶剂消耗量大 ,污染较重 , 操作复杂 ,耗 时较长 ,
且只能检测总叶黄素含量 , 不能测定叶黄素和玉米
黄素单体的含量 。 本实验建立 了同时测定万寿菊花
中叶黄素及玉米黄素含量的 H PL C 分析方法 。
醇 、 正己烷 、 甲醇 、氢氧化钾均为分析纯 ;甲醇 、 乙睛 、
三乙胺为色谱纯 ;双蒸馏水 , 自制 。
高效液相色谱仪 ( 5 15 泵 , 9 9 6 检测器 ) , w a t e r s
公司 ; L0 B 0 R A T A4 00() 旋转燕发器 , H e id o l p h 公 司 。
方法与结果
试药与仪器
万寿菊干花 ,购 自河北安国中药基地 ,经本公司
天然药物研究室刘 刚叁教授 鉴定 为万寿菊 ; 叶黄素
对照品 (含量 95 . 2% ) , sI C M A 公 司 ; 玉米黄素对照
品 ( 含量 90 . 5% ) ,英国 A iP n 化学试剂公司 ;无水 乙
1 溶液的制备
1
.
1 对照 品溶液 分别精密称取 叶 黄素对照 品
2
.
5 m g 和玉米黄素对照品 1 . 0 m g ,置于 25 m L 棕色
容量瓶中 ,用流动相溶解后定容 , 摇匀 , 得混合对照
品溶液 , 阴凉避光保存 。
1
.
2 供试品溶液 取 万寿菊干花适 量 , 研磨成粉
末 ,过 or o 目筛 ,精密称取粉末 10 0 . 0 m g 置于 10 0
m L 烧瓶 中 ,加人 正己烷一无水 乙醇 ( 2 : l ) 60 m L , 超
声振荡提取 10 m in ,加人 4 0% 的氢氧化钾一甲醇溶液
4 m L
,
6 0 ℃ 水浴加热 , 回流 30 m in 后阴暗处放置 l h ,
加 人 60 m L 水 ,用正己烷萃取 3 次 , 每次 60 m L ,合并
一 1 3 8 1 一
C卜 in es eJo u m a l o f N ew D ur g: 2(X陌 , V o l . 15 N o . 16
正己烷相 ,用旋转蒸发器减压浓缩 ,用流动相溶解于
5 0 m L 棕色容量瓶中 ,用流动相定容 , 摇匀 , 得供试
品溶液 , 阴凉避光保存 。
2 色谱条件及系统适用性
色谱柱 : D e v e l o s i l C 3。 ( 2 5 0 m m x 4 . 6 m m , 5拜m ) ,
柱温为室 温 ; 流 动相 : 甲醇一乙睛 ( 4 9 : 51 ) , 内含
。 . 05 % 三 乙胺 , 流 速 1 . 0 m L · im n 一 ; 检测 波长 :
4 5 0 n m ;进样量 5 拼 ;L 定量方法用外标法 ,理论塔板
数以叶黄素峰计算 , 不低于 8 0 0 , 以玉米黄素峰计
算 ,不低于 6 0 0 。 采用 上述条件 , 叶黄素和玉米黄
素可实现基线分离 , 见图 l 。
6 8 10 12 1 4 16 18
t lm 叭
对照筋解液
6 8 10 12 14 1 6 18
t lm 价
供试品溶液
飞.1JJ、1
2-1
1
4
r. LùT月LresL
一叶 黄众 ( Iu . e : 。 ) , 2 玉米黄索 ( . e一: a 。 *k in )
图 . 洲定万寿菊花中叶黄素和 k米黄素的 H IP 毛 图
3 线性关系考察
精密量取对照品溶液 0 . 5 , l , 2 , 4 . 8 m L , 分别置
于 10 m L 量瓶中 ,用流动相稀释至刻度 , 摇匀 ,进样
5 挤 L 。 进行色谱分析 ,记录色谱峰面积 , 以相应的组
分浓度 ( C )为横坐标 , 峰面积 ( )Y 为纵坐标 , 线性 回
归 ,得叶黄素和玉米黄素的回归方程分别为 :
Y一 , , 二 2
·
4
x 10
,
C
. , , , + 一 9 6 x 一。` , r = 0 .卿 s
( n = 5 )
, 线性范围 : 5 . 0 一 8 0 . 0 科 g · m L 一 ’ ;
Y
一、 , , , 二 2
·
4 4 x 10 , C * , , . + 1
.
8 1 x 10
` , r 二
0
.
9 9 9 7 ( 。 二 5 )
, 线性范围 : 2 . 0 一 3 2 . 0 拜 g · m L 一 ’ 。
4 精密度试验
精密吸取供试品溶液 5 拼 L , 重复进样 5 次 ,记录
叶黄素与玉米黄素峰面积 ,叶黄素峰面积的 RS D 为
0
.
9 3%
, 玉米黄素峰面积的 R SD 为 0 . 92 % 。
5 称定性试验
取同批号供试品溶液 ,按上述测定方法在 。 , l ,
2
,
4
,
s h 分别侧定 l 次 , 侧得叶黄素峰面积的 RSD
为 1 . 4 % , 玉米黄素峰面积的 RS D 为 1 . 3% , 表明供
试品溶液在 s h 内稳定 。
` 加样回收试驻
取 已知叶黄素和玉米黄素含量的万寿菊干花
9 份各 5 0 m g ,分别按高 、 中 、低 3 组加入叶黄素对照
品及玉米黄素对照品 (组 1加人 0 . 50 m g 和 0 . 24 m g ;
组 2 加人 1. X() m g 和 0 . 30 m g ;组 3 加入 1 . 2 0 m g 和
0
.
3 6 m g )
, 每组 3 份 , 按 “ 1 . 2 ” 项下制备供试 品溶
液 ,进样 5 拜 L ,按上述色谱条件进行测定 , 计算得叶
黄素 的 平 均 回收 率 为 9 . 25 % ( n 二 9 ) , R s D 为
一 13 8 2 一
中国新药杂志 2创拓 年第 15 卷第 16 期
2
.
1%
, 玉米黄素的平均回收率为 9 9 . 41 % ( n 二 9 ) ,
RS D 为 2 . 3% 。
7 , 复性试验
取同批号万寿菊干花 50 gm ,按 “ 1 . 2 ” 项下制备供
试品溶液 5 份 ,进样 5 料L ,分别测定叶黄素与玉米黄索
峰面积 ,计算含量 ,结果叶黄素平均含量为 1. 、2% , RS D
为 .0 盯% ,玉米黄素含量为 .0 34 % , RS D 为 .0 肠% 。
8 样品测定
精密吸取供试品溶液 、 对照品溶液各 5 拜L 进样
测定 ,结果 3 批万寿菊干花中的叶黄素含量 ( n 二 3) 分
别为 1 . 13 % , 1 . 21 % , 1 . 18 % ; RS D 分别 为 0 . 94 % ,
0
.
93 %
,
0
.
94 % ; 玉米黄素含量 ( n 二 3) 分别为 0 . 35 % ,
0
.
31 %
,
0
.
3 % ; RS D 分别为 0 . 94 % , 0 . % % , 0 . 9 5% 。
讨 论
本试验 比较 了不同提取溶剂 ( 正己烷 、 丙酮 、无
水乙醇 、 乙酸乙醋 、 异丙醇等 )对叶黄素及玉米黄素
含量测定的影响 , 确定 正己烷 一无水乙 醉 ( 2 : l) 为最
佳提取溶剂 。 比较 了不同提取 方法 (搅拌提取和超
声提取 )对叶黄素及玉米黄素含量侧定的影响 , 结
果 2 种方法无明显差异 。 在此基础 上考察了不同提
取次数 (超声 l , 2 , 3 次 ) 叶黄素及玉米黄素含量的
差异 , 结果无明显差异 。 因超声方法简便快捷 , 故选
用超声提取 l 次为万寿菊花的提取方法 。
曾采用 C .: 色谱柱 ,不同溶剂及不同比例的流动
相都不能使叶黄素与玉米黄素实现基线分离 ; C o3 色
谱柱可实现叶黄素与玉米黄素的分离 。
本实验从提取方法到仪器分析的色谱条件都做
了较多的筛选和摸索 ,使方法具有简便快速 、 准确可
靠的优点 , 可用于万寿菊花中叶黄素及玉米黄素的
含量的测定 。
[作者简介』 李宁 ( 19 79 一 ) , 男 , 助理 工 程师 , 主要从事天然
药物分离纯化 。 联系电话 : ( 0 3 1 1 ) 85 9 2 99 5 。
参 考 文 橄
C O HE N M M
.
Ag
e 一 re l a t e d m a e u l a r d
e g e n e ar l i
o n a n d i 一` Po “ 云b l e
p , v e n t i o n [ J ]
.
M de J 左。 t . 2 0() 5 . I 8 2 ( 6 ) : 3 10 一 3 11
.
Al
」
V ES
一
RO D R IG UES A
.
TH O M AS B
. 仆 e or l e o f lu te 一n i n 一卜e p阳 v . n·
t i. Of 。 rh e~ I
e
o i
s
[ J ]
.
J 乃m C司 C` 山司 ,刀幻2 , 钓 ( 4 ) : 8 35 .
C H E W B p
.
p ^ R K JS
.
C a m t
e n o id a c l i o n o n 一h e 一m m u n e 陀 s po n二
[ J ]
.
J 刀“ t r , 2《洲)4 , 13 4 ( l ) : 2 5 7 一 2 6扭.
V A IN IO H
,
R人U T A L A H T I M A n 一n 一e rn a t i砚, n a l e v a l u a . i o n of 一h e
e a n e e r p er
v e n t i v e p o t e n 一i a l o f e a or t e n o id。 【J」. c’a o r EP 沁. 词
B沁。 a r触。 P ,
, 盆9 9 8 . 7 ( 8 ) : 7 2 5 一 7 2 8
AO A C In t e nr a t i
o n a l
.
A o AC o if o i a l M e 一h od . Of A n a ly s i . 【M 」.
W a
.
h i n gt o n D
.
C
: A s soc i
a 一i o n o f o if e i a l 人n a ly t i e a I C 加亡 m i一.t . I n e .
19 84 : 83 5 一 8 36
.
编辑 : 朱立 / 接受 日期 : 20 5 一 10 一 15